Article de méthode

L’utilisation des splénocytes de souris afin d’évaluer les micro-organismes pathogènes associés un motif moléculaire Influence sur l’Expression génique horloge

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DOI :

10.3791/58022

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24 juillet 2018

1Department of Biology, University of Hartford

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une technique utilisant des splénocytes de souris pour découvrir les modèles moléculaires associés aux pathogènes qui modifient l’expression des gènes horloge moléculaire.

Résumé

De comportement à l’expression des gènes, les rythmes circadiens réglementer presque tous les aspects de la physiologie. Nous présentons ici une méthodologie pour contester les splénocytes de souris avec les profils moléculaires associés aux pathogènes (PAMPs) lipopolysaccharide (LPS), ODN1826 et tués par la chaleur de Listeria monocytogenes et examiner leur effet sur le moléculaire circadienne horloge. Auparavant, les études ont porté sur l’examen de l’influence des LPS sur l’horloge moléculaire en utilisant une variété d’approches in vivo et ex vivo parmi un assortiment de modèles (p. ex., souris, rat et homme). Ce protocole décrit l’isolement et le défi de splénocytes, ainsi que la méthodologie pour évaluer l’horloge gene expression défi post par PCR quantitative. Cette approche peut être utilisée pour évaluer non seulement l’influence des composantes microbiennes sur l’horloge moléculaire mais aussi bien des autres molécules qui peut-être modifier l’expression de l’horloge. Cette approche pourrait être utilisée pour distinguer le mécanisme moléculaire de l’interaction de PAMP-Toll-like receptor influence qu’expression de l’horloge.

Introduction

L’horloge maître chez les mammifères, qui orchestre les oscillations de 24h pour presque tous les aspects de la physiologie et le comportement, est situé dans le noyau suprachiasmatic (SCN) de l’hypothalamus1,2. En plus de réglementer les processus biologiques au niveau organismique, l’horloge maître synchronise également les périphériques horloges cellulaires dans tout le corps3,4,5. Alors que le mécanisme de l’horloge moléculaire est constitué d’au moins trois boucles de rétroaction transcriptionnel traductionnel imbriquées, le noyau est composé de la période (PAR1-3), les cryptochromes (Cry1-2), les Bmal1, et horloge gènes6,7. Outre le maintien du moment précis de l’horloge moléculaire de base, certains produits de gène horloge auxiliaires (p. ex., Rev-erbα et Dbp) aussi régulent l’expression de gènes non-horloge, horloge soit contrôlé gènes (NGCC)6 , 7.

Les horloges moléculaires fonctionnels ont été décrites dans les différents tissus immunitaires (p. ex., la rate et des ganglions lymphatiques)8 et cellules (par exemple, B cellules, cellules dendritiques, macrophages)8,9. Ces cellules détecter et réagir aux micro-organismes pathogènes associés profils moléculaires (PAMPs), composants microbiens conservées, via des récepteurs de reconnaissance immunitaire innée comme les récepteurs Toll-like (TLRs)10. A ce jour, 13 TLR fonctionnelles ont été décrits, qui reconnaissent les constituants microbiens tels que les composants de la paroi cellulaire bactérienne, flagellaire protéines et acides nucléiques microbienne10. Le PAMP, lipopolysaccharide (LPS), un composant de la paroi cellulaire des bactéries à Gram négatif reconnu par TLR4, s’est avéré altérer les rythmes circadiens aux niveaux moléculaires et organismiques. Par exemple, en vivo défi de LPS induit par les retards de phase de type photique telle que mesurée par l’activité souris11 et conduit à horloge réduit l’expression des gènes dans le SCN et le foie, tel que déterminé par hybridation in situ et PCR quantitative, respectivement, chez les rats12. Après un défi en vivo avec LPS, analyse de sang périphérique humain leucocytes13 et du tissu adipeux sous-cutané14 ont révélé une expression altérée de plusieurs gènes de l’horloge tel que mesuré par l’intermédiaire de qPCR. Enfin, ex vivo défis LPS des macrophages humains et macrophages péritonéaux de souris, a également conduits à altération de l’expression de l’horloge tel que mesuré par qPCR14.

Nous décrivons ici un protocole pour évaluer l’influence du LPS PAMPs, ODN1826 (oligonucléotides synthétiques contenant unmethylated motifs CpG) et tués par la chaleur Listeria monocytogenes (HKLM), reconnu par le TLR4 et TLR9 TLR2, respectivement, sur expression du gène horloge moléculaire en splénocytes de souris. Le protocole inclut une splénectomie souris, isolement de splénocytes et défi, RNA extraction, synthèse de cDNA et qPCR afin d’évaluer l’expression de plusieurs gènes de l’horloge. Ce protocole permet l’acquisition rapide d’un grand nombre de cellules immunitaires avec très peu d’animaux ou manipulation cellulaire, qui peut ensuite être contestée ex vivo avec PAMPs différents. L’horloge moléculaire a été montré pour moduler les divers aspects de la réponse immunitaire8,15,16, donc, dérèglement de l’horloge moléculaire nuirait très probablement la bonne variation dépendant du temps de la réponse immunitaire. En outre, étant donné que les perturbations des rythmes circadiens peuvent conduire à des pathologies graves17,18,19,20, il peut être d’intérêt pour les chercheurs de contester les splénocytes avec un large éventail de molécules et d’évaluer leur influence sur l’horloge.

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Protocole

Au cours de l’étude, traitement et soins des animaux conformé politique National Institutes of Health, étaient conformes aux lignes directrices et ont été approuvés par la Commission Université de Hartford Animal animalier institutionnel et utilisation.

1. entraînement d’animaux

Remarque : La souris de vingt semaines mâle B6129SF2/J sont utilisés dans l’étude.

  1. Monter la souris pour un 12 h de lumière (lumière standard de généraux blanche) / cycle de 12 h d’obscurité pendant 2 semaines avant l’expérience.
    NOTE : Temps zeitgeber (ZT) 0 correspond ici au feux et ZT12 aux lumières, tout en conservant tous les autres facteurs environnementaux (p. ex., aliments, eau et température ambiante) constant 21.

2. préparation des Instruments, milieu de Culture et de Medium Challenge

  1. Autoclave pinces et ciseaux de dissection. Envelopper les paires de lames de microscope givré en papier d’aluminium et autoclave.
  2. Préparer, milieu de culture en ajoutant sérum fœtal (SVF) RPMI 1640 à une concentration finale de 10 %. Préparer 10 mL de milieu de défi en tubes de 50 mL en ajoutant les PAMPs suivants au milieu de culture (RPMI avec 10 % FBS) ; LPS (5 µg/mL), ODN1826 (5 µg/mL), Listeria monocytogenes tués par la chaleur (108 HKLM/mL), ou un autre PAMP dans sa concentration suggérée.
  3. Chauffer le milieu de culture et de medium de défi à 37 ° C dans un bain d’eau et laissez environ 70 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,2) à température ambiante.
  4. Ajouter 10 mL de milieu de culture à l’aide d’une pipette 10 mL et l’aide de la pipette à un endroit et un tube de 50 mL sur la glace.
  5. Ajouter 30 mL d’éthanol à 70 % pour un 100 mL bécher et lieu extrémités des ciseaux et pinces de dissection dans le bécher pour éviter la contamination microbienne.
  6. Préparer, tampon de lyse pour l’ARN en ajoutant 10 µL de β-mercaptoéthanol (sous une hotte aspirante) à chaque 1 mL de tampon RLT dans un tube de 50 mL. Assurez-vous que le montant qui sera nécessaire (600 µL par exemple, qui se compose d’environ 1 x 106 cellules).
    Remarque : Le tampon RLT est une composante de la kit d’extraction d’ARN qui prend en charge la liaison de l’ARN à la membrane de la silice.

3. splénocytes isolement et défi

  1. Euthanasier souris à un moment particulier zeitgeber via narcose de conserver dans leur cage originale et l’ajout de CO2 à la cage à un débit de 3 L/min. continuer à approvisionner le CO2 pendant 1 min après l’arrêt de la respiration.
  2. Confirmer la mort par dislocation cervicale en plaçant le pouce et l’index de chaque côté du cou à la base du crâne. Sinon, appuyez sur une tige à la base du crâne tout en tirant rapidement (à l’aide de l’autre main) la base de la queue ou les membres postérieurs provoque la séparation de la vertèbre cervicale le crâne22.
  3. Pulvériser le tronc de la souris avec l’éthanol à 70 % et essuyer avec une serviette en papier. Placez votre souris sur son dos et légèrement inclinée sur le côté droit. Couper la fourrure, à l’aide de dissection ciseaux, le long du côté gauche de la souris, sujet à mi-chemin entre l’avant et l’arrière des jambes.
  4. À l’aide de pinces, prenez le péritoine et faites une incision pour éviter d’endommager la rate. Enlever la rate avec une pince et la placer dans un tube stérile de 50 mL contenant environ 10 mL de milieu de culture sur la glace. Répétez pour les animaux restants.
    Remarque : La rate est la couleur d’un haricot, et il est plus long et plus plat que le rein.
  5. Transférer une rate avec 2 mL de milieu de culture dans une petite boîte de Petri stérile.
    1. Homogénéiser la rate en broyant il entre la partie givrée de deux diapositives givrés stériles. Si possible, conservez les question et les cellules dans le milieu pendant le processus d’homogénéisation.
    2. Une fois soigneusement homogénéisé, pipette le 2 mL de milieu de culture contenant les splénocytes à travers un tamis de cellule 40 µm en nylon dans un tube de 50 mL.
    3. Répétez les étapes ci-dessus pour la rate restante à l’aide de nouvelles paires de glissières givrés, tubes de 50 mL avec milieu de culture et des crépines de la cellule.
  6. Ajoutez 8 mL de milieu de culture froide à chacun des tubes de 50 mL contenant les splénocytes pour un volume total de 10 mL/tube. Déterminer le nombre de cellules par millilitre utilisant un hémocytomètre.
  7. Ajouter environ 1 x 106 cellules/puits aux plaques 6 puits culture. Ajouter des cellules au nombre de puits qui correspondent au nombre de PAMPs différents utilisés pour l’expérience et inclure un contrôle bien. Ajouter 3 mL de milieu de culture ou 3 mL de milieu de défi aux puits respectifs.
  8. Incuber les plaques à 37 ° C à 5 % de CO2 pendant 3 h.
  9. Grattez les cellules du fond du bien en utilisant un embout 1 000 µL attaché à une micropipette P1000. Transférer le support contenant les cellules à l’aide de la même pointe de pipette 1 000 µL dans un tube de 15 mL.
  10. Pellet les cellules par centrifugation à 167 x g pendant 5 min à température ambiante. Retirez le surnageant et le culot cellulaire avec 5 mL de PBS de lavage.
  11. Les cellules de granule une seconde fois à 167 x g pendant 5 min, retirez le surnageant et ajouter 600 µL de tampon de lyse au culot cellulaire pour lyser les cellules. Passez à l’ARN.

4. les ARN et la synthèse de cDNA

  1. Isoler l’ARN de splénocytes en utilisant le kit d’extraction d’ARN conformément aux instructions du fabricant et d’effectuer la digestion de l’ADN sur colonne « facultative ».
  2. Avant la synthèse de cDNA, déterminer la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre microvolume pour vérifier que la concentration est dans la fourchette optimale de RNA (jusqu'à 2 µg) de la trousse de la synthèse de cDNA.
  3. Synthétisent cDNA pour chacun des échantillons en utilisant le kit de transcription inverse selon les instructions du fabricant. Utiliser 10 µL d’ARN pour chacun des échantillons dans un volume de réaction totale de 20 µL. À la fin de la transcription inverse (thermocycleur exécuter) ajouter 20 μL H2O à chaque réaction.
  4. Construire la courbe standard à l’aide d’une micropipette P10 ou P20 pour mettre en commun les ARNm de quelques échantillons de contrôle (par exemple, 5 µL de 2 échantillons pour un total de 10 µL) dans un tube de 0,5 mL pour préparer l’ADNc.
    1. Ajouter 10 µL 2 x mélange principal de la transcriptase inverse.
    2. À la fin de la transcriptase inverse, ajouter 10 µL d’H2O dans le tube de réaction, qui servira à la concentration initiale (« 1 ») dans la série de dilution pour la courbe d’étalonnage.
    3. Exécuter une série de dilution de 10 fois (de 1 à 10-4) en ajoutant 45 µL d’eau à l’aide d’une micropipette P100 ou P200 dans quatre tubes de 0,5 mL désignés 10-1, 10-2, 10-3et 10-4.
      1. Ajouter 5 µL de la concentration initiale « 1 » dans le premier tube (10-1) à l’aide d’une micropipette P20, mélange de pipetage de haut en bas plusieurs fois, puis transférer 5 µL du tube dans le tube de 10-1 désigné 10-2 et mélanger.
      2. Transférer 5 µL à l’aide d’une micropipette P20 du tube 10-2 dans le tube désigné 10-3 et mélanger. Transférer 5 µL à l’aide d’une micropipette P20 du tube de 10-3 dans le tube désigné 10-4 et mélanger.

5. quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)

  1. Déterminer une quantification relative de l’ARNm par qPCR. Au sein de l’expérimental mis en place, sélectionnez « Analyse quantitative – Relative courbe Standard » et « TaqMan » chimie. Changer le volume réactionnel à 10 µL. Entrez les informations pertinentes dans le schéma (par exemple, gène cible, courbe d’étalonnage, journaliste, etc.).
  2. Préparer la réaction afin qu’il contienne 0,5 µL d’obtenir un apprêt/sonde, 5 µL du mélange principal de gene expression, 2 µL de H2O et 2,5 µL d’ADNc (10 – 100 ng).
    1. Préparer un mélange maître en multipliant chacune des réactifs précédents (sauf l’ACEQ) par le nombre de réactions, en veillant à inclure ceux de la courbe d’étalonnage, les témoins négatifs, effectuant chaque réaction en deux exemplaires et 2 réactions supplémentaires qui représenteront variation de pipetage.
    2. Pipette 7,5 µL du mélange maître préparé dans les puits prédéterminés dans une plaque de 96 puits réaction avec une micropipette ou une pipette multicanaux. Pipette 2,5 µL de l’ADNc dans le puits correspondant pour les inconnues et les normes et 2,5 µL d’H2O dans les puits de contrôle négatif.
    3. Inclure des essais de primer/sonde de différents gènes de l’horloge moléculaire et comprennent également un test pour un contrôle endogène (par exemple, le β-actine).
  3. Afin de déterminer les valeurs de l’expression relative, calculer la quantité relative moyenne pour chaque répétition, puis, pour chaque échantillon, divisez la quantité relative moyenne pour le gène ciblé par la quantité relative moyenne de β-actine.

6. analyse statistique

  1. À l’aide du logiciel d’analyse statistique, entrer des données dans le programme de l’option de statistiques de colonne. Sélectionnez une ANOVA à avec le test post-hoc de le Dunnett afin d’évaluer les différences entre les valeurs moyennes de l’expression génique horloge après provocation PAMP versus le contrôle.

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Résultats

Souris ont été sacrifiées à ZT13, splénocytes ont été isolés et contesté ex vivo avec le LPS PAMPs, ODN1826 ou HKLM. Après 3 h, l’ARN a été isolé et qPCR a été utilisé pour évaluer les niveaux de l’expression relative des gènes moléculaires horloge Clock, Per2, Dbp et Rev-erbα par rapport aux cellules témoins non contestée. Après une provocation PAMP, niveaux d’expression horloge n’étaient pas sensiblement différentes de celle expressi...

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Discussion

Dans ce protocole, un spectrophotomètre microvolume permet de quantifier et d’évaluer la pureté de l’ARN étant utilisé dans la détermination de l’expression des gènes. Acides nucléiques absorber les ultraviolets à 260 nm, en général, les protéines absorbent la lumière à 280 nm, tandis que d’autres contaminants potentiels utilisés pendant le processus d’extraction RNA (p. ex., phénol) sont détectables à 230 nm. Par conséquent, en évaluant l’absorbance (A) ratio 260/280 nm (ARN de protéine) et 260/230 nm (ARN à de...

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Déclarations de divulgation

L’auteur n’a rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche de la faculté du Bureau du Collège des Arts et Sciences Dean à l’Université de Hartford.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lames givréesFisher12-550-343
Passoires cellulairesFisher22363547
Lipopolysaccharide  ;InvivoGenltrl-eklps
ODN1826InvivoGenTlrl-1826-1
HKLMInvivoGenTlrl-hklm
RPMI 1640Gibco11875-093
PBSGibco20012-043
RNeasy Mini KitQiagen74104 ou 74106
RNase-Free DNase SetQiagen79254
Plaque de culture cellulaire à 6 puitsDenvilleT1006
Tubes de 50 mLCorning352070
Tubes de 15 mLCorning352097
Kit de transcription inverse de l’ADNc haute capacitéThermoFisher4368814
TaqMan Tests d’expression génique b-actineThermoFisherMm00607939_s1
Dosages d’expression génique TaqMan Per2ThermoFisherMm00478113_m1
Dosages d’expression génique TaqMan Rev-erbaThermoFisherMm00520708_m1
Dosages d’expression génique TaqMan Bmal1ThermoFisherMm00500226_m1
Dosages d’expression génique TaqMan DbpThermoFisherMm00497539_m1
appareil qPCR StepOnePlusThermoFisher
TaqMan Gene Expression Master MixThermoFisher4369016
MicroAmp Plaque réactionnelle rapide à 96 puits (0,1 mL)ThermoFisher4346907
Logiciel d’analyse statistiquePrism 7.0a

Références

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Mots-clés

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