Nous présentons ici un protocole pour injecter autologues muscle-dérivées des cellules souches dans la proximité du nerf laryngé récurrent à l’aide d’un stimulateur électrique des nerfs. Cette nouvelle technique peut devenir utile pour le traitement de la neuropathie laryngée récidivante équine.
Article de méthode
Injection guidée par stimulateur de nerf de cellules souches autologues près du nerf laryngé récurrent gauche équin
Dans cet article
Résumé
Résumé
La neuropathie laryngée récurrente (RLN) communément affecte les chevaux et se caractérise par des anomalies respiratoire sons exercice l’intolérance et. Le nerf laryngé récurrent montre des lésions de démyélinisation. Le bénéfice de l’application des cellules souches aux nerfs démyélinisés a été démontré dans divers modèles animaux. L’étude visait à tester la faisabilité et la sécurité d’une injection peri-neuronale du autologue muscle-dérivées cellules souches mésenchymateuses pour le nerf laryngé récurrent gauche chez le cheval en bonne santé à l’aide d’un stimulateur électrique des nerfs.
Cellule de muscle-dérivées des tiges sont obtenus à partir de cinq chevaux de race Standardbred en santé par l’échantillonnage de 20 mg de tissu musculaire avec une aiguille de biopsie semi-automatique 14 G de muscle triceps. Les mouvements du larynx sont surveillés via haut-voies aériennes vidéo endoscopie. Le nerf laryngé récurrent gauche est abordé avec une aiguille isolée tronculaires. La stimulation nerveuse est appliquée, à partir de 2 mA et l’enlèvement avec succès de la gauche cartilage est surveillé. L’intensité de la stimulation est réduite progressivement. Quand on observe une perte de la réponse motrice à 0,5 mA, 107 autologue muscle-dérivées souches sont injectées des cellules. Deux examinateurs, qui sont aveuglés au point de temps, marquer la fonction laryngée des chevaux avant le traitement et au jour 1, jour 7 et 28 jours après l’injection des cellules. Dans un sixième cheval, 1 mL de lidocaïne 2 % est injecté pour confirmer le bon positionnement de l’aiguille. Cela conduit à une paralysie temporaire du cartilage cartilage gauche.
Cette étude prouve que le nerf laryngé récurrent peut être abordé avec l’aide d’un stimulateur électrique des nerfs et que la stimulation électrique du nerf est bien toléré par les chevaux. Aucune modification de la fonction laryngée a été observée dans aucun des chevaux après l’injection des cellules souches. Supplémentaires doivent être menées pour décrire les effets d’une injection peri-neuronale du autologue muscle-dérivées cellules souches mésenchymateuses aux chevaux souffrant de RLN.
Introduction
NKE est une pathologie fréquente des voies respiratoires supérieures chez les chevaux caractérisés par différents degrés de paralysie de cartilage. Le côté gauche du larynx est plus souvent affecté. La prévalence de la maladie peut atteindre jusqu'à 35 % dans certaines populations de chevaux. Bien que plusieurs hypothèses tenté d’expliquer l’étiologie et la pathogenèse de cette maladie, la cause exacte de RLN demeure incertaine. La pathologie est décrite comme une axonopathie distale du nerf laryngé récurrent avec des lésions de démyélinisation mais aussi une certaine remyélinisation. Cette axonopathie mène à la dénervation des muscles laryngés intrinsèques et atrophie concomitante1,2. Cette pathologie est souvent lentement progressive et peut conduire à une perte totale de l’enlèvement de cartilage du côté affecté3.
Des chevaux touchés émettent des bruits respiratoires anormaux au cours de l’exercice et montrent parfois, intolérance à l’exercice dans les cas plus graves. Le diagnostic est fait par l’examen endoscopique sur un cheval debout non sédatifs où on observe une perte partielle ou totale du larynx enlèvement1,2,4. Actuellement, le traitement le plus courant est laryngoplasty (également connu sous le nom « tie-back »), qui est parfois associée à une dérivation ventriculo-cordectomy. Bien que le taux de réussite global de ces chirurgies est considérée comme bon à excellente5, complications postopératoires sont très fréquents. La complication la plus fréquente est une perte progressive de l’enlèvement. Barnett et al. 6 a enregistré une perte d’au moins un grade d’enlèvement dans les six premières semaines suivant la chirurgie chez au moins 76 % des chevaux. Autres complications, telles que la rupture de la prothèse, la toux et la contamination des voies aériennes, sont également signalés5.
Cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été une partie de la médecine équine dans la recherche et la pratique depuis plus de dix ans, bien que les études sur leur efficacité sont encore rares. Les deux plus couramment exploitées sources de cellules souches mésenchymateuses adultes chez les chevaux sont la moelle osseuse et le tissu adipeux7. Les deux techniques d’échantillonnage sont relativement invasifs et ne conduisent pas toujours à un nombre suffisant de cellules. Récemment, Ceusters et al. 7 décrit la culture de cellules souches provenant de tissus de muscle strié, qui sont obtenu par une technique moins invasive de microbiopsy.
MSCs sont capables d’auto-renouvellement, autoproduction, multipotentialité et différenciation7,8. Leur capacité à se différencier en toutes les lignées de mésoderme de graisse, OS, muscle et cartilage est maintenant bien établi9. Toutefois, dans des conditions environnementales spécifiques, elles peuvent se différencier en lignées non-mésenchymateuse comme les neurones, les astrocytes et les cellules myélinisantes du système nerveux périphérique et la moelle épinière9,10. MSCs ont déjà été utilisés dans plusieurs neuropathie modèles10,11. Leur capacité à migrer vers des zones du tissu nerveux dégénéré et de régénérer les cellules nerveuses a été démontrée après une administration systémique et locale11. En outre, les cellules de Schwann-comme dérivés de MSCs peuvent recruter des macrophages pour supprimer les débris cellulaires et sécrètent des facteurs neurotrophiques favorisant la croissance axonale et remyélinisation9.
Le but de cette étude est de décrire la technique d’une injection de guidée par stimulateur de nerf du muscle-dérivées des cellules souches autologues près du nerf laryngé récurrent gauche chez le cheval en bonne santé. En règle générale, un stimulateur de nerf relié à une aiguille d’injection est utilisé pour l’electro-localisation des nerfs périphériques afin d’appliquer des anesthésiques locaux à cette zone12. Une impulsion de courant faible est fournie à proximité du nerf pour induire une réponse motrice. La capacité de produire cette réponse motrice dépend de plusieurs paramètres, tels que la zone conductrice de l’aiguille, une impédance quelconque du tissu, le courant appliqué, la durée de l’impulsion et la distance entre l’aiguille et le nerf. Aiguilles de stimulateur de nerf sont conçus pour avoir une zone conductrice très restrictive à la pointe de l’aiguille, alors que le reste de l’aiguille est isolé. Cette conception permet de localiser avec précision le nerf. Neurostimulateurs moderne s’adaptent à différentes impédances de tissus et de livrer l’ampérage constant sur la machine. Par ailleurs, la plupart des machines utilisent une durée d’impulsion de 0,1 s, afin que les paramètres déterminants sont le courant appliqué et la distance à l’aiguille. La relation entre la distance de l’aiguille-à-nerf et le courant nécessaire pour produire une réponse motrice est décrite par la Loi de Coulomb : E = kQ/r ; où E est la charge de stimulation nécessaire, k est la constante de Coulomb, Q est la charge minimale requise stimulation et r est la distance entre les deux électrodes. Dans l’électro-localisation des nerfs, la distance entre les deux électrodes est réputée être la distance de l’aiguille-à-nerf12. Charge électrique se dissipe après la règle du carré inverse de la distance de l’aiguille-à-nerf13. Pratique clinique a montré que le moteur nerve stimulation à 0,5 mA est fortement corrélée au bloc nerf réussi et qu’une perte de signal moteur en cas de courant inférieures empêche l’utilisateur d’administrer des injections intraneuronal accidentelles. Le but de cette étude est de tester la faisabilité et l’innocuité de cette technique dans un nombre limité de chevaux. Si la faisabilité et l’innocuité de cette technique sont confirmées, il peut être facilement transférée aux chevaux touchés. En outre, équins RLN peut servir de modèle pour une neuropathie dégénérative.
Protocole
La commission pour l’utilisation d’animaux de l’Université de Liège a approuvé le protocole d’étude.
1. muscle Microbiopsy
- Repérer le site de l’échantillon par examen visuel et palpation, dans le chef long du muscle triceps, environ ligne médiane entre la pointe du coude et la pointe de l’épaule.
- Clip d’une zone d’environ 2 x 2 cm2 avec une tondeuse électrique. Appliquer le chirurgien composée de savon liquide poly-iodure et alcool compresse pendant 1 min sur la zone rasée. Injecter par voie sous-cutanée de 1 mL de solution de lidocaïne 2 % avec une aiguille 25 G dans le centre de la zone rasée et désinfecté.
- Frotter les mains avec du savon antibactérien pour les mains. Mettez des gants stériles. Utilisez un drap stérile jetable comme une surface stérile pour placer l’aiguille de biopsie et le trocart sur.
- Bras de l’aiguille de biopsie semi-automatique 14 G en tirant sur le mécanisme à ressort comme indiqué dans les Figures 1 b et 1C. Communiqué de l’aiguille de biopsie pour vous familiariser avec son mécanisme. Placer l’aiguille de biopsie armés sur la surface stérile. Se familiariser avec le trocart, qui se compose d’une canule et d’un obturateur, comme illustré dans la Figure 1a.
Figure 1 : Le jeu de l’aiguille de biopsie. L’ensemble de l’aiguille de biopsie compose de (a) la canule et son obturateur et la biopsie à l’aiguille (de haut en bas). Les autres panneaux montrent l’aiguille de biopsie dans son (b) neutre et (c) sa position. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
- Préparer le trocart en assemblant la canule et l’obturateur et le conserver en position verrouillée. Introduire le trocart perpendiculairement à la peau à travers la zone anciennement désensibilisée. Faire progresser le trocart à un poste où la pointe du trocart est d’environ 1,5 cm profondément dans le muscle. Retirez le trocart, dissocier la canule de son obturateur et placer l’obturateur sur la surface stérile.
- Introduire l’aiguille de biopsie armés par la canule. Introduire l’aiguille et la canule dans l’incision cutanée dans le muscle. Avancer l’aiguille à un poste où la pointe de l’aiguille est au milieu du chef long du muscle triceps.
- Libérer l’aiguille de biopsie et retirer l’aiguille de biopsie ainsi que de la canule. Tirez l’aiguille de biopsie de la canule. Laisser la canule sur la surface stérile.
- Ouvrez l’aiguille de biopsie en tirant le ressort d’une main et tenant à l’autre.
Remarque : L’échantillon devient visible à l’extrémité de l’aiguille de biopsie. - Avec l’aide d’une autre personne, ouvrez le tube à essais contenant le milieu de l’échantillon. Utiliser une aiguille hypodermique de 19 G enlever le morceau de muscle minuscule de l’aiguille de biopsie. Placer l’échantillon de muscle dans le milieu d’échantillonnage. Fermer le tube avec le bouchon à vis et inclinez-le légèrement x 2 pour s’assurer que l’échantillon est flottant dans le milieu.
- Bras de l’aiguille de biopsie. Prenez la canule de la surface stérile et remonter l’aiguille de biopsie armés et la canule. Introduire l’aiguille armé et la canule dans l’incision cutanée comme décrite précédemment. Répéter la procédure de l’exemple 2 – 3 x jusqu'à environ 20 mg de tissu musculaire est échantillonné. Fermer le tube d’échantillonnage. Tourner doucement le tube 2 x pour mélanger les morceaux de muscle avec la moyenne d’échantillonnage.
- Expédier les échantillons au laboratoire à une température constante comprise entre 4 et 8 ° C.
Remarque : Le laboratoire traitera ensuite l’échantillon. Le protocole peut être suspendu ici. - La procédure est bien tolérée et douleur sur le côté d’échantillonnage n’est pas respectée. Dans l’éventualité de douleurs musculaires observées au site de prélèvement, administrer un traitement antalgique approprié.
2. le traitement des cellules
Remarque : Les cellules souches utilisées dans cette étude ont été préparés selon la méthode décrite par Ceusters et al. 7. leur article décrit également la caractérisation des cellules.
- Commencez par préparer le milieu de culture spécifique, DF20, en ajoutant 20 % de la chaleur-inactivé sérum de veau fœtal, 5 mL de pénicilline (1 000 UI/mL)-streptomycine (10 000 µg/mL) et 2,5 mL d’amphotéricine B (250 µg/mL) pour une bouteille de 500 mL d’un disponible dans le commerce milieu de culture avec la glutamine et de rouge de phénol.
- Verser 150 µL de milieu de culture DF20 dans chacun des 16 puits intérieurs d’un plat de 24 puits multi. Verser 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) [chlorure de potassium (200 mg/L), monophasique de phosphate de potassium (200 mg/L), chlorure de sodium (8 000 mg/L) et phosphate de potassium diphasique (2 160 mg/L)] dans les autres cupules externes.
- Rincer le muscle minuscule pièces x 2 dans du PBS. Séparez-les en très petits morceaux à l’aide d’un scalpel et une pince et placez un petit morceau (de la taille de la pointe de la lame de bistouri) dans chaque intérieur-16 bien du plat multipuit.
- Placer la capsule multipuite dans un incubateur maintenu aux conditions suivantes : 37 ° C, 21 % O2et 5 % de CO2. Surveiller les puits de tous les jours sous un microscope inversé et ajouter 50 µL de DF20 si nécessaire pour empêcher les cellules ne se dessèchent pas.
Remarque : Après environ 10 jours, il y aura suffisamment de cellules issues de l’explant pour permettre l’isolement des cellules souches. Le protocole peut être suspendu ici. - Quand un halo de cellules est visible autour du muscle des explants, jetez l’explant du tissu musculaire. Détacher les cellules à l’aide de 150 µL d’une solution de trypsine contenant de l’EDTA dans chaque puits : jeter le milieu de culture, rincer les cellules avec 1 mL de PBS, jetez le PBS et ajouter la solution de trypsine pour un maximum de 10 min à 37 ° C. Ajouter le milieu de culture pour arrêter l’action de la trypsine, récolter la suspension cellulaire et, ensuite, centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant 10 min à 37 ° C. Jeter le surnageant et le culot de suspendre dans une solution saline équilibrée.
- Transférer la suspension cellulaire sur un gradient de densité discontinu de 3 couches (15 %, 25 % et 35 %). Centrifuger le tube contenant la suspension cellulaire et la solution de gradient de densité discontinu à 1 250 x g pendant 20 min à 25 ° C. N’utilisez pas le frein de la centrifugeuse. Observer les fractions cellulaires avec des densités différentes qui apparaîtront entre les différentes couches de la solution de gradient de densité discontinu après la centrifugation.
- Continuer la culture avec la fraction entre 15 et 25 %. Transférer à un tube et le laver avec la solution saline équilibrée. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant 10 min à 37 ° C. Jeter le surnageant. Procéder à la suspension du culot dans 1 mL de DF20. Préremplir un flacon de culture cellulaire, avec une surface de 25 cm2, avec 6 mL de DF20. Transférer les cellules dans le flacon de culture cellulaire préremplie et leur culture dans un incubateur avec les conditions suivantes : 37° C, 21 % O2et 5 % de CO2.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. - Surveiller les cellules chaque jour sous un microscope inversé. Changer le milieu de culture si nécessaire (jeter le vieux milieu et ajouter 6 mL de milieu de culture nouvelle). Déterminer la confluence cellulaire en observant les couches de cellules dans les plats de la culture, à l’aide d’un microscope optique avec un grossissement prédéfini. Estimer la surface du plat qui est occupée par les cellules. Travailler à un grossissement microscopique fixe pour chaque observation pouvoir évaluer la confluence. Lorsque les cellules occupent 85 % de la surface du plat, procéder à un passage des cellules.
- Lorsque les cellules sont confluentes, détacher à l’aide d’une solution de trypsine contenant de l’EDTA avec le même protocole tel que décrit à l’étape 2.4. Puis, centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant 10 min à 37 ° C. Jeter le surnageant et procéder à la remise en suspension des cellules dans 5 mL de DF20. Placez-les dans un flacon de culture cellulaire de 175 cm2 remplie au préalable avec 25 mL de DF20. Placer la fiole dans un incubateur avec les conditions suivantes : 37° C, 21 % O2et 5 % de CO2.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. - Surveiller les cellules chaque jour sous un microscope inversé. Changer le support si nécessaire (jeter le vieux milieu et ajouter 30 mL de nouveau média). Lorsque les cellules sont confluentes, détacher à l’aide de la trypsine-EDTA comme indiqué au point 2.4. Puis, centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant 10 min à 37 ° C. Jeter le surnageant et suspendre les cellules dans 6 mL de DF20. Placez 1 mL de la suspension cellulaire dans six 175 cm2 fioles, chacune remplie au préalable avec 25 mL de DF20 et leur culture à 37 ° C dans un incubateur à CO2 (avec 21 % O2 et 5 % de CO2).
- Surveiller les cellules chaque jour sous un microscope inversé. Changer le support si nécessaire (jeter le vieux milieu et ajouter 30 mL de nouveau média dans chaque fiole). Lorsque les cellules sont confluentes, détacher à l’aide de la trypsine-EDTA comme indiqué au point 2.5. Centrifuger les 3 x à 200 x g pendant 10 min à 37 ° C et jeter le surnageant à chaque étape.
- Compter les cellules à l’aide d’un Bürker comptant chambre et un microscope optique. Préparer une suspension cellulaire de 10 millions de cellules/mL d’un milieu spécifique de cryoconservation.
- Les doses thérapeutiques de 1 x 107 cellules dans 1 mL de milieu de cryoconservation de congélation et les entreposer en phase vapeur de l’azote liquide jusqu'à leur utilisation.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. - Expédier les cellules dans le flacon sur la glace sèche pour usage final.
3. injection des cellules
Remarque : Deux personnes sont requises pour effectuer l’injection des cellules souches.
- Réchauffer la suspension cellulaire progressivement à température ambiante. Aspirer la suspension dans une seringue de 2 mL.
- Endormir le cheval en injectant détomidine 10 µg/kg dans la veine jugulaire avec une aiguille hypodermique de 19 G. Attendre 5 min pour constater l’effet complet de la sédation, qui devient visible par la position tête en bas caractéristique du cheval.
- Fixez une zone de 20 x 10 cm2 sur la région laryngée gauche du cheval avec une tondeuse, comme illustré à la Figure 2. Ensuite, appliquez un chirurgien de poly-iodure de savon et d’alcool dans la région d’écrêté.
- Placer un flexible endoscope vidéo standard par la narine gauche du cheval et le faire avancer vers le nasopharynx. Ajustez la position de l’endoscope jusqu'à l’obtention d’une vue complète de cartilages de cartilage et de l’épiglotte. Maintenez l’endoscope dans cette position au cours de la procédure et pour réactiver l’écran de l’endoscope vidéo vers les opérateurs.
- Connecter l’aiguille d’injection/stimulation de l’électrode négative du stimulateur nerf. Maintenir les conditions stériles de l’aiguille. Connecter l’électrode positive de la stimulateur de nerf à un patch de l’électrode, qui est collé à la zone de peau rasée.
- Connecter la seringue contenant la suspension de cellules à la ligne d’injection et pré-remplir le tube afin de chasser l’air du système. N’oubliez pas le volume du système et de préparer une seringue avec le même volume de solution saline stérile.
- Si pas familier avec cette technique, utiliser un transducteur à ultrasons linéaire 5 à 7 MHz désinfectée pour visualiser les structures anatomiques de la région d’intérêt. Une échographie stérile gel de couplage permet d’augmenter la qualité de l’image. Visualiser le larynx et les vaisseaux qui s’exécutent dans la région dorsale du larynx.
- Une fois familiarisé avec l’anatomie de la région, introduire l’aiguille d’injection/stimulation vers l’aspect dorso-latérale du larynx. Lorsque vous approchez l’aspect dorso-latérale du larynx, démarrer le stimulateur de nerf dans le mode de stimulation de 1 Hz avec un courant de 2 mA.
- Doucement bouger l’aiguille vers la position du nerf laryngé récurrent, tout en observant la vue endoscopique à l’écran. Dès que le mouvement d’abduction du cartilage cartilage gauche est visible sur l’écran vidéo, réduire le courant jusqu'à ce que le mouvement disparaît tout en conservant l’aiguille en place.
- Identifier la position idéale de l’aiguille. Envisager une perte de la réponse motrice à 0,5 mA comme la distance idéale entre le nerf. Lorsque les mouvements de cartilage cartilage persistent à courants inférieurs à 0,4 mA, ne pas injecter les cellules, car qui peut entraîner une injection intraneuronal.
- Lorsque la perte de la réponse motrice à 0,5 mA est observée, injecter la suspension cellulaire contenant 107 de cellules souches autologues et rincer la ligne d’injection de la solution saline préparée à l’étape 3.6. Cela va injecter le reste de la suspension cellulaire qui est restée dans le tube d’injection.
- Après l’injection des cellules, retirer l’aiguille et l’endoscope.
- Laisser le cheval à se remettre de la sédation. Aucun traitement supplémentaire n’est nécessaire pour le site de biopsie.
Résultats
La commission pour l’utilisation d’animaux de l’Université de Liège a approuvé le protocole d’étude. Six chevaux du troupeau de chevaux de recherche au Centre de recherche équine Mont-le-Soie ont été inclus dans cette étude. Dans le premier cheval, le nerf laryngé récurrent a été localisé par électrostimulation. La figure 2 illustre le paramètre utilisé, avec l’aiguille de stimulation insérée dans l’aspect dorso-latérale gauche du larynx du cheval dans le stimulateur de nerf. Lorsque la perte de mouvement du cartilage cartilage est observée à 0,5 mA, 1 mL de lidocaïne 2 % est injectée. Il en est résulté une absence de mouvement à des courants plus élevés et une paralysie transitoire de la cartilage gauche. L’endoscopie de contrôle, 24 h plus tard, a révélé un rétablissement complet de la fonction du cartilage. Le protocole complet a été répété avec succès en cinq chevaux. Aucun des chevaux ont montré une réaction négative à le microbiopsy de muscle. Dans tous les chevaux, un nombre suffisant de cellules ont été produite dans le temps. L’endoscopie des voies respiratoires supérieures a été réalisée dans tous les cinq chevaux et les scores de fonction laryngée I ou II.1 selon Robinson et al. 14 ont été déterminées. Tous les chevaux toléré la stimulation nerveuse du nerf laryngé récurrent très bien. Aucun effet indésirable a été observée pendant ou après la stimulation ou l’injection des cellules souches.
Toutes les endoscopies ont été enregistrés et a marqué par deux cliniciens aveugles. Il n’y avait aucune différence entre les scores d’injection préalable des fonctions laryngées et les scores obtenus sur jour 1, 7 et 28 après l’injection de cellules souches, qu’il est testé par Wilcoxon analyse rang15. Le tableau 1 résume les scores laryngés de tous les chevaux à des moments différents, mais aussi le moment de l’insertion de l’aiguille pour l’injection des cellules souches et le courant qui provoque le mouvement de cartilage lorsque les cellules où injecté.
Les cellules qui ont été utilisés dans la présente étude ont été préparés selon un protocole publié précédemment7. Les cellules de toutes les fractions ont pu trilineage la différenciation, exprimé CD90 et CD44, n’a pas exprimé de CD45 et CMH II et avaient des capacités clonogéniques. Les cellules de la fraction de 15 à 25 % ont été choisis pour un traitement ultérieur car ils ont montré la plus grande expression du CD90 et les plus grandes capacités prolifératives.
La présente étude visait ne pas à tester l’efficacité de l’application des cellules souches pour régénérer un nerf périphérique endommagé, mais seulement pour tester la faisabilité de la procédure et pour évaluer l’innocuité de l’injection de cellules souches pour le nerf laryngé récurrent dans un smal numéro général des chevaux en santé. L’absence de toute modification fonctionnelle sur l’imagerie endoscopique dans les cinq chevaux jusqu'à 28 jours après l’injection et une absence de signes cliniques dans quatre des cinq chevaux jusqu'à 1 an après que l’injection confirme la faisabilité et l’innocuité de la procédure. Un cheval avait dû être euthanasiés dans la période de suivi pour des motifs étrangers à l’étude. Bien que les techniques s’avèrent pour être sûr dans un petit nombre de chevaux, le nombre de chevaux inclus dans la présente étude est trop faible pour démontrer l’absence d’événements rares.
| Marquer avant l’injection | Temps d’injection (min) | Courant (mA) de l’injection | Score au jour 1 post injection | Score à la 7e jour post injection | Score à la 28e jour post injection | |
| Cheval 1 (Standardbred, mare, âgé de 16 ans) | II.1 | 12 | 0,5 | J’ai | II.1 | II.1 |
| Cheval 2 (Standardbred, mare, âgé de 22 ans) | J’ai | 3 | 0,7 | J’ai | J’ai | J’ai |
| Cheval 3 (Standardbred, mare, âgé de 11 ans) | II.1 | 4 | 0,5 | II.2 | II.1 | II.1 |
| Cheval 4 (Standardbred, mare, âgé de 12 ans) | J’ai | 7 | 0,5 | J’ai | II.1 | J’ai |
| Cheval 5 (Standardbred, mare, âgé de 10 ans) | J’ai | 3 | 0,7 | II.1 | J’ai |
Tableau 1 : signalisation et laryngée fonction scores des chevaux. Ce tableau indique le temps d’injection, le courant le plus bas, provoquant tout mouvement de cartilage avant l’injection et les scores laryngés de cinq chevaux sains avant et au jour 1, 7 et 28 après l’injection d’autologue muscle-dérivées cellules souches mésenchymateuses dans proximité de nerf laryngé récurrent gauche. Cheval #5 n’était pas disponible pour le contrôle au jour 28 après l’injection pour des raisons non liée à cette étude. Les scores se référer aux résultats décrits par Robinson et al. 14. score ici, je signifie que les mouvements des deux cartilages de cartilage ont été synchrone et symétrique, et un enlèvement complet de ces deux cartilages de cartilage pouvait être obtenu et maintenu. Points II.1 signifie que les mouvements des cartilages cartilage sont asynchrones, ou peuvent être asymétriques à certains moments ; Toutefois, un enlèvement complet de ces deux cartilages de cartilage pouvait être obtenu et maintenu.
Figure 2 : Réglage lors de l’injection des cellules souches. L’aiguille de la stimulation du nerf est présente sur le côté gauche du larynx et dirigé vers le nerf laryngé récurrent gauche. Le stimulateur de nerf est fixé à 0,8 mA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Ce protocole décrit l’application réussie de muscle-dérivées des cellules souches autologues pour les nerfs laryngés récurrents chez les chevaux à l’aide d’une approche guidée par stimulateur de nerf. La récolte de l’échantillon microbiopsy de muscle, ainsi que l’isolement, la culture et caractérisation des cellules souches, ont été décrits en détail avant, tandis que l’injection de ces cellules à proximité d’un nerf périphérique est originale. L’electro-localisation du nerf avec un stimulateur électrique des nerfs a servi pour la présente étude et a été utilisée pour injecter des cellules souches mésenchymateuses à proximité directe du nerf laryngé récurrent. La réponse motrice a été surveillée par vidéo-endoscopie dans le nasopharynx. Si, au cours du processus de positionnement de l’aiguille, autres nerfs sont stimulées, le mouvement correspondant était visible sur l’écran d’endoscopie. Une stimulation efficace du nerf laryngé récurrent a été caractérisée par l’enlèvement typique du cartilage cartilage. Chez un cheval, anesthésique local est injecté pour induire une paralysie transitoire du muscle du cartilage. Bien que l’implantation réussie des cellules à proximité du nerf n’a pas été testée spécifiquement dans la présente étude, l’electro-localisation du nerf et l’injection avec un faible courant a prouvé que les cellules souches ont été appliqués près du nerf. La proximité de l’injection de co-set du nerf est encore démontrée par un bloc moteur réussi induit par l’injection d’un anesthésique local.
Dans les 5 chevaux restants, le temps de la première stimulation jusqu'à ce que l’injection des cellules souches réussie variait de 3 à 12 min. chevaux était légèrement sous sédation au cours de la procédure, qui a augmenté leur conformité avec la stimulation électrique. Aucun des chevaux ont montré des effets indésirables à tout moment, ce qui indique que la durée de la stimulation peut être prolongé si nécessaire pour obtenir la bonne aiguille positionnement. Une courbe d’apprentissage abrupte devrait être observée si l’opérateur utilise cette technique régulièrement et dans un plus grand nombre de chevaux avec divers anatomie.
Les chevaux couramment souffrent de RLN, qui se caractérise par des degrés de paralysie du cartilage gauche cartilage conduisant à des bruits respiratoires anormaux et exercent l’intolérance. Une histologie de nerfs touchés révèle des lésions typiques d’une neuropathie périphérique16. La neuropathie périphérique est un terme utilisé pour décrire les différents types de lésions nerveuses périphériques conduisant à une altération des sensations, mouvements ou fonctions de l’organe. Les causes sont très variables et peuvent comprendre le diabète, carences nutritionnelles, un traitement par des médicaments spécifiques, un traumatisme, une ischémie ou une infection, ou ils peuvent être idiopathiques. Indépendamment de la cause, les neuropathies périphériques partagent des signes histopathologiques communs, comme la dégénérescence wallérienne, axonopathie distale ou démyélinisation segmentaire. Il a été démontré que l’administration des cellules souches mésenchymateuses de lésions nerveuses périphériques peut être bénéfique pour leur régénération ; Cependant, les mécanismes sous-jacents ne sont pas bien compris. Traditionnellement, nous pensons que les cellules souches mésenchymateuses sera seulement se différencient en progéniteurs des tissus adipeux, muscle, cartilage et le tissu osseux, mais sous certaines conditions, elles ont été montrées à se différencier en myocytes17, astrocytes18 et les cellules myélinisantes du périphérique19 et du système nerveux central,19. Au cours d’une culture in vitro , une exposition à des neuropeptides favorisera la différenciation des cellules souches mésenchymateuses en cellules expriment des marqueurs neuronaux21,22. Plusieurs des études in vivo ont démontré l’effet bénéfique des cellules souches mésenchymateuses sur la régénération des nerfs et une récupération fonctionnelle dans des modèles de rat de nerf sciatique blessure10,23. Ceci est probablement causé par des conditions environnementales favorables qui contribuent à la différenciation des cellules souches en cellules de tissu-spécifique24. Les études futures devraient étudier aussi cette technique pour l’administration de cellules pré différenciées en chevaux touchés RLN.
Au meilleur de notre connaissance, c’est le premier rapport qui décrit l’utilisation d’un stimulateur de nerf pour localiser un nerf périphérique afin d’injecter un traitement spécifique en elle. Autres pathologies des nerfs périphériques chez diverses espèces, comme la douleur neuropathique, peuvent être traitées par l’administration des cellules souches à proximité du nerf25,26. Les études futures devraient vérifier l’effet de cette technique chez les patients de cliniques et enquêter sur le risque de migration et le potentiel de différenciation des cellules injectées.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
L’étude a été financée par le Centre de recherche équine de Mont-le-Soie.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Détomidine (Domidine) ; | Dechra | vendu en pharmacie | |
| Lidocaine (Xylocaïne) ; | Movianto | vendu en pharmacie | |
| TOF Watch S (Stimulateur nerveux) | Alsevia | 79950161 | |
| TSK Starcut (Aiguille de biopsie) | Laboratoire STSK | SAG - 14090C | |
| Aiguille d’électrostimulation ; | Pajunk | 001185-79 | |
| DMEM - F12 (milieu de culture) | Lonza | LO BE12-719F | |
| Heat inactivated FBS | Life technologies | 10500 | |
| Pénicilline-streptomycine | Lonza | DE17-602E | |
| Amphotéricine B (Fungizone) | Lonza | 17-836E | |
| Saline tamponnée au phospate | Lonza | LO BE17-512F | |
| 24-parabole multipuits | Corning | 3524 | |
| Trypsin | Life technologies | 12604 | |
| HBSS | Lonza | LO BE10-508F | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | 17544502 | |
| NaCl | Sigma | S8776 | |
| T-25 cm² ; flacons | Nunclon | 136196 | |
| T-175 cm² ; flacons | Nunclon | 178883 | |
| Cryostore CS5 | Biolife solutions | 205373 |
Références
- Duncan, I. D., Griffiths, I. R., Madrid, R. E. A light and electron microscopic study of the neuropathy of equine idiopathic laryngeal hemiplegia. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (6), 483-501 (1978).
- Cahill, J. I., Goulden, B. E. Equine laryngeal hemiplegia. IV. Muscle pathology. New Zealand Veterinary Journal. 34 (11), 186-190 (1986).
- Dixon, P. M., et al. Laryngeal paralysis: a study of 375 cases in a mixed-breed population of horses. Equine Veterinary Journal. 33 (5), 452-458 (2001).
- Dixon, P. M., Robinson, E., Wade, J. F. Review of the pathological changes in equine recurrent laryngeal neuropathy. Havemeyer Workshop on Equine Laryngeal Neuropathy. Havemeyer Monograph Series No. 11. , R&W Publications. Newmarket, UK. 9-11 (2003).
- Biasutti, S., Dart, A. J., Jeffcott, L. B. A review of recent developments in the clinical application of prosthetic laryngoplasty for recurrent laryngeal neuropathy: Indications, complications and outcome. Equine Veterinary Education. 29 (6), 337-345 (2016).
- Barnett, T. P., O'Leary, J. M., Parkin, T. D. H., Dixon, P. M., Barakzai, S. Z. Long-Term Maintenance of Arytenoid Cartilage Abduction and Stability During Exercise After Laryngoplasty in 33 Horses. Veterinary Surgery. 42 (3), 291-295 (2013).
- Ceusters, J., et al. From skeletal muscle to stem cells: an innovative and minimally-invasive process for multiple species. Scientific Reports. 7 (1), 696(2017).
- Ding, D. C., Shyu, W. C., Lin, C. Z. Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 20 (1), 5-14 (2011).
- Jiang, L., Jones, S., Jia, X. Stem Cell Transplantation for Peripheral Nerve Regeneration: Current Options and Opportunities. International Journal of Molecular Sciences. 18 (1), 94(2017).
- Tohill, M., Mantovani, C., Wiberg, M., Terenghi, G. Rat bone marrow mesenchymal stem cells express glial markers and stimulate nerve regeneration. Neuroscience Letters. 362 (3), 200-203 (2004).
- Ji, J. F., He, B. P., Dheen, S. T., Tay, S. S. W. Interactions of Chemokines and Chemokine Receptors Mediate the Migration of Mesenchymal Stem Cells to the Impaired Site in the Brain After Hypoglossal Nerve Injury. Stem Cells. 22 (3), 415-427 (2004).
- Urmey, W. F. Using the nerve stimulator for peripheral or plexus nerve blocks. Minerva Anesthesiologica. 72 (6), 467-471 (2006).
- De Andrés, J., Sala-Blanch, X. Peripheral nerve stimulation in the practice of brachial plexus anesthesia: a review. Regional Anesthesia and Pain Medicine. 26 (5), 478(2001).
- Robinson, N. E. Consensus statements on equine recurrent laryngeal neuropathy: conclusions of the Havemeyer Workshop. Equine Veterinary Education. 16 (6), 333-336 (2004).
- The BMJ: Rank Score Tests. , Available from: https://www.bmj.com/about-bmj/resources-readers/publications/statistics-square-one/10-rank-score-tests (2018).
- Hahn, C. N., et al. Histological and ultrastructural evidence that recurrent laryngeal neuropathy is a bilateral mononeuropathy limited to recurrent laryngeal nerves. Equine Veterinary Journal. 40 (7), 666-672 (2008).
- Orlic, D., et al. marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature. 410 (6829), 701-705 (2001).
- Kopen, G. C., Prockop, D. J., Phinney, D. G. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains. Proceedings of the National Academy of Science. 96 (19), 10711-10716 (1999).
- Dezawa, M., Takahashi, I., Esaki, M., Takano, M., Sawada, H. Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone marrow stromal cells. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1771-1776 (2001).
- Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells. Glia. 39 (3), 229-236 (2002).
- Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth. Journal of Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).
- Sanchez-Ramos, J., et al. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Experimental Neurology. 164 (2), 247-256 (2000).
- Farzamfar, S., et al. Sciatic nerve regeneration by transplantation of menstrual blood-derived stem cells. Molecular Biology Reports. 44 (5), 407-412 (2017).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
- Brini, A. T., et al. Therapeutic effect of human adipose-derived stem cells and their secretome in experimental diabetic pain. Scientific Reports. 7 (1), 9904(2017).
- Liu, W., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Stem Cells for Treating Diabetic Neuropathy in Metabolic Syndrome. Biomed Research International. 2017, 8945310(2017).
Réimpressions et autorisations
