High-throughput Identification des séquences régulatrices du gène à l’aide de prochaine génération séquençage du Chromosome circulaire Conformation Capture (4C-seq)

Erin A. Brettmann; Inez Y. Oh; Cristina de Guzman Strong

doi:10.3791/58030

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Article de méthode

High-throughput Identification des séquences régulatrices du gène à l’aide de prochaine génération séquençage du Chromosome circulaire Conformation Capture (4C-seq)

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DOI :

10.3791/58030

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5 octobre 2018

Erin A. Brettmann¹ , Inez Y. Oh¹ , Cristina de Guzman Strong¹

¹Division of Dermatology, Center for Pharmacogenomics, Center for the Study of Itch, Department of Medicine, Washington University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

L’identification des interactions physiques entre les gènes et les éléments de régulation est difficile, mais a été facilitée par les méthodes de capture de conformation du chromosome. Cette modification du protocole 4C-seq atténue la partialité de la PCR en réduisant au minimum l’amplification excessive des modèles PCR et maximise la mappability se lit en y incorporant une étape digest d’enzyme de restriction addition.

Résumé

L’identification des éléments de régulation pour un gène cible donnée constitue un défi technique considérable en raison de la variabilité dans les tailles de positionnement et de l’effet des éléments régulateurs à un gène cible. Certains progrès ont été réalisés avec la prédiction de bioinformatique de l’existence et la fonction de modifications épigénétiques proximales, associée à l’expression des gènes activés à l’aide de sites de fixation de facteurs de transcription conservée. Études de chromatine conformation capture ont révolutionné notre capacité à découvrir des contacts physiques chromatine entre les séquences et même au sein d’un génome entier. Capture de conformation de la chromatine circulaire couplé avec la nouvelle génération séquençage (4C-seq), en particulier, est conçu pour découvrir tous les possibles interactions de chromatine physique pour une séquence donnée d’intérêt (point de vue), par exemple un gène cible ou une réglementation Enhancer. Les stratégies actuelles de 4c-seq directement partir de séquence au sein du point de vue mais pour lesquels nombreux et divers points de vue à séquencer simultanément afin d’éviter les difficultés techniques de l’uniforme de base aux prochaines plates-formes de séquençage appelant (imagerie). Ce volume d’expériences n’est peut-être pas pratique pour de nombreux laboratoires. Nous rapportons ici une approche modifiée du protocole 4C-seq qui incorpore un digest de l’enzyme de restriction supplémentaire et étapes de qPCR-fonction amplification qui sont conçus pour faciliter une saisie plu de séquences diverses lectures et atténuer les risques de Biaiser les PCR, respectivement. Notre méthode modifiée de 4c se prête au laboratoire de la biologie moléculaire standard pour évaluer l’architecture de la chromatine.

Introduction

L’identification des éléments de régulation de l’expression des gènes a été facilitée par le projet d’encyclopédie des éléments de l’ADN (Encoder) qui annotée complète l’activité fonctionnelle de 80 % du génome humain¹^,². L’identification des sites pour en vivo liaison de facteur de transcription, hypersensibilité de la DNase i et histone épigénétique et modifications de méthylation de l’ADN dans les cellules individuelles a ouvert la voie pour les analyses fonctionnelles du candidat réglementaire éléments pour l’expression des gènes cibles. Armé de ces résultats, nous sommes confrontés au défi de la ....