High-throughput Identification des séquences régulatrices du gène à l’aide de prochaine génération séquençage du Chromosome circulaire Conformation Capture (4C-seq)

Summary

L’identification des interactions physiques entre les gènes et les éléments de régulation est difficile, mais a été facilitée par les méthodes de capture de conformation du chromosome. Cette modification du protocole 4C-seq atténue la partialité de la PCR en réduisant au minimum l’amplification excessive des modèles PCR et maximise la mappability se lit en y incorporant une étape digest d’enzyme de restriction addition.

Abstract

L’identification des éléments de régulation pour un gène cible donnée constitue un défi technique considérable en raison de la variabilité dans les tailles de positionnement et de l’effet des éléments régulateurs à un gène cible. Certains progrès ont été réalisés avec la prédiction de bioinformatique de l’existence et la fonction de modifications épigénétiques proximales, associée à l’expression des gènes activés à l’aide de sites de fixation de facteurs de transcription conservée. Études de chromatine conformation capture ont révolutionné notre capacité à découvrir des contacts physiques chromatine entre les séquences et même au sein d’un génome entier. Capture de conformation de la chromatine circulaire couplé avec la nouvelle génération séquençage (4C-seq), en particulier, est conçu pour découvrir tous les possibles interactions de chromatine physique pour une séquence donnée d’intérêt (point de vue), par exemple un gène cible ou une réglementation Enhancer. Les stratégies actuelles de 4c-seq directement partir de séquence au sein du point de vue mais pour lesquels nombreux et divers points de vue à séquencer simultanément afin d’éviter les difficultés techniques de l’uniforme de base aux prochaines plates-formes de séquençage appelant (imagerie). Ce volume d’expériences n’est peut-être pas pratique pour de nombreux laboratoires. Nous rapportons ici une approche modifiée du protocole 4C-seq qui incorpore un digest de l’enzyme de restriction supplémentaire et étapes de qPCR-fonction amplification qui sont conçus pour faciliter une saisie plu de séquences diverses lectures et atténuer les risques de Biaiser les PCR, respectivement. Notre méthode modifiée de 4c se prête au laboratoire de la biologie moléculaire standard pour évaluer l’architecture de la chromatine.

Introduction

L’identification des éléments de régulation de l’expression des gènes a été facilitée par le projet d’encyclopédie des éléments de l’ADN (Encoder) qui annotée complète l’activité fonctionnelle de 80 % du génome humain^1,2. L’identification des sites pour en vivo liaison de facteur de transcription, hypersensibilité de la DNase i et histone épigénétique et modifications de méthylation de l’ADN dans les cellules individuelles a ouvert la voie pour les analyses fonctionnelles du candidat réglementaire éléments pour l’expression des gènes cibles. Armé de ces résultats, nous sommes confrontés au défi de la détermination de l’interconnectivité fonctionnelle entre gènes et des éléments de régulation. Plus précisément, quelle est la relation entre un gène cible donnée et son enhancer(s) ? La méthode de capture (3C) de conformation de la chromatine répond directement à cette question par identification les interactions fonctionnelles, physiques et probables entre une région d’intérêt et candidat interagissant les séquences à travers les événements capturés dans la chromatine fixe³ . Comme notre compréhension des interactions de la chromatine a augmenté, cependant, il est clair que l’enquête de locus de candidats présélectionnés ne suffit pas fournir une compréhension complète des interactions gène-enhancer. Par exemple, ENCODE utilisé la méthode de copie carbone (5C) haut débit chromosomiques conformation capture pour examiner une petite partie du génome humain (1 %, pilote mis de 44 loci) et rapportée interconnexion complexe des loci. Gènes et rehausseurs avec interactions identifiées en moyenne 2 à 4 différents partenaires interdépendants, dont beaucoup étaient des centaines de kilobases loin dans l’espace linéaire⁴. En outre, Li et al. utilisé la chromatine analyse des interactions en bout appariés Tag séquençant (clerbois-PET) pour analyser les interactions de promoteur du génome entier et trouvé que 65 % de l’ARN polymérase II accepteurs étaient impliqués dans les interactions de la chromatine. Certaines de ces interactions résultèrent en grands, multi-gene complexes s’étendant sur des centaines de kilobases de distance génomique et contenant, en moyenne, 8-9 gènes chaque⁵. Ensemble, ces résultats soulignent la nécessité de méthodes de génome entier impartiales pour interroger les interactions de la chromatine. Certaines de ces méthodes sont examinés dans Schmitt et al. ⁶.

Des méthodes plus récentes études de chromatine conformation capture couplé avec génération séquençage (Hi-C et 4C-seq) activer la découverte de séquences inconnues interagissant avec une région d’intérêt⁶. Plus précisément, chromosome circulaire conformation capture avec génération de séquençage (4C-seq) a été développée pour identifier les locus interagissant avec une séquence d’intérêt dans une manière impartiale⁷ par séquençage ADN de chromatine capturée proximale à la région d’intérêt dans l’espace 3D. En bref, la chromatine est fixée à préserver ses interactions protéine-ADN natif, s’est fendue avec une enzyme de restriction et ensuite ligaturé conditions diluées pour capturer biologiquement pertinentes « enchevêtrements » d’interaction loci (Figure 1). Les liaisons transversales sont inversées pour enlever les protéines, laissant ainsi l’ADN disponible par clivage supplémentaire avec une deuxième enzyme de restriction. Une ligature finale génère des petits cercles de loci qui interagissent. Amorces pour la séquence d’intérêt sont ensuite utilisés pour générer une bibliothèque amplifiée de séquences inconnues des fragments ΦH1, suivies de séquençage en aval de génération suivant.

Le protocole présenté ici, qui met l’accent sur la préparation de l’échantillon, fait deux modifications majeures existantes 4C-seq méthodes^8,9,10,11,12. Tout d’abord, il utilise une méthode axée sur le qPCR empiriquement déterminer le nombre optimal d’amplification des cycles pour les étapes de préparation de bibliothèque 4C-seq et atténue ainsi les risques de biais PCR découlant de l’amplification excessive des bibliothèques. Ensuite, il utilise une restriction supplémentaire condensé étape dans un effort pour réduire l’uniformité des séquences connues « appâts » qui entrave d’appel base précise par l’instrument de séquençage et, donc, optimise la séquence unique et informative à chaque lecture. Autres protocoles de contournent ce problème en mettant en commun de nombreuses bibliothèques de 4c-seq⁸ (12-15) avec appât différentes séquences et/ou des sites de restriction, un volume d’expériences qui ne peut être réalisable par d’autres laboratoires. Les modifications présentées ici laisser un petit nombre d’expériences, des échantillons ou réplique pour être indexé et regroupés en une seule voie.

Protocol

1. les enzymes de Restriction sélection

1. Identifier une région d’intérêt (p. ex.., promoteur du gène, polymorphisme de nucléotides simples (SNP), rehausseur) et obtenir la séquence d’ADN de référentiels comme Centre National pour l’Information de biotechnologie (NCBI).
2. Identifier les enzymes de restriction du candidat (REs) pour la première enzyme de restriction digestion (RE1) qui ne coupent pas au sein de la séquence d’intérêt, qui produisent les extrémités cohésives (termini ADN avec surplombs) après RE la digestion, et dont les activités ne sont pas inhibées par Méthylation de CpG.
   Remarque : La résolution des données est déterminée par RE1. Une enzyme avec une séquence de reconnaissance 6 paires de bases (bp) produit, en moyenne, environ 4 des fragments kilobases (kb) de longueur, tandis qu’une enzyme avec une séquence de reconnaissance bp 4 produit bp environ 250 des fragments de longueur, ce qui permet plus précis identification des séquences d’interactions.
3. Sélectionnez un RE1 dans les enzymes candidat identifiés à l’étape 1.2 qui produit un « point de vue » restriction fragment au moins 500 bp longtemps qui inclut la zone concernée ou, subsidiairement, une région voisine.
   Remarque : L’enzyme sélectionné doit être prête à amorce design (voir étape 2).
4. Pour la seconde digestion, identifier une enzyme de restriction (RE2) avec une séquence de reconnaissance bp 4 qui produit des extrémités cohésives (termini ADN avec surplombs) après RE digestion, dont l’activité n’est pas inhibée par méthylation de CpG, et qui coupe dans la restriction fragment généré par RE1 pour produire un fragment d’appât PB 250 – 500 (Figure 1).
   Remarque : L’enzyme sélectionné doit être prête à amorce design (voir étape 2).

2. conception et Test amorces pour la PCR Inverse et l’efficacité de la Digestion qPCR

1. Utilisez un outil de conception d’apprêt comme Primer3 (http://primer3.ut.ee) pour concevoir des amorces inverses qui sont dirigées vers l’extérieur, vers les extrémités du fragment appât (i.e., l’apprêt 5' est une « inversion » amorce, complémentaire au strand plu, tandis que l’ABC des 3' est un « avant » amorce, complémentaire à la mèche moins) et que près des sites de restriction que possible afin de minimiser l’amplification des appâts non informatif de séquence et maximiser l’efficacité PCR (Figure 2 a).
   Remarque : Les amorces devraient prévoir d’avoir minimum amplification non spécifique de l’ADN génomique en silico les prédictions de la PCR et devraient aligner pas ailleurs dans le génome sauf leur cible avec plus de 16/18 identité⁹. Adaptateurs de séquençage ne sont pas reprises dans les amorces PCR inverses, le site de fixation de l’amorce est plus souple que dans d’autres méthodes de préparation de 4C ; amorces doivent recuire optimale au sein de 50 Pb de la fin du site de restriction correspondante.
   1. Confirmer la spécificité des amorces PCR inverses par amplification à l’aide de l’ADN génomique purifié (ADNg) en tant que modèle.
   2. Amorces optimales devraient produire quelques produits lors de l’utilisation de gDNA comme modèle (voir étape 11.2 pour la description des produits escomptés de 4c). En cas d’amplification considérable d’ADNg, concevoir de nouvelles amorces. Si aucun amorces acceptables ne sont identifiés, retourner à l’étape 1 et sélectionnez un nouvel appât en sélectionnant de nouvelles enzymes de restriction.
2. Concevoir des amorces de qPCR pour amplifier les fragments 70 – 200 nucléotides (nt) dans la longueur pour surveiller l’efficacité de la digestion de restriction (Figure 2 b).
   1. Concevoir une paire d’amorces pour amplifier dans chaque site de restriction (sélectionnée à l’étape 1) qui définissent la séquence de l’appât. Concevoir les amorces pour les deux RE1 (voir étape 6.5.6) et sites de RE2 (voir étape 9.2).
   2. Concevoir une série d’amorces qui amplifie une région ne contenant ne pas les sites de deux enzymes de restriction comme un contrôle de la normalisation (ADN non coupée) pour RE1 et RE2 (voir aussi l’étape 6.5.6).

3. collection de cellules

1. En utilisant une méthode appropriée pour la culture de tissus ou cellules, obtenir une suspension de cellules individuelles. Les cellules pendant 5 min à 200 x ga granulé, éliminer le surnageant et Resuspendre le culot dans 500 µL de 1 x tampon phosphate salin (PBS) par 10⁷ cellules.

4. formaldéhyde réticulation des cellules afin de préserver les Interactions de la chromatine

1. Par 10⁷ cellules, addition de 9,5 mL de 1 % la microscopie électronique (EM)-formaldéhyde (exempts de méthanol) dans du PBS de grade et incuber, tandis que la bascule sur la bascule (ou similaire), pendant 10 min à température ambiante (RT, 18 – 22 ° C).
   Remarque : Les conditions de Fixation peuvent avoir à être optimisé pour chaque type de cellule. Préalable de travaux publiés dans les cellules de souris ont signalé que la fixation optimale se traduit par au moins 40 % de lectures mappés en alignant au chromosome contenant le point de vue⁹ en supposant une région non télomérique pour un chromosome de taille moyenne.
2. Transférer les tubes de réaction pour la glace et ajouter glacée 1 M glycine à une concentration finale de 0,125 M (1,425 mL) pour étancher la réaction de réticulation. Mélanger doucement par retournements.
3. Centrifuger pendant 5 min à 200 x g, 4 ° C et retirer soigneusement tous les le surnageant. Stocker le culot cellulaire à-80 ° C ou procéder immédiatement à la lyse de la cellule.

5. lyse cellulaire

1. Resuspendre le culot cellulaire de 4,3 étape dans 500 µL de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à laver de 5 mM. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à RT. jeter le surnageant.
2. Resuspendre le culot dans 125 µL de 5 mM EDTA avec 0,5 % dodécylsulfate de sodium (SDS) et des inhibiteurs de protéase x 1, comme un cocktail contenant antipapaïne 5 mg/mL 10 mg/mL chymostatine, leupeptine de 10 mg/mL et 10 mg/mL pepstatine A. de x 100
   NOTE : Concentration de détergent peut être être optimisé pour chaque type de cellule. Les concentrations de détergent insuffisantes seront traduira par la lyse des cellules incomplètes, laissant la chromatine inaccessibles aux enzymes de restriction. Si la digestion de restriction est constamment faible en étape 6.5.6 et l’activité de l’enzyme a été confirmée, détergent supplémentaire peut être nécessaire. Augmenter la concentration de SDS par incréments de 0,1 %.
3. Incuber la suspension cellulaire sur la glace pendant 10 min.
   Remarque : Pour des kératinocytes humains primaires, lyse optimale a été atteint à l’aide d’une incubation de 10 min à 65 ° C, suivie d’une incubation de 37 ° C durant la nuit dans un bloc chauffant secouant avec agitation (900 tr/min).
4. Veiller à ce que la lyse cellulaire est terminée.
   1. Mix 6 µL des cellules avec 6 µL de bleu Trypan sur une diapositive et les recouvrir d’un lamelle couvre-objet. Découvre sous un microscope.
      Remarque : Lors de la lyse réussie, l’intérieur des cellules devrait apparaître bleu et cellules non lysées apparaît blanches.
   2. Si la lyse cellulaire apparaît insuffisante, les cellules à 200 x g pendant 5 min de granule et enregistrez le surnageant. Resuspendre le culot et répétez les étapes 5.2 à 5.4 ou alternativement avec une température d’incubation différentes (voir la Note à l’étape 5.3).
   3. Combiner le granule re-lysé avec le surnageant sauvé et aller de l’avant.
      Remarque : Inspection visuelle n’est pas une garantie de la lyse suffisante. Efficacité de la digestion doit être déterminée objectivement comme à l’étape 6.5.6.

6. première Restriction Digestion

1. Ajouter 30 μL de 10 x tampon d’enzyme de restriction (spécifiée par le fabricant) et 27 μL de 20 % Triton X-100 (final 1,8 %) à la suspension de 5,4 étape. Porter le volume total à 300 µL avec H₂O.
   Remarque : La composition du tampon enzyme de restriction dépendra de la RE choisi à l’étape 1.
2. Supprimer un 15 μL aliquote comme « Non digéré control » et conserver à 4 ° C.
3. Ajouter 200 U RE1 au milieu réactionnel restants et incuber une nuit à la température appropriée à l’enzyme dans un bloc chauffant secouant avec agitation (900 tr/min). Le lendemain, ajouter une supplémentaire de 200 U RE1 et poursuivre l’incubation pendant la nuit.
4. Supprimer un 15 μL aliquote comme un « contrôle de Digested » et conserver à 4 ° C.
5. Déterminer l’efficacité de la digestion :
   1. Ajouter 82,5 µL de 10 mM Tris-HCl pH 7,5 à 15 échantillons µL d’étapes 6.2 et 6.4. Ajouter 2,5 µL de protéinase K (20 mg/mL) et incuber pendant 1 heure à 65 ° C.
   2. Ajouter 100 µL de phénol-chloroforme et mélanger vigoureusement par inversion pour éliminer les contaminants de protéines résiduelles. Centrifuger pendant 5 min, 16 100 x g à la température ambiante.
   3. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube. Ajouter 6,66 µL de pH d’acétate de sodium 3M 5.2, 1 µL de glycogène de 20 mg/mL et 300 µL d’éthanol (EtOH) à 100 %. Mélanger doucement en inversion et de la place à-80 ° C pendant 1 h.
   4. Centrifuger pendant 20 min à 16 100 x g à 4 ° C. Retirer le surnageant, ajouter 500 µL de 70 % EtOH et centrifuger pendant 5 min à 16 100 x g à température ambiante.
   5. Retirez le surnageant et le culot à la température ambiante à sec à 2 min. Resuspendre le culot dans 50 µL d’exempte de nucléase H₂O.
   6. Déterminer l’efficacité digest de qPCR^13,14 , à l’aide de la méthode ∆∆Ct. Utiliser le primaire défini d’accompagnement ne pas un site de restriction (voir étape 2.2.2) que le contrôle de normalisation. Aller de l’avant si l’efficacité de la digestion est > 85 %. Dans le cas contraire, les cellules de granule et répétez les étapes 5,2 à 6,5, omettant l’incubation à 65 ° C, dans l’étape 5.3.

7. première ligature

1. Chaleur-inactiver les enzymes de restriction en incubant 20 min à 65 ° C. Sinon, si l’enzyme ne peut pas être inactivé de chaleur, phénol-chloroforme extraire et éthanol précipiter l’échantillon.
   NOTE : Les températures plus élevées l’inactivation, recommandées pour certaines enzymes de restriction dénaturent les protéines dans la chromatine, et cela peut affecter négativement la qualité de l’échantillon. En outre, extraction au phénol : chloroforme n’est pas idéale, car il entraîne la perte de l’échantillon.
2. Transvaser dans un tube conique de 50 mL et ajouter 6 mL d’exempte de nucléase H₂O, 700 µL de 10 x tampon de ligase (660 mM Tris-HCl pH 7.5, le chlorure de magnésium (MgCl₂), de 50 mM 10 mM le dithiothréitol (DTT), 10 mM l’adénosine triphosphate (ATP)) et 50 U T4 DNA Ligase. Mélanger doucement en agitant et incuber une nuit à 16 ° C.
3. Retirer une quantité de 100 µL de l’échantillon comme le '' contrôle de ligature ''.
4. Déterminer l’efficacité de la ligature :
   1. Ajouter 2,5 µL de protéinase K (20mg/mL) et incuber 1 h à 65 ° C.
   2. Ajouter 100 µL de phénol-chloroforme et mélanger vigoureusement par inversion. Centrifuger pendant 5 min, 16 100 x g à température ambiante.
   3. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube. Ajouter 6,66 µL de 3M acétate de sodium pH 5,2, 1 µL de glycogène et 300 µL de 100 % EtOH. Mélanger doucement en inversion et de la place à-80 ° C environ 1 h.
   4. Centrifuger pendant 20 min à 16 100 x g à 4 ° C. Retirer le surnageant, ajouter 500 µL de 70 % EtOH et centrifuger pendant 5 min à 16 100 x g à 4 ° C.
   5. Retirez le surnageant et le culot à la température ambiante à sec. Resuspendre le culot dans 20 µL d’eau et de charge sur un gel d’agarose de 0,6 % à côté des « contrôles de digestion » étape 6.5.
      Remarque : Un échantillon bien ligaturé doit apparaître comme une bande de poids moléculaire élevé relativement serré (Figure 3).
   6. Si la ligature est suffisante, procéder à l’étape 8. Dans le cas contraire, ajouter frais ATP (concentration finale de 1 mM) et nouveau ligase ; Incuber une nuit à 16 ° C, puis répétez les étapes 7.3 à 7.4.

8. inversez la réticulation et isoler la chromatine

1. Ajouter 15 µL de protéinase K (20 mg/mL) et incuber pendant la nuit à 65 ° C, pour inverser les liaisons transversales.
2. Ajouter 30 µL de la RNase A (10 mg/mL) et incuber pendant 45 min à 37 ° C.
3. Ajouter 7 mL de phénol-chloroforme et mélanger vigoureusement par inversion. Centrifuger 15 min, 3 300 x g à température ambiante.
4. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube de 50 mL et ajouter 7,5 mL d’exempte de nucléase H₂O (pour diluer la TNT présente dans le tampon de la ligase, qui, autrement, précipite avec l’ADN), 1 mL d’acétate de sodium 3M pH 5,6, 7 µL du glycogène (20 mg/mL) et 35 mL de 100 % EtOH. Mélanger et laisser incuber à-80 ° C pendant 1 h.
5. Centrifuger 20 min, 3 900 x g à 4 ° C. Retirez le surnageant (pellet peut être difficile à voir), laver le culot avec 10 mL de glacee 70 % EtOH et centrifuger 15 min, 3 300 x g à 4 ° C.
6. Retirez le surnageant et brièvement sécher le culot à RT. dissoudre le culot dans 150 µL de 10 mM Tris-HCl pH 7,5 à 37 ° C. Conserver à-20 ° C ou passez à l’étape 9.

9. deuxième Restriction Digestion : Tailler les cercles

Remarque : Cette étape crée de petits cercles pour minimiser la surreprésentation des petites capturés fragments en raison de la partialité de la PCR dans les étapes de l’amplification en aval.

1. À l’échantillon de 8,6 étape, ajouter 50 µL d’enzyme de restriction mémoire tampon (spécifiée par le fabricant), 10 x 300 µL d’exempte de nucléase H₂O et 50 U restriction enzyme RE2. Incuber une nuit à la température appropriée pour l’enzyme choisie.
2. Enlever une quantité de 15 µL de l’échantillon que le « contrôle de la Digestion ». Déterminer l’efficacité de la digestion tel que décrit dans l’étape 6.5.

10. deuxième ligature et Purification d’ADN

1. Inactiver les enzymes de restriction, tel que recommandé par le fabricant. Si l’enzyme ne peut pas être inactivés par la chaleur, éliminer l’enzyme à l’aide d’un kit de purification basée sur les colonnes.
   NOTE : Comme ceci entraîne la perte d’échantillon, purification de la colonne n’est pas idéale.
2. Transférer l’échantillon dans un tube de 50 mL et ajouter 12,1 mL d’exempte de nucléase H₂O et 1,4 mL de ligature mémoire tampon (660 mM Tris-HCl, pH 7,5 ; 50 mM MgCl₂; ATP 10 mM, 10 mM DTT) 10 x 100 U T4 DNA ligase. Incuber une nuit à 16 ° C.
3. Ajouter 467 µL d’acétate de sodium 3M pH 5,6, 233 µL exempte de nucléase H₂O, 7 µL glycogène (20 mg/mL) et 35 mL 100 % EtOH. Bien mélanger et laisser incuber à-80 ° C 1 h.
4. Centrifugeuse 45 min, 3 900 x g à 4 ° C. Retirer le surnageant, ajouter 10 mL de froid 70 % EtOH et centrifuger 15 min, 3 300 x g à 4 ° C.
5. Retirez le surnageant et brièvement sécher le culot à la température ambiante. Ajouter 150 µL de 10 mM Tris-HCl pH 7,5 et incuber à 37 ° C pour dissoudre le culot.
6. Purifier les échantillons avec un silice basée sur les colonnes PCR purification kit, suivant les instructions du fabricant. Utiliser 1 colonne par 3 x 10⁶ cellules, basées sur le nombre initial des cellules. Éluer les colonnes avec 50 µL de 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 et mettre en commun les échantillons.
7. Mesurer la concentration par fluorimétrie ou spectrophotométrie à l’aide de l’absorbance à 260 nm. Le modèle 4c est maintenant prêt pour l’ACP inverse. Conserver à-20 ° C, ou passez directement à l’étape 11.

11. PCR amplifier des séquences interactions inconnues par PCR Inverse

1. Déterminer l’intervalle linéaire de l’amplification en effectuant une PCR à l’aide de dilutions de modèle de 12,5, 25, 50 et 100 ng 4C modèle. Si vous le souhaitez, amplifier d’ADNg en parallèle pour comparer directement les produits afin d’identifier l’amplification non spécifique. Exécuter des réactions de PCR à l’aide d’une dénaturation initiale à 94 ° C pendant 2 min ; 30 cycles consistant en une étape de dénaturation à 94 ° C pendant 10 s, une étape de recuit à 55 ° C pendant 1 min et une étape de l’extension à 68 ° C pendant 3 min ; et une extension finale à 68 ° C pendant 5 min.
2. Séparer les 15 µL de chaque produit de la PCR sur un gel d’agarose de 1,5 % pour confirmer l’amplification linéaire et évaluer la qualité de modèle (Figure 4). Amplification du modèle 4C devrait donner des bandes discrètes à faibles concentrations d’ADN et un frottis des concentrations plus élevées. La présence d’un frottis indique la complexité accrue des ligature des trompes 4C amplifié.
3. Lorsque vous êtes satisfait de la qualité et la quantité du produit PCR inverse résultant, mis en place un qPCR pour déterminer le nombre optimal de cycles à utiliser pour l’amplification :
   1. Mettre en place les réactions contenant des colorants SYBR et ROX en utilisant le mélange réactionnel dans le tableau 2. À moins que l’amplification n’est pas linéaire à des concentrations élevées en étape 11.2, utilisation 100 ng du modèle par réaction.
      Remarque : L’ajout de ROX facilite la normalisation du signal fluorescent de puits à puits et cycle à cycle.
   2. Exécuter les réactions de PCR à l’aide d’une dénaturation initiale à 94 ° C pendant 2 min ; 40 cycles consistant en une étape de dénaturation à 94 ° C pendant 10 s, une étape de recuit à 55 ° C pendant 1 min et une étape de l’extension à 68 ° C pendant 3 min ; et une extension finale à 68 ° C pendant 5 min.
   3. Déterminer la fluorescence de la crête (point de terminaison) des réactions à l’aide de la courbe d’amplification. Déterminer le cycle au cours de laquelle des réactions atteint 25 % de la fluorescence de crête (Figure 5).
      NOTE : Ceci est le nombre de cycles qui sera utilisé pour amplifier les bibliothèques 4C (voir étape 11.4).
4. Mettre en place inverse PCR comme dans le tableau 3 pour amplifier des séquences inconnues ligaturés à l’appât du modèle 4C. Diviser en 16 réactions de 50 µL avant la course. Exécuter des réactions de PCR utilisant une dénaturation initiale 94 ° c pendant 2 minutes et cycles consistant en une étape de dénaturation à 94 ° C pendant 10 s, un recuit à 55 ° C pendant 1 min, et d’une étape de l’extension à 68 ° C pendant 3 min. utiliser le nombre de cycles déterminé à l’étape 11.3.3.
5. Recueillir et mettre en commun les réactions. Purifier à l’aide d’un kit de purification de la PCR basée sur les colonnes à silice. Utilisez au moins 2 colonnes par 16 réactions. Mettre en commun les produits PCR purifiés.
6. Déterminer la quantité d’échantillon et de la pureté par spectrophotométrie. Les rendements typiques sont entre 10 et 20 μg avec A260/A280 ~ 1,85. Si les coefficients d’absorption sont sous-optimaux, re-purifier afin d’éviter les problèmes pendant le séquencement.
7. Évaluer la complexité de la bibliothèque en séparant 300 ng du produit PCR purifié sur un gel d’agarose de 1,5 %.
   Remarque : Produit amplifié devrait ressemble à celle de 11.2 de l’étape.

12. troisième Restriction Digestion : Éliminez l’appât des séquences

Remarque : Cette étape supprime appâts non informatif séquences de produits PCR inverses pour optimiser des séquences capturées informatives dans les étapes de séquençage en aval. Pour surveiller l’efficacité de digest, un moniteur « digest »¹⁵ est digéré en parallèle à l’aide de la concentration équivalente d’ADN et de l’enzyme. Si RE1 et RE2 sont incompatibles pour la digestion simultanée, par exemple, en raison de températures optimales différentes ou des tampons de réaction, cela doit être fait comme un "Digest" séquentiel (ce n’est pas idéal).

1. Un moniteur de digest RE et tester la digestion dans une réaction de 50 µL.
   Remarque : Il s’agit d’une molécule d’ADN double brin (par exemple, un plasmide, PCR amplicon ou ADN synthétique) qui contient l’ou les lieux RE. La seule exigence est qu’il devrait être facile à distinguer cut uncut moniteur sur gel d’agarose. Optimize RE moniteur masse et enzyme concentration si nécessaire.
2. Digest 1 µg de purifié produit PCR inverse de 11,6 d’étape et, en parallèle, le moniteur RE de 12.1 de l’étape.
   NOTE : ADN et concentration de l’enzyme, ainsi que les temps d’incubation, devraient être les mêmes que pour le recueil de test étape 12.1 pour aussi bien l’inverse produit PCR et les condensés de moniteur. Ajustez le volume réactionnel au besoin.
3. Exécutez le digéré RE moniteur sur gel d’agarose de la concentration appropriée pour les fragments attendus. La digestion est considéré comme suffisant lorsque < 10 % de l’ADN reste non circoncis (Figure 6).
4. Purifier le produit PCR inverse digéré sur un kit de purification d’ADN axée sur la colonne de silice. Si digestion séquentielle est requises, répétez les étapes 12.1 à 12.4 avec la seconde enzyme.

13. préparation du séquençage de bibliothèque

1. Ligaturer les adaptateurs compatibles avec la plateforme de séquençage génération prochaine respectifs.
   1. Design les adaptateurs pour chaque RE1 et RE2 afin que, après le recuit les oligos, chaque adaptateur RE a le surplomb 1-côtés respectif.
      NOTE : par exemple, si HindIII est utilisé, l’adaptateur recuit doit contenir un surplomb 5' phosphorylée « AGTC ». Alternativement, si standard T-porte-à-faux adaptateurs sont utilisés, fin-réparation et queue-A la bibliothèque avant ligation de l’adaptateur.
   2. Recuire les oligos RE adaptateur respectifs. Remettre en suspension les oligos dans un tampon recuit (10 mM Tris, pH 7.5, 50 mM chlorure de sodium (NaCl), EDTA 1 mM), mélangez en quantités équimolaires à 50 µM, chaleur à 95 ° C et laisser refroidir lentement à 25 ° C.
   3. Effectuer la réaction de ligature. Bibliothèque C 4 re-digéré se mêlent un total 5 à 10 fois excès molaire de recuit adaptateurs (étape 13.1.2 ; rapport de 50 : 50 pour chaque adaptateur RE utilisé) dans 1 x tampon de ligase et ajouter 6U DNA ligase. Incuber conformément aux instructions du fabricant.
   4. Enlevez les adaptateurs excès en purifiant à utiliser un kit de colonne de base de silice d’élution faible volume.
2. Taille-select.
   Remarque : Sélection de la taille peut également être effectuée à l’aide d’un kit de nettoyage de base perle et est recommandée même après purification colonne.
   1. Monter un gel d’agarose à 2 % à l’aide d’un gel d’agarose à haute résolution, ajoutant une tache non-UV avant de couler. Veiller à ce que toute l’eau perdue à cause de l’évaporation au cours du chauffage est remplacé par un poids de la bouteille ou le flacon avant et après chauffage et ajouter de l’eau pour récupérer la masse perdue.
   2. Exécuter les bibliothèques adaptateur-ligaturé sur le gel, laissant les ruelles vides entre les échantillons.
   3. Les tranches de gel correspondant à la taille entre 150 bp à 1 Ko à l’aide d’un bistouri propre ou une lame de rasoir de l’accise.
   4. Purifier les bibliothèques du gel à l’aide d’un kit d’extraction de gel. Pour minimiser les biais de GC dans la récupération de l’ADN, dissoudre les tranches de gel à température ambiante avec rotation.
3. Déterminer le nombre de cycles d’amplification par PCR de qPCR en utilisant le mélange réactionnel dans le tableau 4. Exécuter les réactions de PCR utilisant une dénaturation initiale à 98 ° C pendant 2 min et 40 cycles consistant en une dénaturation étape à 98 ° C pendant 10 s, une étape de recuit à 60 ° C pendant 1 min et une étape de l’extension à 72 ° C pendant 3 min.
   Remarque : Le cycle au cours de laquelle la fluorescence atteint 25 % de la valeur maximale est le nombre de cycles qui servira à amplifier la bibliothèque, comme dans l’étape 11,3.
4. Amplifier les bibliothèques utilisant le mélange réactionnel dans le tableau 5. Exécuter les réactions de PCR utilisant une dénaturation initiale à 98 ° C pendant 2 minutes et cycles consistant en une étape de dénaturation à 98 ° C pendant 10 s, une étape de recuit à 60 ° C pendant 1 min et une étape de l’extension à 72 ° C pendant 3 min. Le nombre de cycles d’amplification à utiliser pour chaque bibliothèque a été déterminé à l’étape 13.3.
5. Purifier amplifiés bibliothèques utilisant un kit de colonne de base de silice d’élution faible volume.

14. le séquençage et l’analyse des données de séquençage

1. Déterminer les concentrations des bibliothèques amplifiés par dosage fluorimétrique. Diluer les bibliothèques à la concentration appropriée de séquençage (vérifiez auprès du service de séquençage ou core pour leur recommandation).
2. Déterminer la qualité des bibliothèques à l’aide d’une plateforme d’analyse des acides nucléiques microfluidiques.
   NOTE : Le profil de la taille de la bibliothèque devrait refléter celle observée sur le gel de sélection de taille dans l’étape 13,2 et la concentration de l’échantillon déterminé dans cette étape doit être utilisé pour le séquençage.
3. Piscine indexé bibliothèques d’obtenir au moins 3 millions de lectures (au moins 50 bp lu ; single [1 X 50] ou fin apparié [2 X 50]) par exemple. Une bibliothèque de qualité nécessite au moins 1 million mappé lit⁹, mais il y aura quelques attrition au cours de la cartographie. Par exemple, une plate-forme de séquençage qui génère environ 150 millions de lectures par couloir peut accueillir jusqu'à 50 échantillons en une seule voie.

15. l’analyse des données de séquence

1. Démultiplexer les données à l’aide de séquences d’index pour affecter les lectures à leurs échantillons appropriés.
   Remarque : Selon leur familiarité, utilisateurs peuvent effectuer des analyses de calculs en aval des fichiers de séquence FASTA/FASTQ raw à l’aide de base interface de ligne de commande ou, subsidiairement, la conviviale, basée sur le web Galaxy graphical user interface (GUI)¹⁶ .
2. Coupez les séquences d’adaptateur et de n’importe quelle séquence d’appât découlant d’incomplète RE digestion à l’étape 12, par exemple, à l’aide de la boîte à outils pour rapide-X (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/).
3. Carte de démultiplexage lectures au génome approprié d’intérêt (p. ex.., UCSC mm10, hg19) fichiers de sortie à l’aide de l' aligneur de Burrows-Wheeler (BWA)¹⁷ ou tout autre logiciel d’alignement résultant dans SAM. Le cas échéant, convertir des fichiers SAM BAM via samtools¹⁸ (voir étape 15.4).
4. Utiliser un pipeline d’analyse 4C-seq comme Basic4Cseq¹⁹, 4C-ker²⁰, FourCSeq²¹ou²² de la fourSig pour analyser les données et identifier les interactions.
   NOTE : L’analyse des données et l’évaluation de la qualité de celle-ci devraient être effectuées selon le manuel de référence du package logiciel sélectionné. Génèrent des paquets lit les fichiers de sortie sauf indication contraire. En bref, Basic4CSeq¹⁹ utilise un fichier d’entrée de SAM (étape 15.3) pour visualiser les interactions (txt, tiff, lit et fichiers de sortie de perruque) et évalue la qualité des données selon les critères énoncés dans van de Werken et al. ⁹ 4C-ker²⁰ (entrée parés FASTQ, étape 15,2) et FourCSeq²¹ (BAM d’entrée, étape 15,3) identifier les interactions différentielles entre les conditions. fourSig²² (entrée SAM) identifie des interactions significatives également et donne la priorité aux personnes qui sont susceptibles d’être reproductible. Des outils tels que la génomique enrichissement réglementaire d’outil Annotations (GREAT)²³, ou l’intégration avec les ensembles de données Encoder peuvent également être utilisés pour prédire la fonction biologique des interactions découvert par 4C-suiv.

Results

Des kératinocytes humains primaires ont été isolées de prépuces néonatales mis au rebut de 2 – 3, mis en commun et mis en culture dans KSFM complétée avec 30 µg/mL pituitaire bovine extrait, 0.26 ng/mL recombinant humain facteur de croissance épidermique et chlorure de calcium 0,09 mM (ACIC₂ ) à 37 ° C, 5 % de dioxyde de carbone. Les cellules étaient divisés en deux flacons, et un ballon a été différencié par l’ajout de CaCl₂ à une concentration finale de 1,2 mM pour...

Discussion

Résultats 4C sont susceptibles de révéler des interactions de la chromatine qui identifient les éléments réglementaires précédemment inconnus et/ou des gènes de cible qui sont importantes dans un contexte biologique spécifique^24,25,26. Cependant, les obstacles techniques peuvent limiter les données obtenues de ces expériences. Biais PCR découlant de l’amplification excessive de modèle dans les protocoles de 4 C est probable. Ce ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HindIII	NEB	R0104S
CviQI	NEB	R0639S
Amorces oligonucléotidiques d’ADN	IDT		À concevoir par le lecteur
Tubes à centrifuger coniques de 50 mL	Fisher Scientific	06-443-19
Tubes à centrifuger de 1,7 mL	MidSci	AVSS1700
Solution saline	tamponnée au phosphateThermo Fisher	14190-136
Formaldéhyde, sans méthanol	Microscopie électronique Sciences	15710
Nutator	VWR	15172-203
Glycine	JT Baker	4059-00
			paillasse
Microcentrifugeuse
Ethylènediaminetétraacétique acide (EDTA)	Sigma-Aldrich	ED2SS
20 % SDS solution	Sigma-Aldrich	05030
Trypan Blue	Thermo Fisher	15250061
Lames de verre	Fisher Scientific	12-550-143
Couvercles	VWR	16004-094
Microscope
Triton X-100	Alfa Aesar	A16046
			chauffant secouant
2 M Tris-HCl	Qualité Biologique	351-048-101
Protéinase K	NEB	P8107S
Phénol :chloroforme :alcool isoamylique (25:24:1)	Sigma-Aldrich	P2069
Acétate de sodium	Sigma-Aldrich	M5661
20 mg/ mL glycogène	Thermo Fisher	R0561
Éthanol	Fisher Scientific	04-355-223
Eau sans nucléases	Fisher Scientific	MT-46-000-CM
Cycleur qPCR	Thermo Fisher	4453536
plaques qPCR	Thermo Fisher	4309849
Thermocycleur	Thermo Fisher	4375786
Tubes de bandelettes PCR	MidSci	AVSST-FL
1 M Chlorure	de magnésium Qualité Biologique	351-033-721
Dithiothréotol	Sigma-Aldrich	43815
Adénosine triphosphate	Sigma-Aldrich	A2383
T4 ADN Ligase	NEB	M0202S
Agarose	Sigma-Aldrich	A6013
RNase A	Thermo Fisher	EN0531
Qiaquick Kit de purification PCR	Qiagen	28104
MinElute Kit de purification PCR	Qiagen	28004
Spectrophotomètre
Expand Long Template PCR	System Sigma-Aldrich	11681834001
dNTP mix	Thermo Fisher	R0191
SYBR Vert I	Sigma-Aldrich	S9430
ROX	BioRad	172-5858
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	S5886
End-It DNA End-Repair Kit	Lucigen	ER0720
LigaFast Système de ligature rapide de l’ADN	Promega	M8221
SYBR Safe	Thermo Fisher	S33102
Taq Polymérase	NEB	M0267S
UltraSieve Agarose	IBI Scientific	IB70054
Qiaquick Kit d’extraction de gel	Qiagen	28704