Une sonde de Force directe permettant de mesurer l’intégration mécanique entre le noyau et le cytosquelette

Summary

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode d’une micropipette pour appliquer directement une force contrôlée dans le noyau dans une cellule vivante. Ce dosage permet aux interrogatoires des propriétés mécaniques nucléaires dans la cellule vivante, adhérente.

Abstract

Les propriétés mécaniques du noyau déterminent sa réponse aux forces mécaniques générées dans les cellules. Parce que le noyau est moléculairement continu avec le cytosquelette, les méthodes sont nécessaires pour sonder son comportement mécanique dans les cellules adhérentes. Ici, nous discutons la sonde force directe (DFP) comme outil d’employer la force directement vers le noyau dans une cellule adhérente vivante. Nous attachons une micropipette étroite à la surface nucléaire avec aspiration. Une micropipette est traduite loin du noyau, ce qui provoque le noyau à déformer et à traduire. Lorsque la force de rappel est égale à la force d’aspiration, le noyau se détache et élastique se détend. Parce que la pression d’aspiration est connue avec précision, la force sur la surface nucléaire est connue. Cette méthode a révélé que les forces de la nano-échelle suffisent à déformer et à traduire le noyau dans les cellules adhérentes et identifié des éléments du cytosquelette qui permettent le noyau à résister aux forces. Le DFP peut servir à disséquer les contributions des composantes cellulaires et nucléaires nucléaire propriétés mécaniques dans les cellules vivantes.

Introduction

Pathologies telles que le cancer impliquent des modifications de forme nucléaire et composition^1,2, qui sont généralement accompagnés par un ramollissement du noyau^3,4. La résistance à la déformation mécanique nucléaire a été généralement caractérisée en appliquant une force de noyaux isolés⁵.

Le noyau dans les cellules est moléculairement relié au cytosquelette par l’éditeur de liens de Nucleoskeleton et cytosquelette (LINC) complexe^6,7,....

Protocol

1. préparation des cellules pour l’imagerie

Remarque : La sonde de force directe (DFP) peut être utilisée pour n’importe quel type de cellules adhérentes. Ici, les fibroblastes de souris NIH 3 t 3 sont utilisées comme la lignée cellulaire de modèle pour ce protocole.

1. Cellules de fibroblastes culture NIH 3 t 3 dans de l’aigle de la modification de Dulbecco Medium (DMEM) additionné de 10 % de sérum de bovin donneur et 1 % la pénicilline-streptomycine sur un fond de verre 35 mm plat jusqu'à confluence désirée. Maintenir les cellules à 37 ° C et 5 % de CO₂.
   1. N’oubliez pas de recouvrir tous les plats de fond verre 35 ....

Results

Figure 2 a montre le forçage d’un noyau de fibroblastes de souris de 3 t 3 NIH. Comme la pointe d’une micropipette est traduite vers la droite, le noyau se déforme et finit par se détache de l’extrémité de la micropipette. La souche de la longueur du noyau semble augmenter avec l’augmentation de la force d’aspiration (Figure 2 b). Le bord avant du noyau (en tirant avantage de micropipette) forme une protubérance nucléaire et le b.......

Discussion

Mesurer l’intégration mécanique du noyau avec le cytosquelette est un défi pour les méthodes plus récentes, par exemple une micropipette aspiration¹⁶, car ils nécessitent deux noyaux isolés (où le noyau est découplé du cytosquelette) ou noyaux dans les cellules suspendues (où les forces extracellulaires, telles que les forces de traction, sont absents). Force a été appliquée au noyau en appliquant biaxiale souche aux adhérentes de cellules à une membrane^17,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
FluoroDish		WPI FD35
SYTO 59	ThermoFisher Scientific	S11341
Femtotips  ;	Eppendorf	930000043
InjectMan NI2	Eppendorf	NA	discontinué, modèle équivalent actuel : InjectMan 4
FemtoJet	Eppendorf	NA	Modèle actuel FemtoJet 4i
Plan Immersion dans l’huile fluorée 40x	Nikon	NA
Apo TIRF immersion dans l’huile 60x	Nikon	NA
Sérum bovin donneur (DBS)	ThermoFisher Scientifique	16030074	NIH 3T3 sérum
Dulbecco’s Modification of Eagle’s (DMEM)	Mediatech cellgro	MT10013CVRF	NIH 3T3 milieu
Pénicilline-Streptomycine  ;	Mediatech	MT30004CIRF	NIH 3T3 medium supplément
Huile d’immersion Type LDF Non-Fluorescent	Nikon	77007	Huile d’immersion pour objectif objectif  ;