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Article de méthode

Applications de blocs induite par l’éthanol du Ganglion sympathique Cervical pour promouvoir la régénération Canine nerf alvéolaire inférieur à l’aide d’un nerf artificiel

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DOI :

10.3791/58039

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30 novembre 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Dental Anesthesia, Nippon Dental University Hospital at Tokyo, 2Department of Dental Anesthesiology, Nippon Dental University School of Life Dentistry at Tokyo, 3Department of Bioartificial Organs, Institute for Frontier Medical Science, Kyoto University

Dans cet article

Résumé

Nous avons évalué l’effet de bloc du ganglion sympathique cervical sur la réparation de nerf à l’aide de conduites nerveuses artificielles. Chiens beagle mâles étaient chacun implantés avec un nerf artificiel à travers un écart de 10 mm dans le nerf alvéolaire inférieur gauche ; ganglion sympathique cervical gauche a été bloqué par l’injection de 99,5 % d’éthanol par thoracotomie latérale.

Résumé

Polyglycolique collagène acide (PGA-C) tubes sont des tubes de nerf BIOABSORBABLES remplis de collagène de structure multichambre, qui se composent de films minces de collagène. Les résultats cliniques favorables ont été réalisés lors de l’utilisation de ces tubes pour le traitement du nerf alvéolaire inférieur endommagé (IAN). Un facteur essentiel pour la régénération des nerfs réussie à l’aide de tubes PGA-C est sanguine dans les tissus environnants. Bloc du ganglion sympathique cervical (CSGB) crée un blocage sympathique dans la région tête et cou, ce qui augmente la circulation sanguine dans la région. Afin d’assurer un effet suffisant, le blocus doit être administré avec des anesthésiques locaux une à deux fois par jour pendant plusieurs semaines consécutives ; Cela pose un défi lors de la création de modèles animaux pour l’étude de cette technique. Pour combler cette lacune, nous avons développé un CSGB induite par l’éthanol dans un modèle canin d’augmentation à long terme dans la circulation sanguine dans la région oro-faciale. Nous avons examiné si la régénération IAN par implantation de tube PGA-C peut être renforcée par ce modèle. Quatorze des Beagles ont été chacun implantés avec un tube de PGA-C sur un espace de 10 mm dans la gauche IAN. L’IAN se trouve dans le canal mandibulaire entouré d’os, donc nous avons choisi la chirurgie piézoélectrique, consistant en des ondes ultrasoniques, pour le traitement de l’OS, afin de minimiser le risque de lésions nerveuses et de navire. Un bon résultat chirurgical a été obtenu grâce à cette approche. Une semaine après la chirurgie, sept de ces chiens furent soumis à gauche CSGB par injection d’éthanol. CSGB induite par l’éthanol a entraîné dans la régénération du nerf améliorées, ce qui suggère que l’augmentation du débit sanguin favorise efficacement la régénération nerveuse dans des défauts de IAN. Ce modèle canin peut contribuer à des recherches plus poussées sur les effets à long terme de l’ONGC.

Introduction

Dans de nombreux cas, des lésions traumatiques du nerf alvéolaire inférieur (IAN) sont iatrogène, souvent causés par l’extraction de la troisième molaire, ou le placement des implants dentaires1,2,3. Blessures de l’IAN peuvent conduire à des déficits en thermique et tactile des sensations ainsi que paresthésie, dysesthésie, hypoesthésie et allodynie. Lésions du nerf sont considérée non seulement par un traitement conservateur, mais aussi par d’autres méthodes, y compris la suture et le placement de l’autogreffe. Cependant, ces méthodes ont des inconvénients, qui comprennent souvent l’absence d’amélioration des symptômes et anomalies neurologiques le donneur site4,5,6.

Le nerf artificiel — polyglycolique tube d’acide-collagène (PGA-C) a été développé au Japon. C’est un tube BIOABSORBABLES avec sa lumière interne rempli d’un collagène de spongiforme7. Lors des expérimentations animales, ce tube a été utilisé pour améliorer la régénération nerveuse chez le chien beagle avec défaut de nerf péronier et a été montré pour promouvoir le niveau de recouvrement supérieur de greffe nerveuse autologue8. L’application clinique de la PGA-C tube a commencé en 2002 chez des patients atteints de lésions des nerfs périphériques. En outre, les résultats cliniques favorables ont été obtenus dans le traitement des neuropathies trigéminales (IAN et le nerf lingual)9,10,11. Un facteur essentiel pour la régénération des nerfs réussie à l’aide de tubes PGA-C est des réserves de sang aux tissus environnants8. Bloc du ganglion sympathique cervical (CSGB) crée un blocage sympathique dans la région de la tête et du cou et augmente le flux sanguin vers la zone innervée respectifs12; ainsi, il a été utilisé dans le traitement du syndrome douloureux régional complexe et insuffisance circulatoire13,14,15. Toutefois, on a seulement quelques études expérimentales sur l’efficacité de l’ONGC en croissant sang écoulement16,17. Pour assurer une efficacité CSGB adéquate, le blocus doit être appliqué avec les anesthésiques locaux une ou deux fois chaque jour pendant plusieurs semaines, posant ainsi un défi lors de la génération de modèles animaux pour enquêter sur cette technique. Pour combler cette lacune, dans une étude précédente, nous avons développé un modèle canin de flux de sang accru à long terme dans la région d’orofacial18. Le modèle a été généré en effectuant un CSGB en injectant 99,5 % d’éthanol. Nous avons évalué le débit sanguin de la muqueuse buccale et la température de la peau nasale par débitmétrie Doppler laser et thermographie infrarouge une fois par semaine pendant 12 semaines. Nous avons constaté que la circulation sanguine de la région oro-faciale a été augmentée de 7 à 10 semaines dans ce modèle.

Dans la présente étude, nous avons évalué les effets du CSGB induite par l’éthanol sur la régénération des nerfs.
Le tube de la PGA-C a été implanté dans chiens beagle à travers un écart de 10 mm dans la gauche IAN. Une semaine plus tard, ONGC a été réalisée par l’injection d’éthanol. Trois mois après la chirurgie, nous avons réalisé diverses études électrophysiologiques, histologiques et morphologiques pour évaluer les effets de l’ONGC sur la régénération des nerfs. Nous fournissons un protocole détaillé pour la reconstruction de IAN en utilisant un tube de PGA-C et le CSGB induite par l’éthanol.

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Protocole

Cette étude a été réalisée conformément aux principes directeurs pour le soin et l’utilisation des animaux et approuvée par le Comité pour la recherche animale de l’Université de Kyoto (Kyoto, Japon ; numéro d’autorisation : R-16-16). Tous les efforts ont été faits pour réduire au minimum les souffrances animales, et toutes les sections du présent rapport adhèrent à l’arrivée (Animal Research : rapports d’expériences de in Vivo ) lignes directrices.

1. fabrication du tube PGA-C

  1. Pour fabriquer le conduit artificiel nerf au moyen d’un tube de (PGA) acid polyglycolique absorbable, utiliser une machine à tresser tubulaire équipée de 48 piles et cinq fibres PGA, composés de faisceaux de 26 filaments (Figure 1)18.
  2. Pour rendre la surface des tubes PGA hydrophile, l’exposer à une décharge de plasma.
  3. Utilisez 1 % v/w atélocollagène chlorhydrate solution7.
    Remarque : Atélocollagène est extrait de peau de porcine par traitement enzymatique et soumis à un contrôle de virus. Principalement, il se compose de type I (70 – 80 %) et7du collagène III, le rapport dont est décrit en détail ailleurs type. Préparer la solution de collagène en dissolvant collagène 1 g dans 100 mL de solution de chlorhydrate (pH = 3.0). Puisque la densité de la solution de chlorhydrate est environ 1.0, la concentration de collagène w/w est près de 1 %.
  4. Enduire le tube avec les couches de collagène en plongeant à plusieurs reprises dans la solution de chlorhydrate de collagène 1 % pendant 5 s chaque fois.
    1. Après trempage, sécher le tube sur un banc propre à température ambiante. Effectuer la prochaine immersion après s’être assuré que le tube est complètement sec (environ 6 h pour le séchage à l’air).
    2. Répétez le procédé de revêtement 10 fois.
  5. Sous réserve du tube de la PGA-C jusqu'à 140 ° C pendant 24 h sous vide (traitement de la dehydrothermal), afin de contrôler les bio-absorption et réticulation des molécules de collagène. Effectuer l’ensemble du processus dans des conditions aseptiques.
    Remarque : Cette procédure génère un tube de 50 μm d’épaisseur, diamètre intérieur de 3 mm et 14 mm longueur finale.

2. opération chirurgicale mise en place

  1. Utilisez des beagles mâles adultes pesant 9.0 à 13,0 kg.
    1. Abriter les animaux dans des cages séparées, dans des conditions contrôlées de chenil (cycle de lumière et l’obscurité de 12 h).
    2. Fournir de la nourriture solide et eau ad libitum.
  2. Peser les beagles.
  3. Stériliser tous les instruments chirurgicaux.
  4. Enfilez les gants stérilisés et désinfecter toutes les surfaces de la mise en fonctionnement avec une solution d’éthanol à 80 %. Jeter les gants utilisés.
  5. Effectuer le lavage chirurgical.
  6. Mettre sur un masque frais, blouse et des gants stériles.

3. l’anesthésie et préparation de la peau

  1. Anesthésier le chien avec un mélange de chlorhydrate de kétamine 5 mg/kg et de xylazine 1 mg/kg par injection intramusculaire.
  2. Intuber le malade par un tube trachéal de 7,5 mm de diamètre et 25 cm de longueur.
  3. Placez le chien sur le poste de latéral droit. Maintenir une anesthésie générale avec le sévoflurane 3,2 % avec de l’oxygène (1,0 L/min).
  4. Utiliser un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle à 37 ° C.
  5. Appliquer un gel ophtalmique sur la surface antérieure des yeux pour éviter l’abrasion cornéenne.
  6. Soigneusement raser le champ chirurgical (région de la poitrine côté gauche) à l’aide de tondeuses chirurgicales. Pulvériser une quantité substantielle de solution alcoolique sur le site opératoire. Attendez au moins 15 secondes Répétez l’application 3 fois.
  7. Enregistrer le rythme cardiaque et la saturation en oxygène au cours de la chirurgie.

4. inférieur alvéolaire nerf Reconstruction utilisant PGA-C tube : élaboration d’un modèle Reconstruction uniquement

  1. Injecter 3 mL de lidocaïne à 1 % à l’aide d’une aiguille de 27 G à la gencive mandibulaire gauche comme un anesthésique local et analgésique.
  2. Effectuer une incision transversale de 5 cm avec une lame de bistouri Swann-Morton numéro 15 dans la gencive mandibulaire gauche, d’exposer les mandibules de l’animal.
  3. Utiliser des vibrations ultrasoniques piézoélectriques pour broyer l’aspect proximal de la mandibule en un rectangle de 8 mm × 3 cm à travers le trou mentonnier postérieure.
    Remarque : La fréquence de vibration a été \u2012 28 32 kHz.
  4. Retirer la partie frontale de la plaque de l’os mandibulaire (dimensions, 3 cm x 8 mm) pour exposer la gauche IAN (Figure 2 a)18.
    Nota : Le site de reconstruction correspond à l’apex de la racine de la première molaire
  5. Transect le NIO avec un scalpel pour enlever un segment de 10 mm.
  6. Insérez les souches proximales et distales du nerf sectionné dans le tube de nerf à une profondeur de 2 mm.
  7. Utiliser des sutures en nylon de 8-0 et un microscope chirurgical à un grossissement de 8 X à suturer le tube au nerf proximal et distal termine (Figure 2 b)18.
  8. Retourner la plaque osseuse à son emplacement d’origine dans la mandibule.
  9. Refermer la plaie avec des sutures en nylon 4-0.
  10. Un jour après la chirurgie, confirment que la plaque de l’os mandibulaire est à sa place.
    1. 4.10.1 effectuer d’imagerie de la tomodensitométrie (TDM) de l’os du visage sous anesthésie. Définissez les paramètres CT comme suit : 120 kVp, 200 mAs, 0,5 mm/s, épaisseur de la tranche de 0,5 mm.
      1. Administrer l’anesthésie à l’aide d’un mélange de 5 mg/kg la kétamine chlorhydrate et 1 mg/kg xylazine (Figure 3).
  11. Administrer l’ampicilline (100 mg/jour) comme un antibiotique et de l’acétaminophène (100 mg/jour) comme analgésique pendant une semaine après la chirurgie.

5. induite par l’éthanol CSGB : développement de la Reconstruction + modèle CSGB

  1. Effectuer la reconstruction IAN tel que décrit à l’article 4 et prévoir une semaine pour la récupération.
  2. Anesthésier l’animal avec le sévoflurane 1,5 % dans l’air (6 L/min) et oxygène (4 L/min). Se raser et nettoyer le champ opératoire prévu, tel que décrit à l’article 3.
  3. Marquer la ligne d’incision avec un marqueur de peau chirurgical en traçant une ligne sur la poitrine du côté gauche (Figure 4, la ligne d’incision est 20 cm de longueur).
  4. Injecter 5 mL de lidocaïne à 1 % à l’aide d’une aiguille de 21 G à la poitrine du côté gauche comme un anesthésique local et analgésique.
  5. Inciser la peau côté gauche de la poitrine avec une lame de bistouri Swann-Morton numéro 10.
  6. Inciser la couche de graisse avec un bistouri électrique pour exposer l’aponévrose musculaire.
  7. Exposer le serratus ventralis muscle et le muscle scalenus.
  8. Soulever le serratus ventralis muscle et le muscle scalenus de ventral à dorsal pour exposer les deuxième et troisième côtes (Figure 5).
  9. Réaliser une thoracotomie latérale gauche à la deuxième et troisième espace intercostal pour exposer le ganglion sympathique cervical gauche (Figure 6).
  10. Injecter 0,2 mL de 99,5 % d’éthanol dans le ganglion sympathique cervical, à l’aide d’une aiguille de 30 G par visualisation directe (Figure 7).
  11. Fermer l’espace intercostal avec points de suture résorbable interrompu 1-0.
  12. Fermer la peau avec des mailles de nylon 3-0 interrompu.
  13. Administrer l’ampicilline (100 mg/jour) comme un antibiotique et de l’acétaminophène (100 mg/jour) comme analgésique pendant une semaine après la chirurgie.
  14. Après 1 semaine après CSGB, mesurer la température de la peau du visage avec la thermographie infrarouge pour confirmer l’ONGC.

6. les enregistrements électrophysiologiques

  1. Pour mesurer le potentiel d’action nerveux sensoriels (SNAP) et la vitesse de conduction de nerf sensitif (SCV) de l’IAN, trois mois après la reconstruction, anesthésier les animaux tel que décrit à l’article 3.
    NOTE : Accrochage / SCV doivent être mesurée sur les deux côtés de contrôle expérimental et normale pour chaque chien dans les deux groupes de traitement.
  2. Faites une incision dans la gencive mandibulaire gauche avec une lame de bistouri Swann-Morton numéro 10.
  3. Retirer délicatement la plaque osseuse mandibulaire pour éviter d’endommager physiquement le nerf régénéré.
  4. Stimuler l’IAN à l’aide d’une paire d’électrodes de l’aiguille, pour enregistrer le composant logiciel enfichable et SCV.
    1. Placer les électrodes dans la partie proximale de la gaine de nerf.
    2. Appliquer 10 kHz stimulus électrique 20 fois.
  5. Analyser les résultats.
    1. Déterminer SNAP en calculant l’amplitude de la réponse moyenne à la stimulation électrique.
    2. Mesurer la latence PIC et l’amplitude de crête de l’enregistrement graphique.
    3. Calculer l’indice de récupération avec l’équation suivante : amplitude de crête de la gauche IAN de la reconstruction seule ou reconstruction + CSGB group / pic amplitude du contrôle normal (segment central de l’IAN droit dans le groupe reconstruction uniquement)19 ,,20.

7. histologique analyse

  1. Section Préparation
    1. Trois mois après la reconstruction, récolter le IAN gauche, y compris à 1 cm du nerf de chaque côté du site reconstruit.
    2. Récolter le NIO bon au niveau correspondant au site de récolte sur le côté gauche.
    3. Faire précéder les nerfs récoltés par immersion dans le glutaraldéhyde à 2,5 % dans une solution de tampon de cacodylate de 0,1 M (pH 7,4, 48 ° C, 24h).
    4. Postfix avec solution à 2 % le tétroxyde d’osmium (48 ° C, 4 h) et ferrocyanure de potassium en solution de tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4, 2 h).
    5. Déshydrater les nerfs avec une série de solutions éthanoliques graduées.
    6. Incorporer en résine époxy (paraffine).
    7. La section les spécimens sur une épaisseur de 0,5 \u2012 1,0 μm.
  2. Bleu de toluidine coloration et morphologique
    1. Tacher les sections avec solution de bleu de toluidine.
    2. Obtenir des images de microscopie à l’aide d’un microscope optique, à un grossissement de X 400 dans les régions suivantes sur les échantillons : gauche IAN, le centre du segment régénérée et de 2 mm dans la partie distale de la souche ; IAN de droit, le centre du segment IAN correspondant au site de récolte sur le côté gauche.
    3. Sélectionnez des images de toutes les régions avec des fibres nerveuses régénérées.
      1. Au hasard de certaines zones de \u2012 10 8 μm 100 × 100 μm contenant du régénéré des fibres nerveuses.
      2. Effectuer des analyses morphologiques à l’aide d’un logiciel approprié pour mesurer les paramètres suivants : diamètre des fibres nerveuses myélinisées (μm) et la densité (nombre/zone), nerveuse pourcentage de tissu et G-ratio (axones myélinisés diamètre/myélinisées fibre nerveuse diamètre ).
  3. Immunomarquage
    1. Suivent des protocoles standards pour la coloration de la section de paraffine.
    2. Incubez avec des anticorps primaires pendant 30 min à 25 ° C.
    3. Laver avec une solution saline tamponnée au phosphate 3 fois à 25 ° C.
    4. Incuber les anticorps secondaire marqué à la peroxydase de raifort pendant 30 min à 25 ° C.
    5. Obtenir des images à l’aide d’un microscope optique.
  4. Microscopie électronique à transmission (TEM)
    1. Préparer les nerfs comme indiqué au point 7.1.
    2. Nerfs de section sur une épaisseur de 70 \u2012 90 μm à l’aide d’un ultramicrotome.
    3. Tacher les sections avec de Reynold citrate de plomb et d’uranyle.
    4. Examiner et image par microscopie électronique à transmission.

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Résultats

Nous avons observé une augmentation de la température de la peau du visage du côté bloqué 1 semaine après le CSGB gauche (Figure 8).

Reconstruction après 3 mois, le tube de la PGA-C à la zone de reconstruction a été absorbé et la régénération du nerf alvéolaire inférieur a été observée dans la reconstruction seule et reconstruction + CSGB groupes (Fig. 9 a, B

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Discussion

Nous présentons une méthode efficace pour la régénération de IAN en utilisant un tube de nerf biorésorbable en combinaison avec l’ONGC induite par l’éthanol. Pour cette étude nous avons utilisé les chiens, depuis d’autres modèles animaux, comme des souris, des rats et des lapins ont une courte espérance de vie et de la petite taille du corps et par conséquent ne peuvent servir à effectuer les interventions chirurgicales précises. Comme l’IAN se situe dans le canal mandibulaire entouré d’os, une technique chirurgicale est...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le ministère des organes bioartificiel à Kyoto University Institute for Frontier Science médicale. Nous tenons à remercier le personnel vétérinaire, de l’Institute for Frontier Science médicale.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
NMP Collagen PSNippon Meatpackers301-84621Atelocollagen extrait de la peau d’un jeune porc par traitement enzymatique
Tondeuses chirurgicalesRoboz Surgical Instrument CompanyRC-5903
Scalpel jetable (No.15)Kai medical219ABBZX00073000
VarioSurg3NakanishiVS3-LED-HPSC, E1133Chirurgie piézoélectrique de l’os traitement
4-0 sutures en nylonEthicon8881H
8-0 sutures en nylonEthicon2775G
Sulfate d’isépamicineNichi-Iko620005641
Scalpel jetable (n°10)Kai medical219ABBZX00073000
Aiguille de calibre 30Nipro1134
1-0 pointsrésorbablesEthiconJ347H
3-0 Coutures nylonEthicon8872H
Neo ThermoNEC AvioTVS-700Thermographie infrarouge.
Neuropack et Sigma ;NIHON KOHDENMEB-5504Enregistreur orthodromique pour l’enregistrement électrophysiologique
ToluidineBlue Sigma-AldrichT3260-5G
Microscope optiqueKeyenceBZ-9000
Anticorps monoclonal anti-protéine neurofilament humainsouris DAKON1591
Anticorps polyclonal anti-S100 de lapinDAKOZ0311
Microscopie électronique à transmissionHitachi High TechnologiesHitachi H-7000
Comptage dynamique des cellulesKeyenceBZ-H1CLogiciel pour l’évaluation morphologique

Références

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