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Article de méthode

Maintien des Cultures biologiques et mesurer l’Expression des gènes dans l’Aphis nerii: un système Non-modèle pour les Interactions plantes-insectes

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DOI :

10.3791/58044

⸱

31 août 2018

 ,  , 
1Biological Sciences Department, Vanderbilt University

Dans cet article

Résumé

Le puceron Aphis nerii colonise fortement défendues de plantes de la famille (Apocyanaceae) et offre de nombreuses possibilités pour étudier les interactions plantes-insectes. Nous présentons ici une série de protocoles pour l’entretien des plantes et des pucerons, cultures et la génération et l’analyse de moléculaire et données - omic pour a. nerii.

Résumé

Les pucerons sont excellents modèles expérimentaux pour une variété de questions biologiques allant de l’évolution des symbioses et le développement de polyphenisms aux questions entourant les interactions avec leurs plantes hôtes de l’insecte. Ressources génomiques sont disponibles pour plusieurs espèces de pucerons, et grâce aux progrès dans le séquençage de nouvelle génération, transcriptomique études sont étendus pour les organismes non-modèle qui manquent de génomes. En outre, cultures de pucerons soient collectées sur le terrain et élevés en laboratoire pour l’utilisation dans des expériences organismiques et moléculaires pour combler l’écart entre les études écologiques et génétiques. Enfin, beaucoup de pucerons peuvent être maintenus en laboratoire sur leurs plantes hôtes préférés dans le cycle de vie perpétuel, parthénogénétiques permettant des comparaisons de reproduction asexuée des génotypes. Aphis nerii, le puceron de l’asclépiade-lauriers roses, fournit un tel modèle pour étudier les insectes interactions avec des plantes toxiques à l’aide d’expériences moléculaires et organismiques. Méthodes pour la génération et l’entretien des cultures végétales et puceron dans l’expression différentielle de serre et en laboratoire, extractions d’ADN et d’ARN, l’analyse de microsatellites, Assemblée de transcriptome de novo et annotation, transcriptome l’analyse et la vérification de qPCR de gènes différentiellement exprimés sont décrites et discutées ici.

Introduction

Les pucerons sont de petits insectes hémimétaboles qui colonisent sur des familles de diverses plantes dans le monde entier. Ils sont distinguent par plusieurs caractéristiques, plus notamment leurs cycles de vie complexes impliquant la parthénogénèse cyclique et polyphenisms discrets et leurs symbioses nutritionnelles obligatoires avec endosymbiontes bactérie ou levure qui fournissent des éléments nutritifs manquant à partir leur alimentation d’usine sap1. Alors que la plupart des pucerons sont des spécialistes de plante hôte, certaines espèces généralistes sont des ravageurs de culture importante, infligeant des dégâts économiques considérables sur les cultures soit directement ou via les agents pathogènes et les virus ils vector2. La publication du premier génome du puceron en 2010, du puceron du pois Acyrthosiphon pisum3, a marqué un jalon important dans l’étude de la biologie de pucerons parce qu’il a fourni les ressources génomiques pour répondre aux questions au sujet de l’insecte adaptations pour les herbivores des modes de vie, y compris celles qui pourraient conduire à un meilleur contrôle des stratégies4. Depuis ce temps, des ressources supplémentaires de génomiques ont accumulé avec la publication d’un génome annoté pour le soja puceron Aphis glycines5et ressources accessibles tout le génome d’une autre espèce de trois-puceron (Myzus Cerasi (black cherry aphid), Myzus persicae (pêche-pomme de terre pucerons), Rhopalosiphum padi (cerisier des oiseaux-puceron)6. Ressources de transcriptomique précieux de novo sont disponibles aussi bien pour un certain nombre d’autres espèces de pucerons (e.g.,Aphis gossypii (puceron du cotonnier)7, Sitobion avenae (puceron des céréales)8, Cinara pinitabulaeformis (puceron du pin)9, Aphis nerii (puceron asclépiade-laurier-rose)10).

Les pucerons ont également une contribution durable à notre compréhension des interactions plantes-insectes et l’écologie de la vie sur plantes11. Un domaine où les pucerons ont apporté une contribution particulièrement importante est dans notre compréhension de l’écologie chimique des interactions plante hôte. Des adaptations expriment divers insectes herbivores pour vaincre les défenses végétales et certains même coopter des défenses de la plante pour leur propre bonheur12,13,14. Par exemple, le puceron de l’asclépiade-lauriers roses, Aphis nerii, est un brillant jaune, invasif puceron trouvé dans les régions tempérées et tropicales partout dans le monde qui colonise les plantes de la famille des asclépiades (Apocynaceae). Plantes de la famille des Apocynaceae ont évolué des défenses chimiques diverses, y compris le latex laiteux et des glucosides cardiotoniques, appelées cardénolides, qui lient le transporteur de cations Na, K-ATPase et sont des moyens de dissuasion efficaces au généraliste herbivores15, 16. spécialistes asclépiade expriment différents modes de résistance aux cardénolides, et certains sélectivement ou passivement accumulent ou modifient des cardénolides dans leurs tissus comme un moyen de dissuader les prédateurs ou d’autres avantages17. A. nerii est pensé pour séquestrer cardénolides de cette façon, même si les mécanismes et les avantages fonctionnels demeurent peu claires10,18.

Compte tenu des ressources génomiques à portée de main, a. nerii fournit un excellent modèle expérimental pour l’étude des mécanismes moléculaires et génétiques impliqués dans les interactions entre plantes hôtes toxiques et leur spécialiste chimio-écologiques herbivores. Il est à noter que, tandis que certains des premières études de a. nerii axé sur la séquestration des cardénolides19, depuis ce temps, études d’a. nerii ont permis de mieux comprendre un large éventail de questions écologiques et évolutionnaires, y compris la structure génétique des insectes envahissants20 et l’interaction entre la réglementation ascendantes et descendantes sur les herbivores densité21. A. nerii est donc un bon candidat comme modèle expérimental pour un ensemble particulièrement large d’études des interactions plantes-insectes. Critique au succès de toute étude avec a. nerii est la culture attentive du puceron des populations, qui comprend la culture des plantes dont dépendent les pucerons, mais aussi à une production efficace des données de haute qualité - omic. Notre but est de guider le lecteur à travers les deux. Décrites ci-dessous sont des méthodes pour la génération et l’entretien des cultures végétales et pucerons dans la serre et laboratoire, ADN et ARN extractions, analyses microsatellites, Assemblée de transcriptome de novo et annotation, transcriptome analyse de l’expression différentielle et la vérification de qPCR de gènes différentiellement exprimés. Alors que ces méthodes soient écrits pour a. nerii, les méthodes de culture, d’extraction et analyse générales peuvent étendre à un éventail d’espèces de pucerons.

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Protocole

1. Cultures de plantes

  1. Acheter graines de n’importe quel fournisseur commercial ou recueillir des plantes matures dans le domaine.
    Remarque : Ce protocole est convenable pour la plupart des espèces d’asclépiade disponibles dans le commerce (p. ex., Asclepias incarnata, a. syriaca, a. curassavica, Gomphocarpus physocarpus). Certaines graines peuvent devoir être stratification froide et instructions du fournisseur de semences doivent être vérifié.
  2. Plantez les graines dans une terre fine en germination (60 – 70 % fine mousse de tourbe, perlite, vermiculite, calcaire).
    1. Remplissez un bac standard de semis avec de la terre de mélange de germination ; veiller à ce que le sol a atteint le sommet des puits. Dans chaque puits, faites une entaille pour créer un trou dans le sol sur un profondeur de 3 cm.
    2. Placez une graine dans chaque trou et de l’eau très bien avec un arrosoir tel que le sol couvre les graines et est saturé.
    3. Élever des graines en serre (voir conditions ci-dessous, 1.5). L’eau régulièrement, tous les jours aux autres-quotidien ; suffisant pour maintenir l’humidité du sol à un niveau modéré.
  3. Lorsque les plantules ont cultivé leur premier jeu de feuilles entières, semis de re-pot dans un terreau générales mix (50 – 60 % tourbe, écorce et calcaire) (Figure 1A).
    1. Utilisez 4 pouces pots ronds qui cadrent avec un joint étanche avec les cages de coupe. Remplir de terreau général jusqu'à environ 5 cm du bord.
    2. Créer un trou dans le sol profond suffisant pour atteindre le fond du pot.
    3. Avec la main, doucement ramasser le plant mature de son puits et placez-le à l’intérieur du trou dans le pot de 4 pouces. Couvrir le semis avec de la terre. Eau très bien.
    4. Faire pousser des plantes dans la serre et de l’eau régulièrement, tous les jours à tous les autres jours ; suffisant pour maintenir l’humidité du sol modérée.
  4. Conditions de serre.
    1. Réglez les thermostats à effet de serre pour maintenir les températures diurnes entre 18 et 28 ° C et des températures nocturnes entre 16 et 22 ° C en utilisant les instructions du fabricant.
    2. Pendant les mois d’hiver lorsque les jours sont plus courts, Supplément à la lumière du jour avec des ampoules de haute pression sodium 600 W (12 h, 08:00 – 20:00).
  5. Lutter contre les ravageurs indésirables (p. ex., thrips, pucerons) avec une solution de savon bio foliaire, cependant, utiliser ces produits avec prudence.
    1. Faire de l’eau savonneuse selon la recommandation du manufacturier et s’appliquent à l’aide d’un vaporisateur.
    2. Laissez le savon sur les plantes pour 4 à 24 h. Rincer doucement les plantes avec de l’eau pour enlever la savon 4 à 24 h après l’application et rincez-les à l’eau une deuxième fois à avant utilisation avec cultures de puceron du laboratoire.
  6. La population moyenne de pucerons sur des plantes qui ont grandi au moins 3-4 séries de feuilles entières et sont au moins 10 cm de hauteur (Figure 1B) de la culture.

2. puceron Cultures

  1. Démarrer les populations de pucerons de laboratoire provenant d’une population d’isoclonal de laboratoire existants ou bien les pucerons récoltés sur le terrain suivant les indications ci-dessous.
    1. Lors du démarrage d’une population de laboratoire provenant d’une population d’isoclonal de laboratoire existants, transférer les pucerons comme décrit dans 2.3.1–2.3.3.
  2. Quand commence la nouvelle isoclonal, les populations de pucerons récoltés sur le terrain et placer un puceron unique, reproduction, adult sur une plante hôte approprié comme indiqué au point 1.6 de l’étape.
    Remarque : On peuvent commencer les Populations d’ailes (alate) ou les adultes (aptères).
    1. Inspecter manuellement les plantes de la serre pour des parasites indésirables avant l’utilisation avec les pucerons de laboratoire. Geler les plants avec des pucerons indésirables. Si vous le souhaitez, utilisez une fiole à vide éthanol pour supprimer les thrips ou autres parasites.
      Remarque : N’oubliez pas de rincer les plantes qui ont été traités avec préalable de savon à utiliser comme indiqué au point 1.5.2.
    2. Transfert en toute sécurité en un seul puceron adult à l’aide d’un pinceau ou une pipette de bouche créé avec l’ID 3/16" x tube en plastique 1/4" OD, une pointe de pipette 1 000 µL et une pointe de pipette 2,00 µL (Figure 2A).
    3. Bien couvrir plantes à pucerons avec une cage de coupe créée avec un gobelet en plastique avec le haut coupé, recouvert d’une maille fine et fixés avec du ruban adhésif (Figure 2B).
    4. Placer les plantes infestées de pucerons dans un plateau et garder dans une chambre à environnementale contrôlée (16 L : 8, 22 ° C, 70 % d’humidité).
  3. Pour maintenir les populations de stock, transfert pucerons à nouvelle plantes chaque semaine (2.2.1–2.2.3).
    1. Transfert en toute sécurité 1 – 3 2ème ou 3rd stade larvaire nymphes et 1 adulte âge pucerons à l’aide d’une pipette de bouche (Figures 2 a, 3).
      Remarque : Les Stocks sont mieux maintenus en transférant les individus.
    2. Bien couvrir les plantes infestées de pucerons avec une cage de coupe créée avec un gobelet en plastique avec le haut coupé, recouvert d’une maille fine et fixés avec du ruban adhésif.
    3. Placer les plantes dans un plateau et garder les pucerons dans une chambre (16 L : 8, 22 ° C, 70 % d’humidité).
    4. Alternativement, si vous le souhaitez et si la plante-hôte est de bonne qualité, utilisez une fiole à vide éthanol pour réduire les populations de laisser reproduire qu’un adulte et deux ou trois 2ème ou 3ème stade larvaire nymphes.
  4. Pour créer les mêmes populations d’âge pour l’utilisation dans des expériences, placez jusqu'à 5 adultes (préférence aptère) de la population de stock sur une nouvelle plante hôte.
    1. Retirez les adultes 24 h plus tard.
    2. Environ 5 à 7 jours plus tard, une fois que la progéniture de1 F ont mûri à l’âge adulte, placez jusqu'à 5 adultes de1 F aptère sur une nouvelle plante hôte. Retirez les adultes 24 h plus tard.
    3. Une fois que la population de2 F a mûri à l’âge adulte, cette population est prête à être utilisé dans des expériences.
      Remarque : Ce processus fait en sorte que la population expérimentale est à peu près le même âge et sont nés de mères d’âge à peu près la même.
  5. Confirmer les différences génotypiques entre lignes isoclonal capturés à l’aide de génotypage de microsatellites (décrit ci-dessous, Sections 3 et 4).

3. Extraction d’ADN

  1. Préparation
    1. Les techniques stériles permet de préparer le tampon de lyse 1 L (0,1 M NaCl, 0,2 M de sucrose, 0,1 M Tris (pH 9,1), EDTA 0,05 M, 0.05 % SDS).
    2. Réchauffer le bloc chauffant ou bainmarie à 65 ° C.
  2. Lyse et homogénéisation des tissus
    1. Placez le puceron près du fond d’un tube de microtubes de 1,5 mL stérile.
    2. Installez le pilon stérile dans le tube avec le puceron et plonger le fond du tube dans l’azote liquide.
      NOTE : Désintégration des tissus optimale est obtenue lorsque le puceron est positionné entre le pilon et le côté du tube.
    3. Moudre le puceron avec le pilon à initialement lyser les cellules.
    4. Pour un seul puceron adult, utilisez 200 µL (divisé en 2 x 100 µL d’extraits) de la mémoire tampon de lyse. Ajouter l’aliquote première pour broyer et remettre en suspension le puceron écrasé jusqu'à ce que l’échantillon est visiblement désintégré, puis utilisez la deuxième portion de laver le pilon.
    5. Incuber les pucerons écrasées dans le tampon de lyse à 65 ° C dans le bloc de baignoire ou de la chaleur de l’eau pendant 30 min.
  3. Précipitation de l’ADN
    1. Pendant que le tube est tiède, ajouter 14 µL de 8 M KOAc. Il faut inverser le tube pour mélanger. Conserver l’échantillon sur la glace pendant 30 min.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici, et les échantillons peuvent être conservés à-20 ° C jusqu'à 24h.
    2. Centrifuger à 13 000 x g pendant 15 min à température ambiante. Transférer le surnageant à nouveau tube de 1,5 mL avec une pipette. Veillez à ne pas supprimer n’importe lequel des débris granulés.
    3. Pour améliorer la visualisation de l’ADN pellet, ajouter 2 glycogène µL (20 µg/mL) au surnageant. Si la taille de l’échantillon est suffisamment grande, omettez cette étape.
    4. Ajouter 200 µL d’éthanol de qualité moléculaire froid 100 % pour le surnageant. Inverser les tubes pour mélanger et laisser incuber à température ambiante pendant au moins 15 min.
      NOTE : Le protocole peut être suspendu ici, et les échantillons peuvent être conservés à-20 ° C jusqu'à 24h.
    5. Centrifuger à 13 000 x g pendant 15 min à température ambiante. Éliminer l’éthanol de pipetage.
  4. Élution et lavage de l’ADN
    1. Ajouter 200 µL d’éthanol froid de moléculaire-grade 70 %. Puis mettez le tube afin de remettre en suspension et laver le culot.
    2. Centrifuger à 13 000 x g pendant 5 min. Tout en visualisant le culot, retirez l’éthanol en pipettant également soigneusement et ajouter 200 µL d’éthanol de qualité moléculaire froid 100 %.
    3. Centrifuger à 13 000 x g pendant 5 min. Tout en visualisant le culot, retirer soigneusement l’éthanol par pipetage.
      NOTE : Répéter le 100-70-100 éthanol cycle de lavage si nécessaire.
    4. Sécher à l’air les boulettes pendant 5 – 10 min avec la pose de tube ouvert horizontalement sur un papier de soie.
    5. Resuspendre le culot d’ADN dans 80 µL de faible TE (10 mM Tris-HCl 0,1 mM EDTA).
    6. Quantifier l’ADN extrait à l’aide d’un spectrophotomètre.
    7. Conserver à 4 ° C.

4. Microsatellite PCR et séquençage pour le génotypage de pucerons

  1. Commander les amorces appropriées de F et R pour microsatellite séquençage (tableau 1,20).
    NOTE : Séquences d’amorces inverse doivent être modifiés avec des étiquettes fluorescentes 5'-6-FAM ou 5'-5-HEX pour permettre multiplexés échantillons pour le séquençage de microsatellites.
  2. Effectuer des PCR avec des échantillons d’ADN unique puceron (décrits à la Section 3) et amorces microsatellites fluorescent étiquetés.
    1. Mélanger les réactions de PCR selon le protocole du fabricant (amorce de 0,2 µM de chaque F/R, 2,5 mM MgCl2, matrice d’ADN de 50 à 200 ng).
    2. Utilisez les paramètres suivants du thermocycleur : dénaturation initiale 94 ° c pendant 4 min, 35 cycles de 94 ° C pendant 30 s, 58 ° C pendant 35 s, 72 ° C pendant 45 s et une étape d’élongation finale à 72 ° C pendant 10 min.
  3. Combiner des échantillons PCR avec différentes balises fluorescentes pour réduire le nombre d’échantillons séquencé et séquencer les échantillons de microsatellites dans un centre de génotypage.
  4. Analyser les fichiers de l’échantillon brut de .fsa à l’aide du logiciel d’analyse de microsatellites.

5. Extraction de l’ARN

  1. Prélever des échantillons des pucerons pour extraction de l’ARN en 1,5 mL RNase / DNase-free tubes et gel immédiat dans l’azote liquide.
    Remarque : Si les étapes suivantes ne sont pas exécutées immédiatement, les échantillons peuvent être conservés à-80 ° C.
  2. Homogénéisation de tissu
    1. Avec le pilon stérile dans le tube avec le puceron, congélation dans l’azote liquide pendant 10 à 15 secondes, jusqu'à ce que le grésillement d’arrêt échantillon. Écraser le puceron du bien avec le pilon, comme indiqué au point 3.2.
      NOTE : Désintégration des tissus optimale est obtenue lorsque le puceron est positionné entre le pilon et le côté du tube.
    2. Sous la hotte, ajoutez 800 µL de réactif de thiocyanate-phénol-chloroforme extraction de guanidinium de l’échantillon (pucerons adultes 1 – 5). Homogénéiser les échantillons avec le pilon et le jeter le pilon.
  3. Séparation de phase
    Remarque : Toutes les étapes devraient être effectuées sous une hotte.
    1. Incuber les échantillons homogénéisés pendant 5 min à température ambiante. Ajouter 160 µL du chloroforme à échantillon. Agiter vigoureusement à la main pendant 15 s.
    2. Incuber pendant 2-3 min à température ambiante. Centrifuger pendant 15 min à 12 000 x g à 4 ° C.
      Remarque : Après centrifugation, le mélange se sépare en 3 couches : une phase inférieure, rouge de phénol-chloroforme, une interphase et une phase aqueuse supérieure incolore. L’ARN reste exclusivement dans la phase aqueuse. Le volume de l’humeur aqueuse sera ~ 480 µL.
  4. Précipitation d’ARN
    1. Sous une hotte, transférer la phase aqueuse dans un tube frais, RNase-libre. Ne pas déranger la phase intermédiaire.
    2. Précipiter l’ARN en ajoutant 400 µL d’isopropanol et incuber les échantillons à-20 ° C pendant 10 min.
      NOTE : Le protocole peut être suspendu ici, et les échantillons peuvent être conservés à-20 ° C jusqu'à 24h.
    3. Centrifuger l’échantillon pendant 10 min à 12 000 x g à 4 ° C.
  5. Élution et lavage de RNA
    1. Retirez le surnageant ; Surveillez le culot de RNA.
    2. Laver le culot de RNA avec 1 mL d’éthanol à 75 % dans l’eau traitée DEPC. Mélanger par agitation lente. Centrifuger pendant 5 min à 7 500 g à 4 ° C.
    3. Répétez les étapes 5.5.1–5.5.2 pour aider à éliminer les contaminants de phénol.
    4. Retirez le surnageant et le culot pendant 5-10 min avec pose de tube ouvert horizontalement sur un banc stérile sécher à l’air. Ne laissez pas le culot de RNA sécher complètement.
    5. Dissoudre le culot de RNA dans 30 µL d’eau exempte de RNase ou traitée DEPC. Pipetez doucement de haut en bas pour mélanger. Incuber à 55-60 ° C pendant 10 à 15 min.

6. RNAseq De Novo Transcriptome Assemblée, Annotation et l’analyse de l’Expression différentielle

  1. Analyser la concentration d’ARN échantillon et de la qualité en utilisant un système d’électrophorèse capillaire axée sur la puce.
    NOTE : Un système d’électrophorèse capillaire puce est la méthode préférable de choix que d’analyser avec un spectrophotomètre, car il fournit une mesure plus précise et sensible de la concentration d’ARN et de la qualité.
    1. Si les échantillons sont de qualité appropriée (≥ 250 ng total, RIN (ARN intégrité nombre) ≥ 5), réaliser le séquençage RNA.
      NOTE : Ce qui est important, parce que ces données de séquençage serviront pour les deux Assemblée de transcriptome de profilage et de novo expression, plus lire profondeur se traduira par un transcriptome de qualité supérieur. Pour un ensemble assez complet à l’aide de la technologie de séquençage Illumina, bp 100 100 millions, appariés fin lectures serait un point de départ recommandé. Préparation de bibliothèque des ARNm totale et le séquençage de RNA ont été effectuées par un centre de séquençage.
  2. Vérifier la qualité des lectures à l’aide de Fast QC22.
  3. Combinez toutes les lectures de l’échantillon et assembler le transcriptome de novo à l’aide de Trinity23,24 (Trimmomatic qualité filtrage activé).
  4. Affiner l’Assemblée
    1. Transdecoder25 permet d’identifier des cadres de lecture ouverts (ORF) qui sont un minimum de 100 acides aminés.
    2. Effectuer des recherches d’homologie de l’ORF traduit contre Pfam26 et UniProt27 bases de données à l’aide de BLASTP28 et29de HMMER, respectivement.
    3. Supprimer les transcriptions bactériennes (n’importe quelle séquence traduit dont BLAST meilleur touché était un gène bactérien avec un score de bit de plus de 300 et une identité de séquence d’acide aminés minimal de 50 %).
    4. S’effondrer toute ORFs complets, traduits qui sont au moins 99 % identique au niveau d’acides aminés à l’aide de CD-HIT30.
    5. L’ORFs restants, incomplètes qui sont identiques d’au moins 95 % à l’échelle de nucléotides à l’aide de CD-HIT30de l’effondrement.
    6. Assigner les séquences nucléotidiques restants avec des identificateurs uniques, propres à chaque espèce (par exemple, APHNE 0001).
  5. Évaluer l’intégralité de l’assembly raffiné, à l’aide de BUSCO (http://busco.ezlab.org/) et les arthropodes gène dataset31.
  6. Annotation de transcriptome
    1. Tout d’abord, annoter le transcriptome raffiné à l’aide de HMMER contre le Pfam base26,29.
    2. Deuxièmement, annoter le transcriptome utilisant BLASTP contre le de27,de base de données UniProt28.
    3. En troisième lieu, annoter le transcriptome utilisant BLASTP contre les séquences codantes d’insectes sélectionnés aux génomes publiés, annotés.
    4. Enfin, annoter le transcriptome utilisant BLASTP contre le pois puceron de la protéine de base de données uniquement.
    5. Utilisez Trinotate pour générer les annotations de GO de UniProt accessions.
    6. Trinotate permet d’organiser tous les résultats de l’annotation dans une base de données SQLite et générer un rapport de l’annotation.
  7. Analyse de l’expression différentielle
    Remarque : En prenant comme référence le transcriptome raffiné, aligner et quantifier chaque bibliothèque séparément.
    1. Trimmomatic utilisation de filtres de qualité et garniture l’original lire fichiers32.
      Remarque : Si vous effectuez cette étape après une Assemblée de la Trinité, on peut employer à la place la sortie Trimmomatic de cette étape.
    2. Effectuer des alignements les pour chaque échantillon à l’aide de Bowtie233.
    3. Extraire les comtes de lecture de chaque échantillon individuellement à l’aide de SAMtools34.
    4. Calculer l’expression différentielle entre les échantillons d’intérêt en utilisant DESeq2 avec les paramètres par défaut et un paramétrique monter35.

7. qPCR vérification de gènes différentiellement exprimés

Remarque : Si les utilisateurs sont intéressés par des gènes exprimés différemment de leurs expériences de RNAseq, le protocole suivant peut être utilisé pour vérifier les profils d’expression différentielle.

  1. Générer des échantillons d’ARN comme décrit ci-dessus (étape 5).
  2. Quantifier les extractions de RNA à l’aide d’un spectrophotomètre pour vérifier la qualité et à obtenir la concentration.
  3. Synthétiser les ADNc des échantillons à l’aide d’un kit disponible dans le commerce conformément à la recommandation du manufacturier.
  4. Déterminer l’efficacité de l’apprêt pour gènes présentant un intérêt pour l’amplification PCR double précise.
    1. Basé sur les concentrations de RNA originales, effectuer des dilutions successives (101) d’obtenir 3 concentrations de cDNA.
    2. À l’aide d’un mélange maître de PCR quantitatif, mélanger en triple qPCR réactions selon le protocole du fabricant à l’aide de trois concentrations de primer (par exemple, 100 nM, 200 nM, 300 nM) avec trois concentrations de cDNA en série dilué (p. ex., 0,1 ng/µL, 10 ng/µL, 100 ng/µL).
    3. Pour chaque gène cible, calculer la pente (m) de la ligne créée en utilisant les valeurs moyennes det C pour chaque échantillon comme variables dépendantes et le log (concentration de cDNA) comme variables indépendantes (trois points au total).
    4. Utilisez l’équation suivante pour calculer l’efficacité d’apprêt (E) où m est la pente calculée en 7.4.3 :
      E = 10^(-1/m)
      Remarque : L’efficacité primaire entre 90-110 % conviennent pour analyses. Ce procédé assure une amplification égale de tous les gènes inclus dans les calculs.
  5. Utilisez la méthode det ΔΔC avec un gène de ménage pour quantifier l’expression différentielle des gènes d’intérêt36.

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Résultats

Planter des cultures : Les graines prendront environ deux à quatre semaines, selon la saison, pour grossir suffisamment pour être re-pot (Figure 1A). Re-en pot de semis prendra encore deux à quatre semaines pour atteindre une taille optimale pour les cultures de pucerons (Figure 1B).

Cultures de pucerons :

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Discussion

Il a longtemps été reconnu que l’aposématiques nerii a. peut apporter un éclairage sur les modèles et les mécanismes de résistance aux défenses de la plante et particulièrement chimique séquestration du18,37. Un certain nombre de ressources génomiques ont récemment émergé pour a. nerii10, offrant de nouvelles possibilités pour des études de génomique écologiques et fonctionnels qui utilisent nerii a. comme un mod...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier Michelle Moon (Vanderbilt University) pour une assistance avec la photographie. Soutien de l’Université Vanderbilt fourni PA et SSLB est pris en charge par DGE-1445197.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Sun Gro Fafard GerminationHummert International10-0952-2
Sun Gro Fafard 3B/ Metro MixHummert International10-0951-2
2 » x 4 » Pot Standard RondAnderson Pots1503
DreamTaq DNA PolyméraseThermoFisher ScientificEP0701
TrizolThermoFisher Scientific
SuperScript® ; III Kit de synthèse premier brinThermoFisher Scientific18080051
Power SYBR Green PCR Master MixThermoFisher Scientific4367659
Mix 15596026

Références

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