Seule goutte numérique PCR pour la détection complète et simultanée des Mutations dans les régions de Hotspot

Résumé

Nous présentons ici un protocole visant à quantifier avec précision les multiples altérations génétiques d’une région cible en une seule réaction à l’aide de Drop-off ddPCR et une paire de sondes d’hydrolyse.

Résumé

Gouttelette numérique polymérisation en chaîne (ddPCR) est une méthode de réaction en chaîne (PCR) ultrasensible polymérase quantitative basée sur le fractionnement des échantillons dans des milliers de taille nanométrique de réactions individuelles eau-dans-huile. Récemment, ddPCR est devenu un des outils plus précis et plus sensibles pour la détection de l’ADN (ADNct) tumeur en circulation. Une des principales limites de la technique standard ddPCR est le nombre limité de mutations qui peut être projeté par réaction, comme les sondes d’hydrolyse spécifiques reconnaissant chaque version allélique possible sont nécessaires. Une autre méthode, le drop-off ddPCR, augmente le débit, car il ne nécessite qu’une seule paire de sondes pour détecter et quantifier potentiellement toutes les altérations génétiques dans la région ciblée. Drop-off ddPCR affiche une sensibilité comparable aux déterminations ddPCR classiques avec l’avantage de détecter un plus grand nombre de mutations dans une seule réaction. Il est rentable, conserve de précieux échantillons et peut aussi servir comme un outil de découverte lorsque les mutations ne sont pas connues a priori.

Introduction

Des milliers de mutations somatiques liées au développement du cancer ont été signalés¹. Parmi ceux-ci, quelques-uns sont des marqueurs prédictifs de l’efficacité de la thérapie ciblée ^2,3 et dépistage de ces mutations génétique est pratique clinique de routine maintenant. Gouttelette numérique technologie PCR (ddPCR) peut être utilisée pour surveiller la présence ou l’absence de mutations avec une précision de détection élevé et est hautement compatible avec biopsies liquide non invasif^4,5. Cependant, les tests de ddPCR actuell....

Protocole

Le protocole présenté ici suit les directives d’éthique de l’Institut Curie. Tous les échantillons humains provenaient de patients inscrits, après consentement éclairé, dans études approuvées par le Conseil d’examen institutionnel à l’Institut Curie.

1. collecte, stockage de Plasma et l’Extraction d’ADN acellulaire de sang

NOTE : ADN extrait de n’importe quel type de « tissu » peut être utilisé (p. ex., frais ou formaldéhyde-correction paraffine embarqué des tissus (FFIP), les cellules dans les échantillons de culture ou de sang). Ici, nous fournissons des instructions détaillées pour la collecte de sang, ....

Résultats

Dans une étude de validation, des mutations exon 2 KRAS (codons 12 et 13) et EGFR exon 19 suppressions ont été étudiées en tissus FFPE et échantillons plasmatiques provenant de patients atteints de cancer en utilisant le dépôt ddPCR stratégie⁶.

La sonde de déclin KRAS interrogé une région bp 16 englobant plusieurs mutations dans l’exon 2 du gène KRAS , qui abritent plus.......

Discussion

Pour concevoir un test de ddPCR déclin efficace, l’optimisation est cruciale, et le protocole doit être suivi attentivement. Chaque combinaison des amorces et des sondes a une efficacité de réaction PCR unique. Ainsi, une analyse individuelle doit être soigneusement validés sur des échantillons de contrôle avant d’être utilisé sur des échantillons d’essai précieux. Optimisation et validation sont importantes pour certifier la détection de signal de crête et évaluer la spécificité et la sensibilité. Comme décrit dans le p.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube K2EDTA (code couleur : lavande)	Les		tubes BD 367863 EDTA sont utilisés pour obtenir un échantillon de sang total ou de plasma EDTA
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (protocole manuel)	Qiagen	55114	Pour l’isolement de l’ADN circulant libre du plasma humain
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (protocole automatisé)	Qiagen	937556	Pour l’isolement de l’ADN circulant libre du plasma humain
QIAsymphony SP system	Qiagen	9001297	système entièrement intégré et automatisé pour la purification de l’ADNcf, de l’ADN ou de l’ARN
QIAvac 24 Plus	Qiagen	19413	Pour la purification simultanée de jusqu’à 24 cfDNA
Fluorimètre Qubit	Invitrogen	Q33226	Le fluorimètre Qubit est un fluorimètre de paillasse pour la quantification de l’ADN
Lecteur QX100 ou QX200	Bio-Rad	186-3003 ou 186-4003, respectivement	Le lecteur mesure l’intensité de fluorescence de chaque gouttelette et détecte la taille et la forme lorsque les gouttelettes passent devant le détecteur
Générateur de gouttelettes QX100 ou QX200	Bio-Rad	186-3002 ou 186-4002, respectivement	Instrument utilisé pour la génération de gouttelettes
Thermocycleur C1000	Bio-Rad	1851196	Plate-forme modulaire de thermocycleur, comprend un châssis de thermocycleur C1000 Touch, un module de réaction rapide à 96 puits
Scelleuse de plaques	Bio-Rad	181-4000	PX1&commerce ; Porte-cartouche de scelleuse de plaques PCR
DG8	Bio-Rad	186-3051	Positionne et maintient la cartouche DG8 dans l’instrument pour la génération
de gouttelettes Cartouches génératrices de gouttelettes et joints	Bio-Rad	186-4007	Cartouche microfluidique DG8 utilisée pour mélanger l’échantillon et l’huile afin de générer des gouttelettes ; Les joints DG8 scellent la cartouche pour empêcher l’évaporation et appliquer la pression requise pour la formation de gouttelettes
PCR supermix	Bio-Rad	186-3010	ddPCR supermix pour sondes (pas de dUTP)
Plaques PCR à 96 puits	Eppendorf	951020362	Plaques semi-jupes à 96 puits
Étanchéité en feuille	Bio-Rad	181-4040	Membrane perçable Thermoscellage
ddPCR Lecteur de gouttelettes Huile	Bio-Rad	186-3004	huile utilisée dans le lire
Huile de génération de gouttelettes pour sondes	Bio-Rad	186-3005	huile pour la génération de gouttelettes
DNA loBind Tube 1,5 mL	Eppendorf	0030 108.051	Les tubes Eppendorf LoBind maximisent la récupération de l’échantillon en réduisant considérablement la liaison de l’échantillon à la surface
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set	HORIZON	HD780	Les étalons de référence Multiplex I cfDNA sont des matériaux de référence hautement caractérisés et biologiquement pertinents utilisés pour évaluer les performances des tests d’ADNcf qui détectent les mutations somatiques
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500	Life Technologies	Q32854	Le test HS est hautement sélectif pour l’ADN double brin (ADNdb) par rapport à l’ARN et est conçu pour être précis pour les concentrations initiales d’échantillons à partir de 10 pg/µ ; L à 100 ng/µ ; L
Qubit Assay Tubes Life Technologies		Q32856	Les tubes de dosage Qubit sont 500 & micro ; Tubes en polypropylène à paroi mince L à utiliser avec le fluorimètre Qubit