Article de méthode

Multimodal bioluminescentes et émission positronique tomographie/Computational imagerie par tomographie des xénogreffes de moelle osseuse de myélome Multiple chez les souris NOG

DOI :

10.3791/58056

⸱

7 janvier 2019

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1Greater Los Angeles Veteran Administration Healthcare System, 2San Diego Veterans Administration Healthcare System, 3University of California, Los Angeles, 4Perkin Elmer

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici nous utilisons bioluminescent, radiographie et tomographie par émission de positons/calculé tomographie imaging pour étudier comment inhiber l’activité mTOR impacts tumeurs myélome de la moelle osseuse-implanté dans un modèle de xénogreffe. Cela permet des analyses physiologiquement pertinents, non invasif et multimodales de l’effet anti-myélome de thérapies ciblant myélome de la moelle osseuse-greffée tumeurs in vivo.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myélome multiple (MM) tumeurs greffer dans la moelle osseuse (BM) et leur survie et leur évolution dépendent des interactions moléculaires et cellulaires complexes qui existent au sein de ce micro-environnement. Pourtant, le microenvironnement de la BM ne peut pas être aisément répliquée in vitro, qui limite potentiellement la pertinence physiologique de nombreux modèles expérimentaux in vitro et ex vivo . Ces problèmes peuvent être surmontés en utilisant un modèle de xénogreffe dans laquelle luciférase (LUC)-les cellules transfectées de 8226 MM seront spécifiquement greffer dans le squelette de souris. Lorsque ces souris sont donnés le substrat approprié, D-luciférine, les effets du traitement sur la croissance tumorale et la survie peut être analysé en mesurant les changements dans les images bioluminescents (BLI) produites par les tumeurs in vivo. Ces données BLI combinée à une analyse de positons (TEP/CT) tomographie d’émission positronique/calcul utilisant le marqueur métabolique 2-désoxy - 2-(18F) fluoro-D-glucose (18F-FDG) est utilisé pour surveiller les changements dans le métabolisme de la tumeur au fil du temps. Ces plates-formes d’imagerie permettent de multiples mesures non invasives dans le microenvironnement tumoral/BM.

Introduction

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MM est une maladie incurable, formée de plasma maligne B-cellules qui infiltrent le BM et causer la destruction osseuse, anémie, insuffisance rénale et l’infection. MM fait jusqu'à 10-15 % des hémopathies malignes1 et est le cancer le plus fréquent d’associer le squelette2. Le développement de MM provient de la transformation oncogénique des cellules de plasma longue durée de vie qui sont établies dans les centres germinatifs des tissus lymphoïdes, avant finalement d’autoguidage à la BM3. Le BM est caractérisée par des niches très hétérogènes ; y compris les composants cellulaires diverses et critiques, régions de faible pO2 (hypoxie), vascularisation vaste, complexes matrices extracellulaires et réseaux de cytokines et du facteur de croissance, qui contribuent tous à MM tumorigenèse4. Ainsi, l’élaboration d’un modèle de xénogreffe MM disséminée caractérisée par des tumeurs qui sont strictement implantés dans la BM serait un outil très puissant et cliniquement pertinent pour étudier MM pathologie en vivo5,6. Toutefois, les nombreux obstacles techniques peuvent limiter l’efficacité de la plupart des modèles de xénogreffes, ce qui les rend coûteuse et difficile à appliquer. Cela inclut les problèmes liés à la prise de greffe tumorale cohérente et reproductible dans le créneau de la BM, un temps prolongé pour le développement de tumeurs et les limites dans la capacité d’observer et de mesurer l’évolution de la croissance tumorale et de survie sans devoir directement sacrifier la souris au cours de l’expérience7,8.

Ce protocole utilise un modèle de xénogreffe modifié qui a été initialement développé par Miyakawa et al. 9, dans lequel un défi (IV) par voie intraveineuse avec des cellules de myélome se traduit par « diffusion » tumeurs qui systématiquement et de façon reproductible greffer dans le BM de NOD/SCID/IL-2γ(null) (NOG) souris10. La visualisation in situ de ces tumeurs est obtenue par la transfection stable de la lignée de cellule MM humaine 8226 avec un allèle LUC et de mesure en série les changements dans le BLI produites par ces cellules de tumeur implantée6. Ce qui est important, ce modèle peut être étendu pour utiliser divers autres exprimant le LUC MM lignées de cellules humaines (p. ex., U266 et OPM2) ayant une propension similaire à greffer plus précisément dans le squelette de souris NOG. L’identification des tumeurs par imagerie bioluminescente des souris est suivie en mesurant l’absorption des sondes radiopharmaceutiques (par exemple, 18F-FDG) en TEP/CT. ensemble, ce qui permet une caractérisation plus poussée des critiques biochimique voies (p. ex., altérations du métabolisme, les changements dans l’hypoxie et l’induction de l’apoptose) dans le microenvironnement tumoral/BM. Les atouts majeurs de ce modèle peuvent être mis en évidence par la disponibilité d’une large gamme de sondes radioactives, bioluminescentes et fluorescents et marqueurs qui peuvent être utilisés pour étudier la progression de la MM et pathologie in vivo.

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Protocole

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Toutes les procédures animaux décrits ci-dessous ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) du grand Los Angeles VA Healthcare system et ont été effectuées dans des conditions stériles et exempts de micro-organismes pathogènes.

1. préparation des 8226 cellules exprimant luciférase (8226-LUC)

  1. Maintenir la lignée humaine de cellule MM, 8226, dans un milieu RPMI-1640 additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline-streptomycine à 37 ° C en atmosphère humidifiée contenant 95 % air et 5 % de dioxyde de carbone (CO2).
  2. Générer des cellules de journaliste 8226 stables exprimant le LUC par transfection 1 x 106 8226 cellules avec un vecteur de rapporteur luciférase suivie d’une sélection avec l’hygromycine (100-350 mg/mL) comme précédemment décrit6.
  3. Maintenir les cellules conditions normales stérile culture pendant 2-3 semaines, changer le support de tous les jours, jusqu'à ce que la mise en place d’une lignée de cellules de 8226 stablement transfectées a été généré.
  4. Confirmer l’activité in vitro luciférase dans 1 x 106 transfecté des cellules/100 µL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en ajoutant le substrat de la luciférase, D-luciférine (150 µg/mL solution de travail en milieu de culture préchauffée) et en mesurant la bioluminescence des cellules dans un tube à essai ou une plaque à 96 puits à l’aide d’un luminomètre6.

2. modèle de xénogreffes Orthotopiques

  1. Maintenir la souris NOG (4-6 semaines vieux, hommes ou femmes) dans des conditions stériles/exempts de micro-organismes pathogènes dans un établissement de soins appropriés aux animaux.
  2. Préparer les cellules transfectées LUC 8226 injectable I.V. dans les souris NOG (~ 5 x 106 cellules/souris) le jour de l’expérience. Laver les cellules 3 x dans du PBS glacée, les compter et remettre en suspension dans du PBS glacee (moins antibiotiques et FBS) à une concentration finale de 5 x 106 cellules/200 µL de PBS) dans un tube stérile. Garder les cellules sur la glace et mettre au défi les souris dès que possible (à moins de 30 à 120 min).
  3. Anesthésier la souris (à l’isoflurane, 1 à 3 % dans l’air à 0,5 - 1 L/min) et placer l’animal dans une position allongée sur un coussin chauffant avec la tête à l’autre direction. Vérifier le niveau d’anesthetization en pinçant l’orteil. Pommade ophtalmique pour les yeux.
  4. Injecter les cellules 8226-LUC dans les souris par l’intermédiaire de la veine caudale (200 µL/injection) à l’aide d’une seringue d’insuline de 1 mL et une aiguille 26-G.
    Remarque : Une lampe chauffante peut servir à chauffer la queue, dilatation de la veine, ainsi augmenter l’efficacité des injections.
  5. Retourner l’animal à leur cage maison et surveiller les animaux jusqu'à ce qu’ils ont pleinement récupéré.
  6. Confirmer la prise de greffe de cellules 8226-LUC dans le squelette de souris en mesurant le BLI chez des souris anesthésiés (décrit ci-dessous et illustré à la Figure 1 a).
    Remarque : Exsudats BM peuvent également être colorés pour expression de CD45 humaine utilisant l’écoulement cytometry (Figure 1 b) ou par l’immunohistochimie récoltés osseuse (Figure 1).

3. mesure de BLI In Vivo

Remarque : En général, BLI mesurable de tumeurs implantées chez la souris peut être observée premier entre 10-20 jours postchallenge, mais il faudra peut-être être déterminés expérimentalement.

  1. Anesthésier la souris (à l’isoflurane, 1 à 3 % dans l’air à 0,5 - 1 L/min) et vérifiez le niveau d’anesthetization en pinçant l’orteil. Appliquer une pommade ophtalmique à ses yeux.
  2. Donner à l’animal une injection Intrapéritonéale (200 µL/injection) de "en vivo-grade » substrat D-luciférine (30 mg/mL dilué dans du sérum physiologique stérile).
  3. Mesurer le BLI dans 5-10 min après l’injection du substrat luciférine (bien que l’activité BLI peut être observable chez les souris jusqu'à 45-60 min), en plaçant l’animal anesthésié en position couchée dans un système d’imagerie de petits animaux (Figure 2 ). Sélectionnez luminescentes et analyse par rayons x et acquisition d’images (Figure 3).
    1. Mesurer le rayonnement moyen (/steradian photons/s/cm2) dans certaines régions d’intérêt (ROIs) à l’aide de logiciels d’imagerie (Figure 4).
    2. Retourner l’animal de sa cage maison et surveiller jusqu'à ce qu’il a pleinement récupéré (environ 15-20 min).

4. traitement des souris avec thérapie ciblée

  1. Mesurer le niveau de référence BLI et alternez les animaux en groupes de traitement (souris/groupe de 4-8).
  2. Traiter les souris avec une injection Intrapéritonéale (200 µL/injection) du temsirolimus (0,2 - souris de 40 mg/kg) à l’aide d’un régime de cinq injections quotidiennes de IP suivie de 2 jours de repos et un cinq injections quotidiennes11supplémentaires.
  3. Mesurer l’activité de la luciférase (photons/s/cm2/steradian) 2 x par semaine tel que décrit à l’article 3 et intrigue le changement de la BLI au fil du temps. Changements dans la tumeur BLI peut être présenté sous forme d’images séries des souris (Figure 5 b).
    Remarque : Il est recommandé que la surveillance quotidienne des animaux être exécuté jusqu'à ce qu’ils présentent les symptômes suivants (généralement à moins de 45-60 jours de la contestation initiale) : poids perte (perte de plus de 10 % par rapport au poids avant l’implantation) et/ou postérieur paralysie de la branche, moment auquel ils doivent être euthanasiés en utilisant une chambre de2 CO suivie par dislocation cervicale.

5. analyse TEP/CT à l’aide de 18F-FDG à mesure change dans le métabolisme des tumeurs

  1. Rapidement les animaux dans leur cage maison en retirant leur nourriture pendant 24 h avant l’expérience afin d’éviter les excès absorption non spécifique de 18F-FDG.
  2. Préparer 18sondes F-radiomarqué FDG PET (50-100 µCi/injection de sérum physiologique stérile) le jour de l’expérience. Enregistrer le temps et des activités de la sonde de 18F-FDG avec un calibreur de dose.
    Remarque : 18F ayant une demi-vie relativement courte (environ 2 h), une préparation minutieuse et la planification de l’utilisation de ces sondes doivent être établies.
  3. Anesthésier l’animal (à l’isoflurane, 1 à 3 % dans l’air à 0,5 - 1 L/min) et le placer dans une position allongée sur un coussin chauffant avec la tête à l’autre direction. Vérifier le niveau d’anesthetization en pinçant l’orteil. Appliquer une pommade ophtalmique à ses yeux.
  4. Injecter la sonde via la veine caudale (100 µL/injection) à l’aide d’une seringue à insuline blindé 1 mL et une aiguille 26-G.
    Remarque : Une lampe chauffante peut servir à chauffer la queue, dilatation de la veine, ainsi augmenter l’efficacité des injections.
  5. Mesurer la radioactivité résiduelle dans les aiguilles et de seringues dans un calibreur de dose et noter l’activité et le temps.
    Remarque : La normalisation des souris incubation, dosage et synchronisation est indispensable pour assurer la comparabilité et la reproductibilité des données.
  6. Maintenir les souris sous anesthésie et à 37 ° C à l’aide d’un coussin chauffant pendant toute la période d’absorption (~ 45-90 min) de la sonde.
    Remarque : Il est important que les souris restent quiescentes et à 37 ° C pour éviter l’absorption non spécifique de la sonde.
  7. Échelonnez les injections de la sonde de 18F-FDG se produire à intervalles d’environ 20 – 30 min pour s’assurer une fois étiquetage similaire chez les souris.
    Remarque : Le bon flux de travail et le calendrier des injections sonde seront traduira dans des conditions optimales et reproductibles d’imagerie.
  8. Mesurer l’activité de 18F-FDG dans un système d’imagerie de TEP/CT petits animaux dans certaines régions d’intérêt qui correspondent à des tumeurs implantées (Figure 6).
    Remarque : Au début, une exposition de PET statique de 10 min et une exposition de CT 2 min sont recommandés, mais les durées d’exposition exacte peuvent doivent être déterminés expérimentalement.
  9. Rentrer les animaux de leurs cages maison et analysez-les jusqu'à ce que complètement guéri. Maison des souris dans une salle dédiée de retour pendant 24 h lors de la désintégration de la sonde aux niveaux de fond.
    Remarque : En raison de la courte demi-vie de 18F, plusieurs mesures en utilisant une sonde de frais peuvent être effectuées aussi souvent que 2 x par semaine.

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Résultats

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Dans les premières études pilotes, injections IV de cellules 8226-LUC en souris NOD/SCID n’ont pas développé des tumeurs MM BM-implanté, bien que squameuses MM les tumeurs étaient facilement forment (taux de réussite de 100 %). En revanche, défis IV avec 8226 cellules dans des souris NOG généré (à moins de 15-25 jours) des tumeurs dans le squelette (et seules rarement formés tumeurs du tissu non-squelettiques, tels que le foie ou la rate). Étant donné que les tumeurs du squelette ne pouva...

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Discussion

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Malgré la variété des modèles de xénogreffes préclinique de MM6,9,11,12,13, la possibilité d’étudier les interactions tumeur/BM dans le microenvironnement de la BM reste difficile 14. les techniques décrites ici permettent la prise de greffe rapide et reproductible des cellules tumorales 8226-LUC dans le squelette de souris NOG.

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Déclarations de divulgation

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L’auteur Kevin Francis est un employé de Perkin-Elmer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par un grant1I01BX001532 VA du mérite de l’United States département des anciens combattants affaires laboratoire recherche biomédicale et développement Service (BLRDS) à P.F. et E.C. reconnaît le soutien de la (VA Clinical Science R & D Service I01CX001388 prix de mérite) et remise en état VA R & D Service (Merit Award I01RX002604). Soutien supplémentaire provenait d’une subvention de démarrage de faculté de UCLA à J.K. Ces contenus ne représentent pas nécessairement les vues du ministère des anciens combattants ou le gouvernement américain.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
8226 lignée cellulaire de myélome humainATCCCCL-155
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Souris (NOG)Jackson Labs5557
Substrat de luciférineVivoGlo PromegaP1041
Hypoxyprobe-1KitHPL HP1-100
PE-CD45 (clone H130)BD Biosciences555483Utilisé pour la cytométrie en flux afin d’identifier les cellules tumorales CD45+ humaines dans l’exsudat de
BM CD45 de lapin anti-humain (clone D3F8Q)Signalisation cellulaire Technologie70527Anticorps primaire utilisé pour l’immunohistochimie de l’os excisé
IgG anti-lapin de chèvre (HRP conjugué)ABCAMab205718Anticorps secondaire utilisé pour l’immunohistochimie de l’os excisé Système de
dosage à double rapporteur de luciférasePromegaE1910
pGL4.5 Vecteur rapporteur de luciférasePromegaE1310
IVIS Lumina XRMS In Système d’imagerie VivoPerkin Elmer
Sofie G8 Système d’imagerie TEP/CTPerkin Elmer

Références

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Mots-clés

Imagerie bioluminescenteimagerie TEP TDMmod le de x nogreffetraitement au temsirolimussubstrat D lucif rinesonde 18F FDGimagerie des petits animaux

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