Nous présentons ici un protocole visant à isoler et de caractériser la structure, puissance olfactive et réaction de composés de phéromones putatifs de la lamproie marine.
Article de méthode
L’Identification des phéromones de la lamproie marine à l’aide de fractionnement Bioassay-guidé
Dans cet article
Résumé
Résumé
Fractionnement guidée par essai biologique est une approche itérative qui utilise les résultats des essais biologiques physiologiques et comportementales pour guider l’isolement et l’identification d’un composé actif de phéromone. Cette méthode a entraîné la caractérisation réussie des signaux chimiques qui fonctionnent comme des phéromones dans un large éventail d’espèces animales. La lamproie marine se fient olfaction pour détecter les phéromones qui médient réponses comportementales et physiologiques. Nous utilisons cette connaissance de la biologie des poissons à proposer des fonctions de phéromones putatifs et pour guider l’isolement et l’identification des composantes de l’actif de phéromone. La chromatographie est utilisée pour extraire, se concentrer et de séparer les composés de l’eau conditionnée. Électro-olfactogramme (EOG) enregistrements sont effectuées pour déterminer quelles fractions provoquer des réponses olfactifs. Tests comportementaux labyrinthe deux choix sont ensuite utilisés pour déterminer si une des fractions odorantes sont également actif sur le plan comportemental et induire une préférence. Méthodes spectrométriques et spectroscopiques fournissent le poids moléculaire et l’information structurale pour aider à l’élucidation de la structure. L’activité biologique des composés purs se confirme avec EOG et tests comportements. Les réponses comportementales observées dans le labyrinthe en fin de compte doivent être validés qu’en milieu de terrain pour confirmer leur fonction dans un cadre de cours d’eau naturel. Ces essais biologiques jouent un rôle double pour 1) guider le processus de fractionnement et 2) confirmer et préciser la bioactivité des composants isolés. Ici, nous rapportons les résultats représentatifs d’une identification de phéromone de la lamproie marine qui illustrent l’utilité de l’approche guidée par bioessai fractionnement. L’identification des phéromones de la lamproie marine est particulièrement importante parce qu’une modulation de son système de communication de phéromone est parmi les options envisagées pour contrôler la lamproie de mer envahissante dans les Grands Lacs laurentiens. Cette méthode peut être facilement adaptée pour caractériser la communication chimique dans un large éventail de taxons et de faire la lumière sur l’écologie chimique d’origine hydrique.
Introduction
Les phéromones sont des signaux chimiques spécifiques, libérés par les personnes qui les aident à localiser les sources de nourriture, détecter les prédateurs et médiation des interactions sociales de leurs congénères1. Communication de la phéromone chez les insectes a été bien étudiée2; Cependant, l’identification chimique et la fonction biologique des phéromones de vertébrés aquatiques n'ont pas été étudiées aussi largement. Connaissance de l’identité et la fonction des phéromones libéré peuvent être appliquées pour faciliter la récupération des espèces menacées,3,4 ou contrôle antiparasitaire espèces5,6. L’application de ces techniques nécessite l’isolement et la caractérisation des composants bioactifs de phéromone.
Identification de la phéromone est une branche de la chimie des produits naturels. Progrès dans la recherche de phéromone a été partiellement limité en raison de la nature des molécules phéromones eux-mêmes. Les phéromones sont souvent instables et publié en petites quantités, et seulement quelques techniques d’échantillonnage existent pour détecter des quantités infimes de volatiles7,8 ou des composés solubles dans l’eau9. Méthodes pour identifier les phéromones comprennent 1) un dépistage ciblé des composés connus, métabolomique) 2 et 3) guidée par bioessai fractionnement. Un dépistage ciblé des composés connus les tests disponibles dans le commerce des sous-produits métaboliques des processus physiologiques hypothétiquement fonctionnent comme des phéromones. Cette approche est limité parce que les chercheurs peuvent tester uniquement composés connus et disponibles. Toutefois, il a conduit à l’identification réussie des hormones sexuelles chez le poisson rouge qui fonctionnent comme phéromones10,11,12. La métabolomique est une deuxième approche d’identification de phéromone qui distingue les produits métaboliques potentiels de petites molécules dans un système biologique13. Une comparaison des profils métaboliques des deux groupes (c.-à-d., un actif contre un extrait inactif) permet l’identification d’un profil métabolique potentiel de qui le métabolite est épuré, la structure est élucidée et les bioactivité est confirmé14. Effets additifs ou synergiques des formulations complexes des mélanges spécifiques sont plus susceptibles d’être détectés avec la métabolomique, parce que les métabolites sont considérés ensemble plutôt que comme une série de fractions13. Pourtant, la mise en œuvre de la métabolomique repose sur la disponibilité des références synthétiques parce que les données qui en résulte ne facilitent pas l’élucidation des nouvelles structures.
Fractionnement guidée par essai biologique est une approche intégrée et itérative qui s’étend sur deux domaines : chimie et biologie. Cette approche utilise les résultats des essais biologiques physiologiques et comportementales pour guider l’isolement et l’identification d’un composé actif de phéromone. Un extrait brut est fractionné par une propriété chimique(p. ex., taille moléculaire, polarité, etc.) et testé avec enregistrements électro-olfactogramme (EOG) et/ou dans un test biologique. Les composants bioactifs sont éliminés en répétant ces étapes de fractionnement et EOGs et/ou biologiques. Les structures des composés actifs purs ont été dégagés par les méthodes spectrométriques et spectroscopiques, qui assurent le poids moléculaire et l’information structurale pour produire un modèle de ce composé à être synthétisé. Guidée par bioessai fractionnement peut produire divers métabolites et potentiellement roman phéromones avec des squelettes chimiques uniques qui ne risquent pas d’être prédites par les voies de biosynthèse.
Nous décrivons ici le protocole de fractionnement guidée par essai biologique utilisé pour isoler et de caractériser la bioactivité de la lamproie de mer mâle sex pheromone composés. La lamproie marine (Petromyzon marinus) est un modèle idéal de vertébrés pour étudier la communication phéromonale parce que ces poissons s’appuient fortement sur la détection olfactive des signaux chimiques d’arbitrer leur histoire de vie anadrome composé de trois étapes distinctes : les larves, juvénile et adulte. Larve de la lamproie marine se terrent dans les sédiments des cours d’eau douce, subissent une métamorphose radicale et de transforme en juvéniles qui migrent d’un lac ou l’océan où ils parasitent les poissons de la grande hostie. Après avoir détaché du poisson hôte, les adultes migrent vers des ruisseaux frayères, guidé par les phéromones migrateurs publiés par flux résident larves15,16,17,18,19 . Les mâles matures montent sur les frayères, libérer une phéromone de sexe multi-composants pour attirer des compagnons, frayer par intermittence pendant environ une semaine et puis mourir15,20. L’identification des phéromones de la lamproie marine est importante parce qu’une modulation du système de communication phéromone est parmi les options envisagées pour contrôler les lamproies marines envahissantes dans les Grands Lacs laurentiens21.
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Protocole
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité de Michigan State University (AUF # 03/14-054-00 et 02/17-031-00).
1. collecte et Extraction de la lamproie marine conditionné eau
- Place maturité sexuelle masculine la lamproie marine (15-30 animaux) dans un réservoir fourni avec 250 L d’eau gazeuse de lac Huron maintenue à 16-18 ° C.
- Recueillez l’eau conditionné par l’homme tout au long de chaque nuit de juin à juillet.
Remarque : la grande lamproie marine naturellement meurent après la ponte. Si un poisson est presque ce point dans sa vie, remplacez-le par un mâle adulte fraîche. - Extrait de l’eau conditionnée par extraction en phase solide.
- Faire tremper la résine dans le méthanol pendant 4 h avant de les charger dans une colonne. Charger la résine dans la colonne, puis pompe 10 L d’eau par le biais de la colonne afin d’éliminer le solvant organique.
- Passer l’eau conditionnée du réservoir tenant le poisson via le système de pompage vers le haut de la colonne. L’eau traverse un lit de 2 kg de résine échangeuse d’ions polymériques modérément polaire (par exemple., résine Amberlite XAD-7 HP), contenus dans une série de quatre colonnes de verre 2,5 L-capacité. Maintenir des vitesses de chargement entre 400 et 600 mL/6 min. éluer les métabolites avec 10 L de méthanol, suivie immédiatement de 5 L d’acétone.
ATTENTION : Cette étape utilise méthanol et acétone. Les deux sont inflammables et toxiques.
Remarque : Le résidu regroupé peut être stocké à-80 ° C jusqu'à être traitées ultérieurement.
- Réactiver la colonne après 1 semaine d’enrichissement par lavage avec l’eau (environ 10 L).
- Éliminer le solvant organique (le mélange de méthanol et d’eau) et de récolter l’extrait par évaporation rotatoire pendant 5 h sous pression réduite (moins de 300 mbar) à 40 ° C. Concentrer le résidu d’eau par lyophilisation sèche-cheveux gel pendant 48 h à-20 ° C jusqu’au sec.
2. séparation de la Fraction de piscines avec la chromatographie
- Faire tremper le gel de silice (230-400 mesh) dans la phase mobile initiale pendant 30 min. transfert le gel avec le solvant (suspension) à une colonne de verre. Ouvrez le robinet de la colonne pour permettre la phase mobile à traverser. Laisser le gel de silice à précipiter et former un lit de gel de silice.
- Bien mélanger les extraits avec gel de silice (70-230 mesh) et de les charger dans la colonne de chromatographie en phase liquide au-dessus du lit de gel de silice. Éluer les avec un dégradé de 95 % CHCl3 (chloroforme) / MeOH (méthanol) et 100 % MeOH, 2,5 L de volume total. Recueillir l’éluant dans des flacons individuels (chacune 10 ml).
ATTENTION : Le chloroforme utilisé lors de cette étape est un réactif toxique. - Guide de la mise en commun des solvants en 20 fractions par une chromatographie sur couche mince (CCM).
- Réaliser l’expérience de TLC sur plaques de gel de silice revêtus en appliquant l’exemple sur la ligne de départ et en immergeant la ligne de départ de la plaque dans les solvants en développement (choisir la polarité par le ratio de CHCl3 au méthanol de 0-100 %) dans un verre scellé réservoir.
- Permet de sélectionner l’image de développer un solvant pour rendre tous les TLC spots avec un facteur de rétention (Rf) variant de 0,3 - 0,8.
- Une fois le solvant de développement atteint la ligne de fond, sortez la plaque du réservoir et attendre 10 min pour le solvant s’évapore.
- Visualiser les taches tout d’abord sous ultraviolets à 254 nm et puis tache eux en aspergeant avec une solution de méthanol acide de l’Anisaldéhyde (20 μL) de 5 % par un pulvérisateur de chromatographie et en les chauffant à 85 ° C pendant 3 min.
Remarque : Les taches colorées sur la plaque de TLC indiquent le composant principal de la fraction. - Combiner l’éluant à 20 fractions basé sur la tache de couleur et de la similitude def R de la composante principale.
- Concentrer la fraction d’un résidu par évaporation dextrogyre sous pression réduite (300 mbar accordant la propriété de solvants) à 40 ° C pendant environ 30 min.
3. Electro-olfactogramme (EOG) enregistrements pour identifier les Fractions/composés odorants
- Tirez des capillaires en verre borosilicate (diamètre extérieur : 1,5 mm ; diamètre intérieur : 0,86 mm ; longueur : 100 mm) avec une micropipette extracteur avec le niveau de chauffage la valeur 65.
- Marquer et découper l’ouverture à l’extrémité du capillaire avec une fraise diamantée verre et remplissez-le avec agar fondu de 0,4 % en solution saline à 0,9 %. L’ouverture à l’extrémité du capillaire doit être environ 10 µm de diamètre.
- Remplir les électrodes capillaires extraite des escaliers 3.1 ou 3.2 et détenteurs d’électrodes à semi-conducteurs préfabriqués avec des boulettes de Ag/AgCl (voir Table des matières) avec 3M KCl à l’aide d’une micropipette.
Remarque : Déloger les bulles d’air dans le tube capillaire ou le porte-électrode. - Insérer les électrodes tirés dans le porte-électrode.
- Préparation de 100 mL de 10-5 M L-arginine dans l’eau filtrée au charbon d’une solution mère de L-arginine 10-2 M dans l’eau désionisée (conservée à 4 ° C) dans une fiole jaugée. Transférer 20 mL de la 10-5 M L-arginine, un flacon en verre.
- Pour la courbe concentration-réponse, préparer 10 mL de 10 fois les dilutions des piscines fraction de l’étape 2.3 en flacons de verre. Préparer des dilutions frais tous les jours avant les expériences et les utiliser dans une journée. Mettre les flacons en verre des solutions travail de L-arginine et des dilutions de piscine de fraction dans un bain d’eau recirculation pour permettre à la température de s’équilibrer à 8 ° C.
- Anesthésier la lamproie avec l’ester éthylique de l’acide 3-aminobenzoïque (MS222, 100 mg/L) et l’immobiliser avec une injection intramusculaire de gallamine triethiodide (3 mg/kg de poids corporel, en solution saline à 0,9 %) avec une seringue stérile.
Remarque : Une épaisseur suffisante d’anesthésie est déterminée en observant aucun mouvement des branchies, une incapacité à maintenir une posture verticale et pas de succion sur les côtés de la citerne à l’aide de son disque oral. Afin de minimiser toute contamination microbienne avant et Pendant la chirurgie, porter des gants stériles et tremper les outils de dissection dans l’éthanol à 70 % (v : v) dans l’eau désionisée pendant au moins 10 min avant utilisation. - Orientez la lamproie anesthésiée dans un support en forme de V et envelopper avec une serviette de papier humide pour éviter la dessiccation.
Remarque : Ne pas obstruer les pores branchiaux. - Insérer un tube de recirculation des eaux gazeuses contenant 50 mg/L de MS222 dans la cavité buccale, régler le débit et veiller à ce que l’eau sort par les pores branchiaux pour irriguer en permanence les branchies.
- Utiliser un scalpel stérile et forceps [sous le microscope stéréoscopique à un grossissement de X 1,25 (voir Table des matières)] pour supprimer une section de2 5 mm de la peau à la surface de la capsule olfactive pour exposer l’épithélium olfactif.
- Rincer la tubulure de livraison odorant avec eau filtrée et raccordez-le à la vanne montée sur un micromanipulateur. Placer le tube capillaire de livraison odorant dans la cavité de l’épithélium olfactif en utilisant le micromanipulateur pour livrer l’eau filtrée à l’épithélium olfactif pour empêcher la dessiccation lorsqu’on n'administre pas les substances odorantes.
- Monter les électrodes de référence et enregistrement sur les micromanipulateurs. Abaisser l’électrode de référence sur la peau externe près de la narine. En utilisant le microscope stéréoscopique (1,25 X), abaisser l’électrode d’enregistrement pour à peine toucher la surface de l’épithélium olfactif.
- Transférer l’absorption du tube livraison odorant de l’eau de fond filtré à la solution de L-arginine 10-5 M.
- Allumez l’ordinateur, amplificateur (réglé sur le mode cc), filtre et numériseur. Via le logiciel pilote de vanne, de programmer la procédure pour administrer une seule impulsion de 4 s d’odorants en cochant la case de T1, affectant T 4 s et en cochant la case de T2.
- Dans le logiciel d’acquisition de données (voir Table des matières), définir le mode d’acquisition d’un oscilloscope à grande vitesse, cliquez sur l’icône du jeu et puis cliquez sur Démarrer dans le pilote de la vanne à l’impulsion de la substance odorante.
Remarque : Le logiciel d’acquisition de données enregistre automatiquement l’amplitude de réponse différentielle EOG pendant 20 s (3 s avant, 4 s pendant l’impulsion odorants et 13 s par la suite). Utilisez le micromanipulateur à manœuvrer les positions des enregistrement électrode, électrode de référence ou tube livraison odorant pour augmenter le rapport signal-bruit avec une réponse maximale à la norme de la L-arginine et une réponse minimale à la (contrôle à blanc eau filtrée). L’amplificateur de la terre en passant le commutateur AC / DC de l’ampli à GND tout en déplaçant les électrodes. - Commencer à enregistrer le contrôle à blanc, L-arginine et puis les composés malodorants préparées à l’étape 3.6 de faible à des concentrations élevées d’une chasse de 2 min d’eau filtrée entre applications.
- Après avoir enregistré les réponses à toutes les substances odorantes à tester, l’amplificateur au sol et retirer soigneusement les électrodes et le tube capillaire de livraison odorant. Suivant les méthodes institutionnelles animalier et utilisation Comité (IACUC) approuvés, à la fin de l’expérience de l’EOG, euthanasier la lamproie anesthésiée avec une surdose de MS222 (1 g/L).
Remarque : Vérifiez euthanasie réussie en notant un manque de mouvement gill et rythme cardiaque pendant au moins 5 min, suivi de décérébration le cerveau. - Analyser et tracer les données à l’aide de logiciels d’analyse. Déterminer le seuil de détection des substances odorantes22 pour identifier les fractions odorantes qui déclenchent des réponses supérieurs à la maîtrise de l’eau blanche. Les piscines de fraction qui déclenchent des réponses olfactifs concentration-dépendante qui diffèrent de celles du contrôle de l’eau vierge sont ensuite testés lors d’un test comportemental (étape 4).
4. deux choix de labyrinthe Bioassay comportemental pour identifier les Fractions/composés actifs sur le plan comportemental
- Acclimater la lamproie de mer femelle sexuellement mature dans la cage de libération dans le labyrinthe (voir figure1 complémentaire) pendant 5 min. maintenir le débit de l’eau de rivière dans le labyrinthe
Remarque : Le labyrinthe est construit à partir de bois verni de qualité marine et mesure 6,5 m de long et 1,2 m de largeur avec un diviseur de 2,7 m de longueur pour séparer le labyrinthe en deux canaux à l’extrémité amont. L’eau est temporairement déviée dans le labyrinthe. La profondeur de l’eau doit être maintenue à 0,19 m et la vitesse doit être maintenue à 0,07 m/s ± 0,01. - Libérer la lamproie et consigner le montant cumulatif des temps que la lamproie passe dans l’expérimental et le canal de commande, chaque rivière contenant de l’eau pendant 10 min.
Remarque : Si la lamproie de mer ne parvient pas à entrer dans l’expérimental et contrôler le canal pendant au moins 10 s au cours de cette période de 10 min, mettre fin au procès, puisqu’il s’agit d’une indication de partialité inactivité ou fort. - Appliquer le test stimulus (c'est-à-direune phéromone putative à 10-12 M dissous dans 50 % méthanol/désionisée) pour le canal expérimental aléatoirement assigné et le véhicule (50 % méthanol/désionisée) sur le canal de contrôle en utilisant péristaltique pompes à constants de 200 mL/min pendant 5 min.
Remarque : La concentration seuil de détection du test stimulus déterminé avec les enregistrements électro-olfactogramme devrait être utilisée comme la concentration initiale pour le test comportemental. - Appliquer le test stimulus et le véhicule pour un 10 min supplémentaire et enregistrez le montant cumulatif des temps passe la lamproie dans l’expérimental et le canal de commande.
- Rincer le labyrinthe avec de l’eau pendant 10 min avant le début de l’essai suivant. Répétez les étapes 4.1 à 4.4 au moins 7 lamproies si suffisamment test stimulus est disponible.
- Calculer l’indice de préférence22 pour chaque essai et évaluer la signification à l’aide d’un test de Wilcoxon signé-grade.
Remarque : L’index correspond à un nombre unique qui peut être positif ou négatif. Une valeur positive de l’indice de préférence indique attraction, alors qu’une valeur négative de l’indice de répulsion des indications de préférence. Si l’index de préférence est significativement différent de zéro, la fraction est réputée active.
Ici,
Bc = le temps passé par la lamproie de test dans le canal de contrôle avant l’application de la substance odorante,
Be = le temps passé dans le canal expérimental avant l’application de la substance odorante,
Ac = le temps passé dans le canal de commande après l’application de la substance odorante, et
Une = le temps passé dans le canal expérimental après l’application de la substance odorante.
5. chromatographique isolement des composés purs de Fractions actives
- Répétez les étapes 2.1 à 2.4 avec les pools de fraction qui induisent des réponses olfactifs (étape 3) et obtenir des réponses comportementales (étape 4).
- Plus loin, purifier les fractions actives en composés avec la chromatographie d’exclusion stérique en utilisant une colonne de Sephadex LH-20.
- Préparation des échantillons dans 0,5 mL dans la phase initiale de mobile [CHCl3- MeOH (1:1) ou MeOH 100 %], charger dans la colonne correspondante, une colonne CHCl3- MeOH (1:1), puis une colonne de MeOH (100 %) et eux pour donner les composés éluer.
6. structure Elucidation d’un composé pur avec la spectrométrie de masse (MS) et de la résonance magnétique nucléaire (RMN)
- Dissoudre et de diluer la substance purifiée dans la première phase mobile (habituellement, du méthanol à l’eau, 1:1, v : v) de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) pour former une solution de 10 μL d’environ 1 μg/mL.
- Transférer la solution d’échantillon à fioles HPLC et mettez-les dans l’échantillonneur automatique de CLHP. Injecter l’échantillon (10 μL) dans la spectrométrie de masse d’ionisation par électronébulisation (ESIMS) et d’enregistrer les spectres de spectrométrie de masse (HRESIMS) d’ionisation par électronébulisation haute résolution en utilisant un spectromètre de masse de chromatographie23.
- Prédire la formule moléculaire est selon la base de données dans le logiciel de spectromètre de masse (voir Table des matières)24.
- Ouvrez le chromatogramme de l’échantillon injecté et obtenir son spectre de masse en sélectionnant le pic chromatographique.
- La masse mesurée à la valeur (4 décimales) d’ion (m/z) dans la composition élémentaire sous le module outil de l’entrée. La valeur du paramètre tolerance PPM < 5.
- Ajuster les paramètres du symbole pour s’adapter à la composition de l’élément de la molécule mesurée. Le logiciel produit une prédiction de formule moléculaire basée sur l’analyse de masse unique.
- Sélectionnez les solvants deutérés (600 μL, CH3OH -d4 ou DMSO -d6) selon le protocole25 pour dissoudre des échantillons.
- Dissoudre complètement l’échantillon dans les solvants deutérés sélectionnés pour former une solution avec une concentration variant environ de 0,1 à 10 mg/mL. Transvaser la solution de l’échantillon dans un tube de NMR pour enregistrer le 1D (1H, 13C) et RMN 2D [1H -1H spectroscopie de corrélation (COSY), hétéronucléaire simple cohérence quantique (HSQC), hétéronucléaire corrélation de liaisons multiples (HMBC)] spectres sur un de spectromètre RMN 900 MHz26.
- Placer le tube de NMR avec l’échantillon à l’intérieur de la turbine de spinner. Utilisez la jauge de profondeur pour s’assurer que la taille de l’échantillon se trouve au milieu de la fenêtre de mesure. Ouvrez le logiciel NMR (voir Table des matières) et cliquez sur le bouton d’ascenseur pour modifier l’échantillon dans l’aimant.
Remarque : Tenir une main sur le dessus de l’aimant se sentir le gaz provenant de la partie supérieure de l’aimant. Dans le même temps, un sifflement doit se faire entendre. - Doucement, placez l’échantillon sur le coussin d’air sur le dessus de l’aimant et poussez le bouton ascenseur pour descendre l’échantillon dans l’aimant de NMR.
Remarque : Écoutez un bruit de « clic » indiquer que l’échantillon est dans la bonne position. - Créez un nouveau dataset et charger les paramètres par défaut recommandés par l’instrument de NMR (voir Table des matières).
- Tapez « lock » pour appeler la procédure de verrouillage automatique et sélectionner le solvant à la page rapide.
- Pour affiner, dans le panneau de la manipulation, régler le bouton dans le modèle de déverrouillage , ajustez le curseur sur le panneau de manipuler et rebloquer l’aimant.
- À l’invite page Atma , régler le paramètre dans le panneau de manipuler à la procédure de paramétrage, qui peut prendre quelques minutes. Attendez que le tuning soit terminé pour aller de l’avant.
- Démarrer la routine de calage automatique en tapant « topshim » dans l’invite de commandes. Attendez que le calage est terminé pour aller de l’avant.
- Type « rga » pour définir automatique reçoit des réglages de gain, puis de type « d1 » pour définir l’intervalle entre les impulsions, puis type « zg » pour démarrer l’acquisition et attendez la fin de l’acquisition.
- Tapez « ef » ou « efp » pour traiter les données, puis tapez « apk » pour l’élimination automatique. Traiter les données sur le logiciel de traitement de NMR.
- Élucider la structure chimique par une interprétation de l’analyse de données RMN.
- Compter les signaux de carbone dans le spectre de RMN du 13C 13. Sélectionnez la formule moléculaire est appariée dans le résultat prédit en spectrométrie de masse à haute résolution (HR-MS).
- Intégrer les signaux des protons dans le spectre de RMN H 1et affecter la connectivité du carbone et proton-basé sur les signaux dans le spectre HSQC.
- Affecter la connectivité du squelette carboné basée sur les corrélations dans la 1H -1H COSY et spectre HMBC.
- Provisoirement attribuer la structure chimique basée sur la structure logique27. La structure provisoire de la recherche dans les bases de données de structure chimique. Comparez la structure provisoire avec les analogues dans les références.
- Affecter la configuration relative avec le spectre nucléaire Overhauser effet spectroscopie (NOESY).
Remarque : Étant donné que les propriétés d’identité d’énantiomères affichées sur la spectrométrie et méthodes spectroscopiques sont identiques, la configuration absolue de certains composés, en particulier ceux avec alcool 2' et 2'-NH2, doit être déterminée avec une réaction de dérivation. Après la réaction de dérivation, les différences indiquées sur les spectres de facilitent la cession sans équivoque des configurations absolues de la plupart des composés28.
7. EOG et bioessai pour confirmer des composés purs sont odorantes et active sur le plan comportemental
- Répétez les étapes 3.1-3.5.
- Pour la courbe concentration-réponse, préparer 10 mL de 10 fois les dilutions des composés purs de 10-6 M - 10-13 M d’une solution mère de phéromone 10-3 M 50 % méthanol/eau conservés à-20 ° C selon le poids moléculaire déterminé en 6.2 l’étape. Mettre les flacons en verre avec les solutions de travail de L-arginine et les composés purs dans un bain d’eau recirculation pour permettre à la température de s’équilibrer à 8 ° C.
- Répétez les étapes 3,7-3.18.
- Répétez les étapes 4.1-4.2.
- Appliquer le composé pur à la concentration de seuil de détection EOG le canal expérimental aléatoirement assigné et le véhicule (50 % méthanol/désionisée) sur le canal de contrôle à l’aide d’une pompe péristaltique à constants de 200 mL/min pendant 5 min.
- Répétez les étapes de 4,4 à 4,6.
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Résultats
Un schéma résumant les étapes décrites dans le protocole du fractionnement guidée par essai biologique est donné à la Figure 1. Le protocole, procédez comme pour les isoler et de caractériser la structure, la puissance olfactive et l’activité comportementale des 5 phéromones putatifs de la lamproie (Figure 2). À l’aide de la spectrométrie de masse et les données de la RMN (Figure 3 et
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Discussion
Poissons vivants dans un monde chimique de composés encore être identifiés. Guidée par bioessai fractionnement s’est avérée essentiel pour identifier et caractériser les molécules bioactives qui assurent la médiation de nombreuses interactions chimiques, tels que ceux observés en saumon masu31, éléphants d’Asie,32et la grande lamproie marine33, 34,35. Fractionnement guidée par ess...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions l’US Geological Survey Hammond Bay Station biologique pour l’utilisation de leurs installations de recherche et le personnel du U.S. Fish and Wildlife Service et Pêches et Océans Canada pour fournir de la lamproie marine. Cette recherche a été financée par des subventions de la Commission des pêcheries des grands lacs à Weiming Li et Ke Li.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Capillaires en borosilicate à paroi standard de qualité supérieure avec filament ; | Warner Instruments | G150F-4 | Électrode d’enregistrement et de référence (OD 1,5 mm, ID 0,86 mm) |
| Instrument d’extraction de pipette | Narishige | PC-10 | tire des électrodes pour EOG |
| Coupe-verre à pointe de diamant | Pointe générique | d’électrodes pour EOG | |
| Capillaires en verre borosilicaté | World Precision Instruments | 1B150-4 | Tube de distribution d’odorant pour EOG |
| Porte-électrode d’enregistrement Série E corps droit avec pastille Ag/AgCl pour capillaire en verre OD 1,5 mm | Warner Instruments | ESP-M15N | Porte-électrode d’enregistrement |
| Porte-électrode de référence Série E avec poignée avec ; Granulés Ag/AgCl ; pour capillaire en verre OD 1,5 mm | Warner Instruments | E45P-F15NH | porte-électrode de référence |
| 1 broche | Warner Instruments | WC1-10 | pour pont porte-électrodes de référence et d’enregistrement |
| mm broche | Warner Instruments | WC2-5 | pour pont porte-électrodes de référence et d’enregistrement |
| Agar | Sigma | A1296 | gélose fondue pour remplir les électrodes |
| Chlorure de potassium (KCl) | Sigma | P9333 | 3M KCl pour le remplissage des électrodes et des porte-électrodes |
| Micropipette microfil | World Precision Instruments | MF28G-5 | pour le remplissage des électrodes et des porte-électrodes |
| L-Arginine | Sigma | A5006 | odorant à contrôle positif pour EOG |
| Méthanol | Sigma | 34860 | |
| Bain-marie | Sur mesure | N/A | maintient les odorisants pour EOG |
| Ester éthylique de l’acide 3-aminobenzoïque (MS222) | Syndel USA | Tricaïne1G | EOG anesthésique |
| Triéthiodide Gallamine | Sigma | G8134-5G | EOG paralytique |
| 1 mL seringue | BD Biosciences | 301025 | pour administrer paralysant |
| Aiguille sous-cutanée 26G 5/8 | BD Biosciences | 305115 | pour administrer paralysant |
| Pince à rouleau | World Precision Les instruments | 14043-20 | ajustent le débit d’anesthésique dans la bouche de la lamproie |
| Chlorure de sodium (NaCl) | J.T. Baker | 3624-05 | pour la préparation d’un support en plastique salin en forme de V à 0,9 % |
| comme étape d’échantillon N | /A | sur mesure | pour maintenir la lamproie pendant l’EOG |
| Auge en plastique S.O. | mesure | pour tenir le support en plastique en forme de V pendant l’EOG | |
| Lames de scalpel - #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | pour la dissection EOG |
| Manche de scalpel - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | pour la dissection EOG |
| Pince droite ultra fine | Outils de science | fine 11252-00 | pour la dissection EOG, Dumont #5SF Pince |
| Pince ultra fine incurvée | Outils de science fine | 11370-42 | pour la dissection EOG, Moria MC40B |
| Ciseaux | droitsOutils de haute science | 15003-08 | pour la dissection EOG |
| Stéréomicroscope | Zeiss | Discovery V8 | pour la dissection EOG |
| Lumière de l’illuminateur | Zeiss | CL 1500 ECO | pour la dissection EOG |
| Tube en plastique Générique | pour connecter la configuration EOG à recirculation et les bains-marie | ||
| Tube de distribution d’odorant Fabrication | sur mesure | N/A | |
| In Filtre de ligne et joint d’étanchéité | Lee Company | TCFA1201035A | |
| Micromanipulateurs | Narishige | MM-3 | pour positionner les électrodes et le tube capillaire de distribution d’odorant |
| Dispositifs de maintien magnétiques | Kanetec | MB-K | |
| Pilote de vanne | Arduino | fabriqué sur mesure | pour contrôler l’ouverture de la vanne pour la stimulation des odeurs |
| Vanne électromagnétique Lee | Entreprise | LFAA1201618H | valve pour la stimulation des odeurs |
| NeuroLog Amplificateur AC/DC | Digitimer Ltd. | NL106 | pour augmenter l’amplitude du préamplificateur DC du signal électrique |
| NeuroLog avec étage de tête | Digitimer Ltd. | NL102G | pour augmenter l’amplitude du signal électrique |
| Filtre passe-bas 60 Hz | Digitimer Ltd. | NL125 | |
| Numériseur | Molecular Devices LLC | Axon Digidata 1440A | |
| Ordinateur Dell (OptiPlex 745) exécutant le logiciel d’acquisition de données Axoscope | Molecular Devices LLC | AxoScope version 10.4 | |
| Cage de Faraday | Fabrication sur mesure | N/A | Blindage contre le bruit électromagnétique |
| Labyrinthe à deux choix Fabrication | sur mesure | N/A | contreplaqué imperméable de qualité marine recouvert d’une doublure en plastique |
| Pompe à ordures | Honda | WT30XK4A | remplit le labyrinthe avec de l’eau de la rivière voisine |
| Pompe péristaltique avec tube | Cole Parmer | Masterflex 07557-00 | pour administrer les odorisants dans le labyrinthe |
| Générateur d’onduleur | Honda | EU1000i | alimente la pompe perstaltique |
| Cage de libération | sur mesure | N/A | utilisé pour acclimater la lamproie dans le labyrinthe |
| Maille | Générique | utilisé pour contenir les dimensions du labyrinthe et minimiser la turbulance de l’eau avec des rouleaux à mailles | |
| Seaux (5 gallons) | Générique | pour mélanger les odorisants | |
| Débitmètre | Marsh-McBirney | Flo-Mate 2000 | pour mesurer la décharge |
| XAD 7 HP résine | Dow chimique | 37380-43-1 | pour l’extraction de l’eau conditionnée ; |
| Méthanol | Sigma | 34860 | pour l’extraction d’eau conditionnée |
| Bain-marie | Yamato | BM 200 | pour l’extraction de l’eau conditionnée |
| Lyophilisateur | Labconco | CentriVap Concentrateur | pour l’extraction de l’eau conditionnée |
| chloroforme | Sigma | CX1050 | pour l’isolement des flaques de fractions |
| Gel de silice 70-230 mesh | Sigma | 112926-00-8 | pour l’isolation des pools de fractions Gel de |
| silice 230-400 mesh | Sigma | 112926-00-8 | pour l’isolation des pools de fractions |
| Silice pré-enduite gel plaques TLC | Sigma | 99571 | pour l’isolation des piscines de fractions |
| anisaldéhyde | Sigma | A88107 | pour l’isolation des piscines de fractions |
| Sephadex LH-20 | GE Healthcare | 17-0090-01 | pour l’isolation des piscines de fractions |
| Amberlite XAD 7 HP résine | Sigma | XAD7HP | pour l’extraction de l’eau conditionnée ; |
| 4 colonnes de verre d’une capacité de 2,5 L | Ace Glass Inc. | 5820 | pour l’extraction d’eau conditionnée |
| Acétone | Sigma | 650501 | pour l’extraction d’eau conditionnée |
| TQ-S TOF LC Spectromètre de masse (ou équivalent) | Waters Co. | N/A | pour l’élucidation de la structure |
| Pompe HPLC binaire | Waters Co. | 1525 | pour l’isolement de bassins de fractions/composés |
| Spectromètre RMN Agilent, 900MHz (ou équivalent) | Agilent | N/A | pour l’élucidation de la structure |
| Système de séchage Rotovap | Buchi | RII | pour l’extraction d’eau conditionnée ; |
| Lampe UV (254 nm) | Spectronics Co. | ENF-240C | pour la chromatographie sur couche mince |
Références
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