Method Article

Un haut débit et haute teneur, liquide à base de c. elegans pathosystème

DOI:

10.3791/58068

⸱

July 1st, 2018

 ,  , 
1Department of Biosciences, Rice University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons ici un protocole qui est un hôte adaptable, entier, outil de dépistage de la forte teneur qui peut être utilisé pour étudier les interactions hôte-pathogène et être utilisé pour la découverte de médicaments.

Abstract

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Le nombre de nouveaux médicaments identifiés par traditionnel, en vitro écrans a diminué, réduisant le succès de cette approche dans la recherche de nouvelles armes lutter contre la pharmacorésistance multiple. Cela a conduit à la conclusion que les chercheurs ne sont pas seulement la nécessité de trouver de nouveaux médicaments, mais aussi besoin de développer de nouvelles façons de les trouver. Parmi les candidats prometteurs, les méthodes sont tout micro-organisme, in vivo , essais qu’affichages utilisation de haut-débit, phénotypiques et héberge qui vont de Caenorhabditis elegans à Danio rerio. Ces hôtes ont plusieurs avantages puissants, y compris des réductions spectaculaires de fausses positifs hits, comme les composés qui sont toxiques pour l’hôte et/ou biounavailable sont généralement supprimées dans l’écran initial, avant de suivre coûteux vers le haut.

Ici, nous montrons comment notre essai a été utilisée pour interroger la variation d’hôte dans bien documenté c. elegans— pathosystème liquide meurtre dePseudomonas aeruginosa . Nous démontrons également plusieurs extensions de cette technique bien travaillée dehors. Par exemple, nous sommes en mesure de réaliser des écrans génétiques haut-débit à l’aide d’Arni dans 24 ou 96 puits formats de plaque aux facteurs de l’hôte requête dans cette interaction hôte-pathogène. À l’aide de ce test, étude globale du génome entier peut être complété en seulement quelques mois, ce qui peuvent considérablement simplifier la tâche d’identifier des cibles thérapeutiques, potentiellement sans la nécessité d’approches de purification biochimiques laborieux.

Nous rapportons également une variante de notre méthode qui substitue la bactérie Gram-positive Enterococcus faecalis pour le pathogène Gram négatif de P. aeruginosa. Beaucoup comme c’est le cas pour P. aeruginosa, assassinat par E. faecalis est fonction du temps. Contrairement à la précédente c. elegans— essaisd’e. faecalis , notre essai pour E. faecalis ne nécessite pas de preinfection, améliorer son profil d’innocuité et réduisant les risques de contamination de manutention des liquides. L’essai est très robuste, montrant ~ 95 % taux de mortalité 96 h après l’infection.

Introduction

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L’identification et le développement d’antibiotiques efficaces, à large spectre, maintenant il y a près d’un siècle a conduit à un moment décisif dans la santé publique où il y avait une croyance largement répandue qu’infectieuse maladie serait un fléau du passé. Quelques courtes décennies, cet optimisme commença à décliner, comme pathogène après que pathogène mis au point des mécanismes de résistance qui limite ces traitements une fois miraculeuses. Depuis un certain temps, la course aux armements entre les efforts de découverte de drogue et les agents pathogènes semblait équilibrée. Toutefois, la mauvaise utilisation des antimicrobiens a récemment abouti à l’émergence de souches résistantes aux médicaments-pan de Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescenset P. aeruginosa1, 2,3,4.

P. aeruginosa est un, gram négatif, multi-accueil agent pathogène opportuniste qui constitue une menace grave pour les patients atteints de brûlures graves, ceux qui sont immunodéprimés, ou souffrent de fibrose kystique. Il est également de plus en plus identifié comme un agent causal dans les infections nosocomiales graves, notamment en raison de son acquisition en cours de la résistance antimicrobienne. Pour commencer à faire face à cette menace, nous avons utilisé le bien documenté c. elegans-P. aeruginosa infection système5. Notre laboratoire a mis à profit ce système afin de développer une plate-forme de base liquide, haut débit, haute teneur de dépistage pour identifier de nouveaux composés qui limitent la capacité de l’agent pathogène de tuer l' hôte6. Curieusement, ces composés semblent appartenir au moins trois catégories général, y compris les antimicrobiens7 et virulence inhibiteurs8. Autres essais de découverte de drogue forte teneur chez c. elegans ont été rapportés pour Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, et Enterococcus faecalis, entre autres,9,10,11,12,13,14,15,16. Ces types d’analyses ont plusieurs avantages reconnus, comme limiter la fausses hits positifs qui peuvent être toxiques à la fois l’hôte et l’agent pathogène, la probabilité de biodisponibilité par rapport à un écran chimique et la capacité d’identifier les visites au-delà tout simplement limiter la croissance microbienne, comme anti-virulents, des molécules stimulants immunitaires ou des composés qui autrement faire pencher la balance de l’interaction hôte-pathogène, en faveur de l’ancien. En outre, les composés découverts dans ces écrans sont souvent efficaces chez les hôtes mammifères.

Il est à noter qu’il existe au moins deux autres essais17,18 réaliser des écrans de haut-débit chez c. elegans en liquide. Cependant, chacun de ces tests est une modification qui permet le dosage la colonisation de l’intestin prototypique, connu comme lent-assassinat, à effectuer dans un liquide, augmentant le débit et permettant aux composés à subir plus facilement. Attention la caractérisation a démontré avec certitude que les mécanismes de la virulence bactérienne sont différents entre ces tests et notre base liquide Ecran7. Étant donné que les deux types de virulence sont observés dans les systèmes mammaliens, il est important d’examiner quels déterminants de virulence est le plus pertinent pour les intérêts de l’expérimentateur avant la sélection du dosage.

Nous démontrons une version optimisée de la base liquide dosage c. elegans-P. aeruginosa . Nous rapportons également l’adaptation de notre méthode de dosage de base liquide pour accueillir la bactérie pathogène Gram positive Enterococcus faecalis. Comme P. aeruginosa, E. faecalis est plus en plus identifiée comme une menace de graves infections nosocomiales avec un armement croissant de la résistance aux antimicrobiens voies1. Bien que14il existe une méthode précédente pour le criblage à haut débit d’e. faecalis , requiere preinfection avec l’agent pathogène, ce qui complique la procédure et augmente la probabilité de contamination des équipements tels que le FlowSort COPAS. Notre protocole élimine le besoin de préalable à l’infection, améliorer le profil d’innocuité. Enfin, nous présentons un moyen par lequel ou l’autre de ces tests peuvent être combinés avec alimentation Arni, permettant à l’utilisateur de rechercher des facteurs de l’hôte qui jouent un rôle dans la mise en place de, ou résistance à l’infection.

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Protocol

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ATTENTION : P. aeruginosa et E. faecalis sont des pathogènes de niveau de biosécurité 2 et précautions de sécurité appropriées doivent être prises pour prévenir l’infection accidentelle et de réduire au minimum la contamination des surfaces. Tous les supports et les matériaux qui entrent en contact avec des agents pathogènes doivent être stérilisés ou mis au rebut. Lignes directrices supplémentaires sont disponibles dans la publication CDC Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL), 5e édition.

1. préparation et entretien de P. aeruginosa

  1. Strie de P. aeruginosa provenant d’un stock congelé sur une gélose LB (lysogénie bouillon). Incuber pendant 16 à 24 heures à 37 ° C
    Remarque : Réaliser des expériences P. aeruginosa à l’intérieur d’une armoire pour assurer la stérilité de sécurité biologique BSL-2. Utilisez des précautions de sécurité appropriées afin de minimiser les risques d’infection pathogène ou contamination.
  2. Transférer cette plaque à 4 ° C. Cette plaque peut être conservée à 4 ° C et utilisée pour ensemencer les cultures pendant une semaine. Après une semaine, décontaminer et éliminer la plaque et faire une nouvelle plaque de strie LB.
    Remarque : La virulence P. aeruginosa diminue après un stockage prolongé.
  3. Deux jours avant la mise en place des plaques de dosage, ensemencer 3 à 5 mL de bouillon LB stérile avec une seule colonie de P. aeruginosa de la tôle au point 1.1. Incuber à 37 ° C pendant 12 à 16 h.
    Remarque : Incuber pas plus de 16 h. Dans des cultures liquides riches, P. aeruginosa PA14 commence à lyser.
  4. Préparer les assiettes stérile de 10 cm avec les médias tuent lentement (3 g de NaCl peptone de 3,5 g, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mL de tampon phosphate (montant par litre : 132 mL K2HPO4 (1 M) et 868 mL de KH2PO4 (1 M)) et 18 g agar/L).
    Remarque : Préparer les plaques d’avance. Qu’elles puissent être stockées pendant 3 semaines dans un contenant hermétique à 4 ° C.
  5. Graines de chaque plaque de tuer lente de 10 cm (plaque SK) avec 350 μL de P. aeruginosa de culture nuitée fraîche de LB. À l’aide d’un épandeur bactérien stérile, répartir les bactéries sur la surface des supports et laisser pour sécher dans une armoire de sécurité biologique BSL-2.
  6. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 24 h.

2. préparation des bactéries de l’ARNi

  1. Strie sur ou pin-transfert désirés souches de bactéries contenant de l’ARNi sur plaques de gélose LB contenant des antibiotiques appropriés (carbénicilline à 100 µg/mL) et la tétracycline à 15 µg/mL pour les bibliothèques Ahringer et Vidal provenant d’un stock congelé.
    Remarque : Lorsque vous travaillez avec des bactéries non pathogènes, utilisez soit un BSL-2 A / B hotte biologique de sécurité ou un écoulement laminaire de BSL-1 cagoule pour assurer la stérilité des cultures et pour minimiser le risque de contamination croisée de la bibliothèque.
  2. Incuber les boîtes pendant 24 h à 37 ° C.
  3. Stocker les plaques à 4 ° C pendant deux semaines.
    1. Après deux semaines, jetez les plaques et les remplacer par des plats fraîchement préparés.
  4. Tester plusieurs souches d’Arni en parallèle en inoculant individuellement une seule colonie de chaque clone dans 4 mL de LB additionné de carbénicilline dans un seul bien d’une plaque de 24 puits puits profonds ou dans un tube stérile.
    Remarque : Tétracycline a été signalé à réduire l’efficacité de l’ARNi. Ne l’utilisez pas dans ce média.
  5. Placer les plaques 24 puits puits dans un incubateur à agitation optimisé pour plaques multipuits et incuber à 37 ° C pendant 16 h et en agitant à 950 tr/min.
    Remarque : Il est difficile d’obtenir une croissance bactérienne uniforme en plaques multipuits à l’aide d’un incubateur à agitation conventionnels. L’incubateur agitateur doit être capable de secouer à un minimum de 750 tr/min afin que les cultures de croître correctement. En l’absence d’un shaker spécialisé, il est possible de faire pousser de chaque culture dans un tube individuel. Cultures peuvent être transférées dans la plaque 24 puits pour la centrifugation par la suite, si vous le souhaitez.
  6. Récolter les germes par centrifugation pendant 5 minutes à 2 000 x g.
  7. Éliminer le surnageant en inversant la plaque et en agitant vigoureusement. Remettre en suspension les bactéries Arni dans 100 µL de S basale (5,85 g NaCl, g 1 K2HPO4, 6 g KH2PO4 dissous dans 1 L d’eau ultrapure et stérilisé par autoclave).
  8. Pipetter bactéries resuspendues dans un nombre approprié de puits d’une plaque multipuite de NGM (milieux de culture de nématode, 3 g de NaCl, peptone de 2,5 g, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mL de tampon phosphate (montant par litre : 132 mL K2HPO4 (1 M) et 868 mL de KH2PO4 (1 M)) et agar de 18 g par litre d’eau) additionné d’IPTG (concentration finale de 1 mM) et la carbénicilline (concentration finale de 100 μg/mL).
    1. Utiliser 3,5 mL de médias NGM / puits de la plaque 6 puits, 1 mL par puits d’une plaque 24 puits ou 150 µL / puits de la plaque à 96 puits.
    2. Utilisez 100 μL/puits de bactéries pour plaque 6 puits ; 50 μL/puits pour 24 puits ; ou 20 μL/puits de la plaque à 96 puits. Laisser pour sécher.
      Remarque : Séchage est normalement effectuée sous une hotte à flux stérile pour promouvoir un séchage rapide et uniforme. Il est très important d’un séchage uniforme. Éviter de trop sécher, comme les fissures dans la gélose promouvoir les terriers de vers. Cela conduit à des pertes et le potentiel de colmatage des systèmes de traitement des liquides de ver.
  9. Utiliser les plaques préparées immédiatement ou le stockage à 4 ° C pendant deux semaines pour une utilisation ultérieure.
    Remarque : Pour éviter les plaques ne se dessèchent pas, ils peuvent être operculées avec film plastique paraffine ou placés dans un conteneur scellé hermétiquement avec un essuie-tout humide.

3. entretien et préparation de c. elegans

Remarque : Avant d’entreprendre des expériences, générer une population synchronisée de worms hermaphrodites gravides, adultes comme suit.

  1. Lavez-les gravides adultes (c'est-à-dire, avec plusieurs embryons visibles dans la gonade) de 4 à 6 plaques de NGM 10 cm dans un tube conique de 15 mL en ajoutant 4 mL S basale à plaque, agitant doucement et puis verser dans un tube conique de 15 mL.
  2. Pellet vers par centrifugation à 1 000 x g pendant 30 secondes.
  3. Aspirer le surnageant, en prenant soin de ne pas perturber le culot à vis sans fin.
  4. Ajouter 3,5 mL de solution d’eau de Javel worm (concentration finale 0,5 M NaOH, hypochlorite de sodium 1 %, dans de l’eau stérile) au culot de ver et mélanger en retournant le pendant 1 minute.
  5. Brièvement de vortex et centrifuger à 1 000 x g pendant 30 secondes.
  6. Aspirer ou décanter le liquide surnageant, prenant soin de ne pas pour déranger le culot de ver.
  7. Ajouter 3,5 mL de solution d’eau de Javel fraîche ver au culot ver.
  8. Mélanger vigoureusement vers dans la solution d’eau de Javel. Régulièrement (environ toutes les dix secondes) inspecter visuellement les vers sous un microscope à dissection. Surveillez les cuticules ver de rompre, libérant des oeufs. Une fois que la plupart vers adultes ont été dissous (~ 95 %), diluer l’eau de Javel 15 mL avec basale S pour arrêter la digestion.
    Remarque : Les coquilles d’oeufs sont plus résistantes à l’eau de Javel que les tissus adultes, mais ils peuvent être dissous au cours d’une exposition prolongée. Pour éviter la dissolution de l’oeuf, n’exposez pas les oeufs pour ver la solution d’eau de Javel pendant plus de 7 minutes. Si les coquilles de œufs sont trop endommagés, les embryons vont mourir.
  9. Pellet embryons à 1 000 x g pendant 30 secondes et aspirer ou décanter le liquide surnageant sans enlever le culot d’embryons.
  10. Resuspendre worms dans S basale pour un volume final de 15 mL à diluer le reste de la solution eau de Javel.
  11. Répétez les étapes de lavage (3,9-3.10) trois fois plus pour un total de 4 lavages consécutifs.
  12. Après le quatrième lavage, aspirer le surnageant et ajouter jusqu'à 5 ou 6 mL S stérile basale dans le tube conique de 15 mL. L’objectif est de remettre en suspension les embryons à une concentration de 50 ~ vers par µL.
    Remarque : Le montant de base S dépend de la taille de la pastille de le œuf ; plus le pellet, la plus basale de S est nécessaire.
  13. Incuber le tube conique du jour au lendemain sur un rotateur plateau à température ambiante ou 48 h à 15 ° C. Les larves éclosent, mais arrêter le développement larvaire au stade L1 (L1 diapause) en raison de la privation en nutriments.
  14. Examiner les embryons sous un microscope à dissection afin de vérifier que la plupart d'entre eux ont éclos et arrêté au stade L1 de développement.
  15. Déterminer le nombre de vis sans fin en prenant 20 µL de la préparation de ver et il diluant avec 80 µL S basale. Déposer 10µl de solution diluée ver directement sur une plaque de NGM vide. Répéter 2 fois plus.
    1. Compter les larves dans chaque endroit et déterminer le nombre moyen. Cette moyenne de diviser par 2 pour obtenir un nombre approximatif de worms par µL dans la préparation de ver. Preps ver puis peuvent être utilisés que pour les plaques de propagation ou d’expériences.
      Remarque : Après 4-5 jours, les larves affamées commence à mourir ; Jetez la préparation à ce stade.
  16. Pour la propagation de la souche, pipette un nombre approprié de L1 vers (5 000-6 000) sur des plaques de 3-4 10 cm NGM parsemée concentré OP50 Escherichia coli – « Super » (e. coli OP50 repéré à concentration de X 25 (c.-à-d., 1 L de nuit OP50 cultivée dans des livres donne 40 mL de 25 X OP50 Super) ; 2 mL de cette suspension bactérienne concentrée sont repérées sur chaque plaque NGM 10 cm).
  17. Pour préparer les plaques pour des expériences, effectuez l’une des suivantes (pour utilisation 3.17.1 Configuration du « Protocole de base », pour les étapes d’utilisation « Arni écran mis en place » 3.17.2 - 3.17.4 le cas échéant) :
    1. Pipette de ~ 5 000 plaque de worms/10 cm ensemencé avec Arni ou OP50 superaliment.
    2. Pipette de ~ 500 vers/puits dans une plaque 6 puits ensemencé avec Arni.
    3. Pipette de ~ 300 vers/puits dans une plaque 24 puits ensemencé avec Arni.
    4. Pipette ~ 100 vers/puits dans une plaque à 96 puits ensemencé avec Arni.
      Remarque : Pour obtenir des instructions sur comment l’ARNi a été ensemencé reportez-vous aux étapes de 2,7 à 2,9 en préparation de bactéries de l’ARNi.
  18. Si on utilise une souche féconde de worms, incuber les vers à 25 ° C ~ 44-48 h. utilisation ces vers aussi rapidement que possible après que la population ait atteint l’âge approprié. Cela minimise l’impact de l’éclosion dans les vers pendant le test.
  19. Si la souche utilisée est température-stérile (par exemple, fer-15(b26); FEM-1(HC17) ou glp-4(bn2)), incuber les vers à 15 ° C pendant environ 16 h et puis transfert à 25 ° C pendant 44 heures achever le développement et prévenir l’embryogenèse.

4. liquide tuant test Setup (protocole de base)

Remarque : Il s’agit d’un protocole pour une souche bactérienne et une source de worms.

  1. À l’aide d’un grattoir de cellules, retirez P. aeruginosa téflonées SK et resuspendre dans ~ 5 mL S basale. S’intensifier si nécessaire. Mesurer la densité optique de la suspension bactérienne à l’aide d’un spectrophotomètre (OD600)
  2. Préparation de 24 mL dilué stock P. aeruginosa dans basale S à OD600 ≈ 0.09 (concentration finale de 3 X). Voir 4.6.2 pour contenu final / puits et adapte le volume de dilution bactérienne en conséquence.
  3. Ajouter 21 mL de milieu liquide de tuer lentement (3 g de NaCl, 3,5 g de peptone/L additionné de CaCl2 et MgSO4 à une concentration finale de 1 mM). À l’aide d’une pipette multicanaux, transfert 45 µL des bactéries et des médias dans chaque puits d’une plaque 384 puits.
  4. Laver vers de leur source (c'est-à-direétape 3.17.1) dans un tube conique de 50 mL et laisser les vers de s’installer sous la force de gravitation. Aspirer le surnageant à 5 mL. Resuspendre dans un total de 50 mL S basale.
  5. Répétez l’étape 4.4 deux fois.
  6. À l’aide d’un trieur de ver, trier environ 22 vers dans chaque puits de la plaque 384 puits.
    Remarque : Le programme d’installation supprime chaque ver en ~1.1 µL de liquide. 22 vers seront élèvera à 25 µL, apportant volume de dosage total à 70 µL/puits.
    1. La composition finale de chaque puits se compose de 70 µL. 45 µL de ce volume est ajouté comme moyen de bactéries (bactéries 0,03 OD600 µL 24 S basale et 21 µL SK additionné de CaCl2 et MgSO4). Les autres 25 µL est ajouté avec les 22 vers.
    2. Si la trieuse utilisé ici (voir la Table des matières) est indisponible, les vers peuvent être diluées à une concentration finale de 1 ver/µL en S basale et pipeté 25 µL/puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Toutefois, les résultats peuvent présenter variabilité accrue. Alternativement, il est possible d’utiliser un distributeur de liquid péristaltique, tel que décrit par Leung et collègues19.
  7. Après les vers ont été triés dans la plaque 384 puits, sceller la plaque avec un film perméable au gaz et incuber les boîtes à 25 ° C pendant 24 à 48 heures.
  8. À l’heure souhaitée, utilisez un laveur de microplaque pour laver la plaque 384 puits avec basale S 5 fois au total.
    1. Après le deuxième lavage, aspirer la plupart des médias, laissant environ 20 µL. vigoureusement secouer les plaques à l’aide d’une microplaque vortexer pendant au moins 30 secondes pour détacher les débris du fond du puits).
  9. Après le lavage final, surnageant aspirer jusqu'à 20 µL. Ajouter 50 µL de 0,98 µM nucleic acid stain (voir Table des matières) / puits de la plaque 384 puits, pour une concentration finale de 0,7 µM.
  10. Incuber à température ambiante pendant 12 à 16 h. Ce colorant se tachera seulement vers morts. Après la période d’incubation désiré, plaques de lavage à l’aide de la rondelle de la microplaque pour enlever tout excès tachent (un minimum de 3 lavages).
  11. D’acquisition de données, utilisez un spectrophotomètre ou un microscope automatisé afin d’imager les lumière transmise et fluorescence (531 nm excitation et émission 593).
    1. Utilisez un objectif de faible grossissement pour permettre une image du puits tout à saisir.
    2. Sinon, utiliser des flux vermimetry. Cette technique utilise un cytomètre de flux LOB comme un fluorimètre ver, mesurer la taille et la fluorescence de l’ensemble de l’organisme (p. ex., c. elegans) d’une manière qui ressemble fortement à la cytométrie en flux.
  12. Utilisez le logiciel d’analyse automatique d’image (tels que CellProfiler, un studio d’analyse image libre basé sur MatLab http://cellprofiler.org/) pour calculer les zones fluorescentes et total ver / puits de façon impartiale.
    Remarque : Le quotient de ces chiffres représente la mort de fraction pour chaque puits. Si l'on avait bien 7 colorées vers les 20 total, puis la mort de fraction comprend 0,35 ou 35 %.
    1. Avant la première utilisation, le pipeline de traitement d’image automatisé doit être validé par pointage manuel. Ceci est fait en comparant les résultats de la canalisation automatique aux scores obtenus par visuellement inspecter les images et l’enregistrement des fractions de vers morts pour chacun d’eux. Le processus de validation garantit que les paramètres pour le traitement automatisé d’imagerie sont exactes et représentent les données correctement.

5. adaptation des souches multiples de dépistage c. elegans ou passes rabattues (réglage de l’écran RNAi)

Remarque : Il s’agit d’un écran de RNAi décrit pour une installation de la plaque 24 puits.

  1. Ajouter 1 mL de S basale / puits d’une plaque 24 puits (voir étape 3.17.3). Doucement agiter vers en secouant la plaque, puis transférez-les vers à une plaque de fond de puits 24 vide et stérile. Permettre à worms régler gravitationnellement (~ 5 minutes).
  2. Aspirer le surnageant, en laissant environ 1 mL. Ajouter 7 mL S basale dans chaque puits.
  3. Répétez les étapes 5.1-5.2 un minimum de 2 fois plus. Après le lavage final, aspirer le surnageant, en laissant environ 400 µL.
  4. À l’aide de la fonction de rééchantillonnage de la trieuse de ver, trier 22 vers contre la suspension de ver plaque 24 puits dans chaque puits d’une plaque 384 puits (chaque puits d’une plaque 24 puits rendements 8-12 puits d’une plaque 384 puits).
    1. Pour éviter la famine, les bactéries de pipette en plaques 384 puits (une souche qui sert uniquement d’aliments tels que les OP50, ou une souche pathogène) avant le tri.
      Remarque : Les agents pathogènes peuvent être ajoutés par étapes suivantes 2,3 à 2,5 ou 6,4 à 6,5 et source de nourriture bactéries peuvent être dilués et ajoutés en suivant le même schéma que pour P. aeruginosa.
  5. Après les vers ont été triés dans la plaque 384 puits, ajouter de petites molécules ou autres matériaux d’expérience spécifique.

6. adaptation pour E. faecalis

Remarque : Seules les différences de dosage P. aeruginosa sont décrites.

  1. Préparer une source fraîche d’e. faecalis en ensemençant des bactéries provenant d’un stock congelé sur une gélose BHI (cœur-cervelle) et en incubant pendant 16 à 24 h à 37 ° C.
    Remarque : Réaliser des expériences d’e. faecalis à l’intérieur d’une armoire pour assurer la stérilité de sécurité biologique BSL-2. Utilisez des précautions de sécurité appropriées afin de minimiser les risques d’infection pathogène ou contamination.
  2. Plaques peuvent être stockés à 4 ° C pendant une semaine. Après cette période, remplacer par une nouvelle plaque.
  3. La nuit avant le tri vers, ensemencer 3 à 5 mL stérile BHI avec une seule colonie de E. faecalis. Incuber pendant 12 à 16 h à 37 ° C sous agitation.
  4. Ajouter des bactéries dans les puits que pour P. aeruginosa (3 x bactéries S basale, OD600≈0.09).
    Remarque : Pour E. faecalis, la composition finale du puits est : E. faecalis (OD600≈0.03), BHI = 10 % v/v, avec le volume restant composé de S basale. N’oubliez pas que 25 µL de S basale seront livrés par vers.
    Remarque : E. faecalis produit des biofilms épais qui absorbe la tache fluorescente, provoquant des images floues. Un lavage peut être insuffisant pour enlever ce biofilm. Dans ce cas, les vers peuvent être transférées à une plaque vide à l’aide d’une pipette multicanaux. Pour faciliter le transfert, Tween 20 peuvent être ajoutés à S basale à une concentration finale de 0,1 % (v/v) de Tween 20 dans S basale. Cela contribue à éliminer les vers de biofilm.

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Results

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Paramètres importants pour la performance du test

Une bonne compréhension de la biologie qui sous-tendent ce dosage est nécessaire pour le dépannage et l’optimisation de l’analyse. À cette fin, nous appelons d’abord plusieurs documents clés élucider les mécanismes de la pathogenèse de P. aeruginosa-mediated tuant liquide7,,20. Pourvu que les étapes décr...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce dosage (ou essais similaires où les autres pathogènes sont substituées pour P. aeruginosa ou E. faecalis) est utiles pour diverses fins, notamment la découverte de médicaments. Il est également utile pour traiter des questions biologiques fondamentales, telles que les facteurs de virulence, l’élucidation des voies de défense hôte et la détermination du mécanisme réglementaire impliqués dans l’interaction hôte-pathogène.

Bien que l’essai P. aeruginosa Killing liqui...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été financée par la prévention du Cancer et le Research Institute of Texas (CPRIT) prix RR150044, Welch Foundation Research Grant C-1930 et par le National instituts de santé K22 AI110552 attribué à NVK. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
COPAS FP BioSorterUnion BiometricaCytomètre/trieur de vers de grand nombre d’objets
Cytation 5BioTek
EL406 Distributeur de laveuseBioTek
Multitron ProInfors HT
24 Deep-Well RB BlockThermo Fisher ScientificCS15124
Grenacheuse à plaques 384 puits Bio-OneMPG-781091
Milieu de croissance des nématodes (NGM)Quantité par litre : 18 grammes d’agar, 3 grammes de NaCl, 2,5 grammes de peptone, 1 mL de CaCl2 (1 M), 1 mL de MgSO4 (1 M), 25 mL de tampon phospate et 973 mL de
plaquesSlow Killing (SK) d’eau milli-QQuantité par litre : 18 grammes d’agar, 3 grammes de NaCl, 3,5 grammes de peptone, 1 ml de CaCl2 (1 M), 1 mL de MgSO4 (1 M), 25 mL de tampon de phospate et 973 mL de
destruction lente (SK)Quantité par litre : 3 grammes de NaCl, 3,5 grammes de peptone, 1 mL de CaCl2 (1 M), 1 mL de MgSO4 (1 M), 25 mL de tampon de phosphate et 973 mL d’eau milli-Q
Bouillon de lysogénie (LB)USBiological Life SciencesL1520
Brian Heart Infusion broth (BHI)Research Products International Corp50-488-526
Solutiond’eau de JavelQuantité par 100 mL : 10 mL de solution de NaOH 5 M, 20 mL de solution d’hypochlorite de sodium à 5 % et 70 mL d’eau stérile
S BasalQuantité par litre : 5,85 grammes de NaCl, 6 grammes de KH2PO4, 1 gramme de K2HPO4, et 1 litre d’eau milli-Q
AgarUSBiological Life SciencesA0930
NaClUSBiological Life SciencesS5000
PeptoneUSBiological Life SciencesP3300
CaCl2USBiological Life Sciences
MgSO4Fisher ScientificM63-500
phospatepar litre : 132 mL de K2HPO4 (1M) et 868 mL de KH2PO4 (1M)
KH2PO4Acros Organics7778-77-0
K2HPO4USBiological Life SciencesP5100
5 % Sodium Lumpite SolutionBICCA7495.5-32
Solution NaOHFisher ScientificSS255-1
Breathe-easyDiversified BiotechBEM-1
SYTOX Coloration d’acide nucléique orangeFisher ScientificS11368
souches bactériennes
P. aeruginosa (PA14)
< em>E. faecalis(OG1RF)
E. coli superfood (OP50)
E. coli RNAi exprimant bacteria (HT115)
Worm Strains
glp-4(bn2) (Beanan et Strome, 1992, PMID : 1289064)
PINK-1 ::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID : 29532717)
milieu à d’eau milli-Q Quantité de tampon de

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Falagas, M. E., et al. Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).
  2. Hsueh, P. R., et al. Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 8 (8), 827-832 (2002).
  3. Wang, C. Y., et al. Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes. Clinical Microbiology and Infection. 12 (1), 63-68 (2006).
  4. Yao, Y., et al. Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1. Genome Announcements. 5 (3), (2017).
  5. Utari, P. D., Quax, W. J. Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism. Trends in Microbiology. 21 (7), 315-316 (2013).
  6. Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model. Current Protocols in Chemical Biology. 6 (1), 25-37 (2014).
  7. Kirienko, N. V., et al. Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death. Cell Host & Microbe. 13 (4), 406-416 (2013).
  8. Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence. mSphere. 1 (4), (2016).
  9. Manning, A. J., et al. A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis. Methods. 127, 3-11 (2017).
  10. Marwaha, S., et al. N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (5), 2968-2971 (2014).
  11. Kota, K. P., et al. Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection. PLoS One. 8 (1), e55167(2013).
  12. Arif, M., et al. Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion. Journal of Biotechnology. 154 (1), 76-83 (2011).
  13. Jayamani, E., et al. Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (9), (2017).
  14. Moy, T. I., et al. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model. ACS Chemical Biology. 4 (7), 527-533 (2009).
  15. Rajamuthiah, R., et al. Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 9 (2), e89189(2014).
  16. Breger, J., et al. Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay. PLoS Pathogens. 3 (2), e18(2007).
  17. Garvis, S., et al. Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence. PLoS Pathogens. 5 (8), e1000540(2009).
  18. Zhou, Y. M., et al. An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).
  19. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visual Experiments. (51), (2011).
  20. Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).
  21. Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).
  22. Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response. Virulence. , 1-41 (2018).
  23. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), 1921(2003).
  24. Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).
  25. Tjahjono, E., Kirienko, N. V. A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genetics. 13 (6), e1006876(2017).
  26. Moy, T. I., et al. Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).
  27. Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).
  28. Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116 (3), 755-766 (1992).

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