Pour développer la capacité des laboratoires dans le monde entier pour évaluer l’admissibilité des patients atteints de cancer du poumon pour un traitement par pembrolizumab, d’une manière fiable et reproductible, nous avons développé un test qui utilise le concentré 22 3 anticorps sur un largement disponible autostainer immunohistochimique, pour les spécimens de biopsie et la cytologie.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Avec 22 3 anticorps Anti-PD-L1 se concentrent sur la biopsie et cytologie échantillons provenant de patients atteints de Cancer de poumon Non à petites cellules
Dans cet article
Résumé
Résumé
Pembrolizumab en monothérapie a été approuvé pour le traitement de première et deuxième ligne des patients atteints de cancer PD-L1-exprimant avancé de poumon de non à petites cellules (CPNPC). Essais pour PD-L1 expression avec le PD-L1 immunohistochimie (IHC) 22 3 test diagnostique compagnon, qui donne une proportion de tumeur marquer (TPS), a été validé sur un tissu tumoral. Nous avons développé un optimisé test laboratoire avancés (LDT) qui utilise le concentré 22 3 anticorps (AC) sur un appareil IHC largement disponible pour les spécimens de biopsie et cytologie. Le TPS de PD-L1 a été évalué avec 120 sections appariées ensemble-tumeur tissulaire et des échantillons de biopsie et avec 70 appariés échantillons de biopsie et cytologie (lavages bronchiques, n = 40 ; des épanchements pleuraux, n = 30). Les 22 3 que LDT axée sur le concentré a montré un taux élevé de concordance entre la biopsie (~ 100 %) et de la cytologie des spécimens (~ 95 %) en comparaison avec PD-L1 IHC expression déterminée à l’aide du test de 22 3 compagnon PD-L1 IHC à deux TPS Découpez points (≥ 1 % et ≥ 50 %). La LDT optimisée présentée ici, à l’aide du concentré de Ab 22 3 déterminer l’expression de PD-L1 dans les deux tissus tumoraux et dans les échantillons de cytologie, augmentera la capacité des laboratoires dans le monde entier pour évaluer l’admissibilité des patients atteints de CBNPC pour un traitement par pembrolizumab en monothérapie d’une manière fiable et reproductible.
Introduction
Des essais cliniques récents ont démontré l’efficacité de pembrolizumab, un anticorps monoclonal IgG4 kappa isotype anticorps humanisé qui bloque l’interaction entre la mort cellulaire programmée 1 (PD-1) et ses ligands, PD-L1 et L2-PD, dans le traitement des patients atteints de Advanced NSCLC1,2,3,4.
Actuellement, pembrolizumab est approuvé pour le traitement de NSCLC PD-L1-exprimant chez les deux patients naïfs de tout traitement avec une expression de PD-L1 TPS de ≥50 % et aucun récepteur de facteur de croissance épidermique (EGFR) ou les aberrations de génomique tumorale anaplastic lymphoma kinase (ALK)3 et pour précédemment traités avec un TPS de PD-L1 de ≥ 1 %1.
PD-L1 expression de la protéine détectée par IHC a été largement utilisée comme un dosage de biomarqueurs prédictifs des thérapies anti-PD-1/PD-L1. Dans les essais cliniques pembrolizumab, le TPS de PD-L1 obtenue avec fixés au formol des échantillons de tissus (FFIP) paraffine a déterminé en utilisant le PD-L1 IHC 22 3 compagnon essai5. Cet essai a été approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) et a été marqué en Europe pour la détermination de la tumeur PD-L1 TPS5.
Les options globales supplémentaires dans des institutions pour des évaluations fiables et de qualité de la TPS de PD-L1 avec tdl qui utilisent le concentré d’anticorps 22 3 sont essentielles pour appuyer les décisions cliniques concernant le patient d’admissibilité pour pembrolizumab traitement. Un grand nombre de laboratoires de pathologie n’ont pas accès à l’analyse de l’IHC PD-L1 22 3 diagnostic compagnon. Par conséquent, le développement des TDL fiable et cohérent compatible avec les plateformes d’autostainer IHC supplémentaires, largement disponibles est essentiel.
Par ailleurs, il y a une nécessité d’établir des TDL en utilisant des échantillons de cytologie qui sont le seul spécimen type fréquemment disponible de patients atteints de CBNPC. L’essai de compagnon de PD-L1 IHC 22 3 est validé pour les résections, biopsies à l’aiguille centrale et bronchoscopies seulement si la bronchoscopie donne 100 cellules tumorales. Bien que les types d’échantillon ci-dessus sont souvent obtenus, échantillons cytologiques sont plus facilement perçus et sont le type d’échantillon plus couramment disponible dans certains établissements6,7. Cependant, il n’y a actuellement aucun test diagnostique validé disponibles pour l’évaluation de l’expression de PD-L1 dans des échantillons de cytologie ; TDL fiable compatible avec les échantillons de cytologie faciliterait davantage qualité PD-L1 test.
En outre, lors de l’établissement la validation clinique d’une LDT, l’IHC doit être effectuée de façon similaire au test commercial cliniquement validé correspondant8. Par exemple, plusieurs étapes critiques doivent être vérifiées pour obtenir le même signal dans des coupes sériées comme un titrage d’anticorps, retards de prétraitement, temps d’incubation et amplification systèmes9.
Nous avons récemment développé une LDT optimisée qui utilise le concentré 22 3 anticorps pour évaluer l’expression de PD-L1 sur les biopsies de tumeurs et cytologie échantillons10,11. Nous avons constaté une forte concordance avec la LDT contre le « gold standard » PD-L1 IHC 3 22 dosage10,11. Ce protocole cliniquement validé soutiendra PD-L1 fiables et de haute qualité, stable dans toutes les régions dans le monde.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique local (Human Research Ethics Committee, Centre Hospitalier Universitaire de Nice/Tumorothèque BB-0033-00025).
Remarque : Ce protocole est réglé spécifiquement pour l’utilisation du concentré 22 3 anticorps sur un stainer d’IHC automatisé disponible dans le commerce (appelée pour comme autostainer ici, voir la Table des matières) pour biopsie de la tumeur et les échantillons de cytologie.
1. préparation des échantillons de tissu de tumeur
- Fixer un tissu tumoral dans 10 % de formol tamponné neutre (NBF) dans une cassette.
Remarque : Un tissu tumoral de tumeurs pulmonaires proximales est généralement obtenu par bronchoscopie, effectuée sous sédation modérée par un pneumologue ou un pneumologue. Pour les lésions périphériques et pneumopathie diffuse, une biopsie transbronchique ou aiguille est indiquée. Ces procédures sont généralement effectués dans une salle de chirurgie ou de soins intensifs. - Incorporer la cassette à la paraffine.
NOTE : Fixation peut être réalisée par perfusion ou immersion immédiatement après dissection et nécessite généralement 8 à 10 h. Le volume du fixateur doit être 15 à 20 fois plus élevé que le volume de l’échantillon. Il n’est pas recommandé de fixer le tissu biopsie pendant plus de 10 heures, parce qu’overfixation peut provoquer le masquage de l’antigène. La vitesse de fixation est environ 1 mm/h à température ambiante. - S’infiltrer dans l’échantillon de tissu fixe avec de la cire dans le processeur de tissu (voir Table des matières).
NOTE : Déshydratation est effectuée dans trois bains d’alcool avec augmentation des concentrations de 70 %, 85 % et 90 %. Enfin, l’eau est enlevée par trois bains final d’alcool absolu. La compensation est effectuée dans trois bains de toluène et l’infiltration de cire dans les bains de cire chaude (44 à 60 ° C). - Incorporer le tissu à l’intérieur d’un moule rempli avec de la paraffine fondue (voir Table des matières) et attendez de solidification.
- Article les tissus inclus en paraffine à une épaisseur de 3 μm sur un microtome.
- Transfert le ruban de paraffine pour un verre de microscope chargés positivement glisser (voir Table des matières).
- Sécher la lame pendant 1 h à 37 ° C.
Note : Stocker les coupes de tissus à 2 et 8 ° C (de préférence) ou à température ambiante jusqu'à 25 ° C pour préserver l’antigénicité et tache au bout de 15 jours de sectionnement.
2. préparation des échantillons de cytologie
-
Recueillir des lavages bronchiques dans une solution d’agent de conservation (voir Table des matières).
Remarque : Pour ce faire, technique de bronchoscopie standard est utilisée.- Lavage de la distribution de la bronche à échantillonner. Recueillir le lavage dans un récipient propre. Étiquette du récipient avec le patient premier et nom de famille, date de naissance et source du spécimen.
- Transférer les lavages bronchiques dans un tube conique de 50 mL et ajouter 2 g de DL-le dithiothréitol (poudre) (voir la Table des matières), vortex le tube pendant 30 min et centrifuger à 250 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Retirez le surnageant et ajouter 10 mL d’une solution mucolytique (voir Table des matières).
- Agiter l’échantillon pendant 20 min à vitesse moyenne (niveau 9) et il centrifuger à 250 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Retirez le surnageant et le culot de dépôt dans les tubes de prélèvement contenant 10 % NBF.
- Ajouter 4 gouttes d’un réactif de préparation du bloc cellulaire (voir Table des matières) pour le culot cellulaire.
- Transférer le culot cellulaire sur une cassette, de fixer à 10 % NBF et paraffine-incorporez-le à la préparation de bloc de cellules et de sectionnement (voir étapes 1,1 à 1,7).
3. test de coloration PD-L1
- Allumez l’appareil et l’ordinateur.
- Double-cliquez sur l’icône de l’appareil et choisir l’utilisateur.
- Cliquez sur « Create label » puis sur « Protocole ».
- Double-cliquez sur le protocole 22 3.
Remarque : Le protocole est tout d’abord installé sur l’ordinateur de l’appareil en cliquant sur « créer le protocole ». Le protocole complet est fourni comme supplémentaire 1 fichier. - Écrire l’ID du patient sur l’étiquette et cliquer sur « Imprimer ».
- Coller l’étiquette sur la diapositive.
- Ouvrir le tiroir de la diapositive en appuyant sur le bouton du tiroir qui a été choisi.
- Mettre la lame marquée sur le pad thermique avec l’étiquette orientée vers l’amont et vers l’intérieur.
- Fermer le tiroir de la diapositive.
- Enlever les bouchons des distributeurs et charger les réactifs sur les grilles des réactifs.
- Ouvrez le capot de la passoire et placez les grilles sur le carrousel des réactifs en s’assurant qu’ils s’adapter et maintenir en position.
- Fermez le capot.
- Dans le logiciel, cliquez sur l’instrument qui sera utilisé et cliquez sur « Running ».
- À la fin de la procédure de l’IHC, rincer la lame pendant quelques secondes avec l’eau du robinet et une goutte d’une solution de nettoyage.
- Réhydrater la diapositive avec un bain d’éthanol 100 % et un second bain d’éthanol à 95 % pendant plusieurs secondes.
- Placez la lame dans la machine de recouvrement pour un chargement automatique de la lamelle.
4. l’interprétation de la coloration de PD-L1
Remarque : Un pathologiste qualifié doit effectuer l’interprétation du test IHC PD-L1.
- Évaluer la qualité de la coloration de PD-L1 en analysant les contrôles positifs et négatifs avant l’examen de l’échantillon du patient.
NOTE : Les résultats obtenus sur l’échantillon du patient sont considérés comme non valides si la coloration des contrôles n’est pas acceptable. - Confirmer la présence d’au moins 100 cellules de tumeur viable sous un microscope.
NOTE : Le rapport lorsque l’échantillon du patient a moins de 100 cellules tumorales. - À un faible grossissement de 4 X, évaluer tous les secteurs tumeur bien préservé de positifs et négatifs.
Remarque : À un faible grossissement, coloration de la membrane partielle ou coloration de membrane de faible intensité (1 +) peut être difficile à reconnaître. - Score de coloration de la membrane cellulaire partielle ou complète.
NOTE : La coloration cytoplasmique doit être exclu d’interprétation. - Calculer la TPS en évaluant la proportion de cellules tumorales positif PD-L1 par rapport à toutes les cellules de tumeur présents dans les zones de tumeur bien préservé.
Remarque : Seules les cellules tumorales viables devraient être examinées. Tous les autres éléments cellulaires, tels que les cellules immunitaires, les cellules nécrotiques, les cellules normales et artefacts, doivent être exclus de l’examen.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
À l’aide de la procédure présentée ici et comme le décrit en détail dans récentes publications10,11 de ce groupe, la LDT optimisée a été cliniquement validée avec 120 échantillons de biopsie FFPE NSCLC d’archives provenant de patients ayant subi une chirurgie résection ou une biopsie à l’hôpital universitaire de Pasteur, Nice, entre mars 2007 et mars 2016. En outre, pour l’évaluation d’expression PD-L1 des échantillons de cytologi...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Nous avons validé une LDT optimisée à l’aide du concentré d’anticorps 22 3 PD-L1, en le comparant avec les correspondants des essais commerciaux validés cliniquement10,11. Les 3 22 concentrés LDT à base d’anticorps ont montré un taux élevé de concordance entre la biopsie (~ 100 %) et les échantillons de cytologie (~ 95 %) par rapport à l’expression de PD-L1 IHC déterminée en utilisant le test IHC PD-L1 22 3 ≥ 1 % TPS tant la ≥50 % TPS points de découpage. Comme l...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Cette étude a été commanditée par Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| NovaPrep HQ1 | Novacyt | NA | Solution de conservation pour échantillons de cytologie |
| Novaprep® ; HQ+ B | Novacyt | NA | Solution mucolytique |
| Tissue-Tek VIP 6 | Sakura | 6042 VIP 6 | |
| Tissue-Tek TEC 5 Système de console d’enrobage tissulaire | Sakura | 5229 TEC 5 | |
| lame de microscope en verre SuperFrost Plus | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| DL-Dithiothreitol | poudre Sigma-Aldrich | D3801 | |
| Heidolph Multi Reax Vortex Shaker | Thermo Fisher Scientific | 13-889-410 | |
| Shandon Cytoblock | Thermo Fisher Scientific | 7401150 | |
| 22C3 anti--L1 concentré | anticorps Agilent Dako | #M365329 | |
| -L1 IHC 22C3 pharmDx | Agilent Dako | SK006 | |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | AS480 | |
| BenchMark ULTRA autostainer | Ventana | #750-600 | |
| OptiView HQ Universal Linker | Ventana | #760-700 | |
| OptiView HRP | Multimer Ventana | #760-700 | |
| OptiView Amplification H2O2 | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplifier | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplification Multimère | Ventana | #760-100 | |
| OptiView DAB | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Copper | Ventana | #760-700 | |
| Hématoxyline II | Ventana | #790-2208 | |
| Réactif de bleuissement | Ventana | #760-2037 | |
| Cell Conditioning 1 (CC1) | Ventana | #950-124 | |
| Tissue-Tek Film Coverslipper | Sakura | 4742 |
Références
- Garon, E. B., et al. Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 372 (21), 2018-2028 (2015).
- Herbst, R. S., et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).
- Reck, M., et al. Pembrolizumab versus Chemotherapy for PD-L1-Positive Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).
- Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
- Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).
- Folch, E., Costa, D. B., Wright, J., VanderLaan, P. A. Lung cancer diagnosis and staging in the minimally invasive age with increasing demands for tissue analysis. Translational Lung Cancer Research. 4 (4), 392-403 (2015).
- Padmanabhan, V., et al. Improving Adequacy of Small Biopsy and Fine-Needle Aspiration Specimens for Molecular Testing by Next-Generation Sequencing in Patients With Lung Cancer: A Quality Improvement Study at Dartmouth-Hitchcock Medical Center. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 141 (3), 402-409 (2017).
- Tsao, M. S., et al. IASLC ATLAS of PD-L1 Immunohistochemistry Testing in Lung Cancer. , International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC) Press. (2017).
- Thunnissen, E., de Langen, A. J., Smit, E. F. PD-L1 IHC in NSCLC with a global and methodological perspective. Lung Cancer. , 102-105 (2017).
- Ilie, M., et al. Use of the 22C3 anti-PD-L1 antibody to determine PD-L1 expression in multiple automated immunohistochemistry platforms. PLoS One. 12 (8), e0183023(2017).
- Ilie, M., et al. Use of the 22C3 anti-programmed death ligand 1 antibody to determine programmed death ligand 1 expression in cytology samples obtained from non-small cell lung cancer patients. Cancer Cytopathology. 126 (4), 264-274 (2018).
- Skov, B. G., Skov, T. Paired Comparison of PD-L1 Expression on Cytologic and Histologic Specimens From Malignancies in the Lung Assessed With PD-L1 IHC 28-8pharmDx and PD-L1 IHC 22C3pharmDx. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 25 (7), 453-459 (2017).
- Russell-Goldman, E., Kravets, S., Dahlberg, S. E., Sholl, L. M., Vivero, M. Cytologic-histologic correlation of programmed death-ligand 1 immunohistochemistry in lung carcinomas. Cancer Cytopathology. 126 (4), 253-263 (2018).
- Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
- Stoy, S. P., Rosen, L., Mueller, J., Murgu, S. Programmed death-ligand 1 testing of lung cancer cytology specimens obtained with bronchoscopy. Cancer Cytopathology. 126 (2), 122-128 (2018).
- Ilie, M., Hofman, P. Reproducibility of PD-L1 assessment in non-small cell lung cancer-know your limits but never stop trying to exceed them. Translational Lung Cancer Research. 6 (Suppl 1), S51-S54 (2017).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
