Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Un modèle de souris In Vivo à l’Activation des cellules T CD4 naïves mesure, la prolifération et la différenciation Th1 induite par les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse

18.5K vues

⸱

DOI :

10.3791/58118

⸱

22 août 2018

 ,  ,  , 
1LamImSys Lab, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), 2LamImSys Lab, Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12), 3CIBER de Enfermedades Cardiovasculares

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour le dosage in vivo de l’activation des lymphocytes (cellules T) T CD4 naïves, la prolifération et la différenciation Th1 induite par la moelle osseuse de GM-CSF (BM)-dérivé des cellules dendritiques (CD). En outre, ce protocole décrit BM et T-cellule d’isolement, la génération de DC et DC et les cellules T transfert adoptif.

Résumé

Quantification de l’activation des cellules T CD4 naïves, la prolifération et la différenciation de T helper 1 (Th1) cellules est un moyen utile pour évaluer le rôle joué par les cellules T dans une réponse immunitaire. Ce protocole décrit la différenciation in vitro des progéniteurs de la moelle osseuse (BM) afin d’obtenir de granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) dérivés-cellules dendritiques (CD). Le protocole décrit également le transfert adoptif de peptide d’ovalbumine (OVAp)-chargé de DCs dérivés du GM-CSF et cellules T CD4 naïves des souris transgéniques OTII afin d’analyser l’in vivo de l’activation, la prolifération et la différenciation Th1 de la cellules T CD4 transférés. Ce protocole contourne la limitation de purement en vivo méthodes imposées par l’incapacité de manipuler ou de sélectionner la population cellulaire étudié spécifiquement. De plus, ce protocole permet des études dans un environnement en vivo , évitant ainsi les altérations des facteurs fonctionnels qui peuvent se produire in vitro et y compris l’influence des types de cellules et d’autres facteurs que ne se trouves dans les organes intacts. Le protocole est un outil utile pour générer des changements dans les PED et de cellules T qui modifier adaptative des réponses immunitaires, potentiellement fournir des résultats importants pour comprendre l’origine ou le développement de nombreuses maladies associées immunitaires.

Introduction

Lymphocytes t CD4 et antigène présentant des cellules (CPA) tels que les contrôleurs de domaine sont requis de médiateurs de l’immunité contre les agents pathogènes microbiens1,2. Dans les organes lymphoïdes périphériques, les lymphocytes t CD4 est activés dès la reconnaissance des antigènes spécifiques présentés par TTB3,4,5. Les cellules T CD4 activées se multiplient et se différencient en lymphocytes Th effecteurs spécifiques distinctes qui sont nécessaires au développement d’une bonne réponse immunitaire adaptative6,7. Contrôle de ces processus est essentiel pour produire une défense adaptative suffisante qui tue l’agent pathogène sans produire de dommage tissulaire nocifs8. Lymphocytes Th sont définis en fonction de l’expression ou la production de molécules de surface, des facteurs de transcription et cytokines effectrices et d’exercer les fonctions essentielles et précises en réponse aux agents pathogènes1. Cellules du sous-ensemble de cellules Th1 expriment le facteur de transcription T-bet et la cytokine interféron γ (IFNγ) et participent à la défense de l’hôte contre les pathogènes intracellulaires1. Quantification de l’activation des cellules T CD4 naïves, la prolifération et la différenciation Th1 est un moyen utile d’évaluer le jeu de cellules de rôle T dans une réponse immunitaire.

Ce protocole permet in vivo analyse de la capacité de in vitro -généré dérivé de BM DCs pour moduler l’activation, la prolifération et la différenciation des cellules T CD4 naïves Th1. Le protocole sert également à évaluer la capacité des cellules T CD4 naïves d’être activé, induit à proliférer et Th1 différenciées (Figure 1). Ce protocole polyvalent contourne l’incapacité de manipuler ou de sélectionner la population étudiée cellule purement en vivo protocoles spécifiquement. Les effets de diverses molécules et traitements sur les contrôleurs de domaine peuvent être étudiés en utilisant BM de souris génétiquement modifiées5 ou en traitement ou en manipulant génétiquement isolées de cellules BM9. De même, les lymphocytes T peuvent être explorées en obtenant des lymphocytes T pour transfert adoptif provenant de différentes sources ou après plusieurs manipulations3,8,10.

Les principaux avantages du présent protocole sont de deux ordres. Activation des cellules t, la prolifération et la différenciation Th1 sont analysés avec une approche de cytométrie de flux ; et ceci est combiné avec les études in vivo , ainsi éviter des altérations qui peuvent se produire in vitro et y compris les types de cellules et d’autres facteurs ne trouves que dans les organes intacts11.

L’utilisation de colorants vitaux est une technique largement utilisée pour suivre la prolifération cellulaire tout en évitant l’utilisation de la radioactivité. La mesure de la prolifération avec ces réactifs est issue d’une dilution de la teinture après division cellulaire. En outre, ces colorants peuvent être détectés à plusieurs longueurs d’onde et sont facilement analysés par cytométrie en combinaison avec des anticorps fluorescents ou les marqueurs multiples. Nous mettons en évidence l’utilité de ce protocole en montrant comment l’activation des cellules T, la prolifération et la différenciation Th1 peuvent être analysés par cytométrie en flux.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Des procédures expérimentales ont été approuvées par la Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) et la communauté autonome de Madrid, conformément aux directives européennes et espagnoles. Les souris ont été élevés dans des conditions (SPF) libres de pathogènes spécifiques et ont été euthanasiés par inhalation de dioxyde de carbone (CO2).

1. isolement des cellules de moelle osseuse de souris de Tibias et fémurs

Remarque : La souche de souris C57BL/6 congéniques porte le marqueur de leucocyte différentiel Ptprcune, généralement reconnu comme CD45.1 ou Ly5.1, alors que les souches de C57BL sauvage porteuses de l’allèle Ptprcb , connu comme CD45.2 ou Ly5.2. On peuvent distinguer les variantes CD45.1 et CD45.2 par cytométrie en flux, en utilisant des anticorps. Souris CD45.1, CD45.2 et CD45.1/CD45.2 peuvent être utilisés comme sources de cellules ou comme bénéficiaires pour transfert adoptif, permettant le suivi des populations cellulaires distincts par cytométrie en flux. Servir de préférence l’âge- et même sexe mâles ou femelles souris au-dessous de 12 semaines d’âge.

  1. Préparation des fémurs et Tibias
    1. Euthanasier la souris en utilisant le protocole approuvé par le Comité institutionnel de soins aux animaux.
    2. Désinfecter les membres postérieurs en vaporisant sur la surface des animale avec l’éthanol à 70 %.
    3. Utiliser des scalpels, pinces et ciseaux stériles. Avec un scalpel, faire une incision dans la peau et retirer la peau de la partie distale de la souris, y compris la peau recouvrant l’extrémité postérieure. Peler la peau autour du muscle du mollet inférieure et enlever la peau des pieds entièrement (Figure 2 a, 2 b).
    4. Séparer le muscle quadriceps fémoral à l’aide d’un scalpel. Équipe l’articulation de la hanche sans casser la tête du fémur. Retirez les muscles du tibia à l’aide d’un scalpel (Figure 2, 2D). Séparer le fémur du tibia sans casser les extrémités des os.
    5. Garder les os dans une boîte de Pétri contenant 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline/streptomycine dans un milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 glacée 1 x.
  2. Isolement de cellules
    Remarque : Toutes les étapes subséquentes doivent être exécutés sous un capot de la culture et avec du matériel stérile pour éviter toute contamination.
    1. Dans une boîte de Petri stérile, découpez soigneusement les extrémités proximales et distales de chaque os avec un scalpel.
    2. Rincer les os à plusieurs reprises avec un volume total de 10 mL de chaleureux milieu RPMI complet (RPMI + 10 % FBS, 2 mM EDTA, 1 % pénicilline/streptomycine, 20 mM HEPES, 55 µM 2-mercaptoéthanol, pyruvate de sodium 1 mM et 2 mM de L-glutamine). Rincer les os des deux extrémités à l’aide d’une aiguille 25 G attachée à une seringue de 1 mL.
    3. Transférer l’effluate dans un tube conique de 50 mL, équipé d’un filtre web en nylon 70 µm. Soigneusement déloger les conglomérats de débris et de la cellule par doux en remuant et pipetage.
    4. Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 10 min à température ambiante (RT).
    5. Resuspendre le culot dans 1 mL de tampon de lyse de rouge-sang-cellule froide (0,15 M NH4Cl + 1 mM KHCO3 + 0,1 mM EDTA, pH ajusté à 7,2 avec 1 N HCl, 0,4 µm stérile filtrée et stockés à 4 ° C). Maintenir sur la glace pendant 5 min avec le manuel secouant.
    6. Ajouter 10 mL de tampon de froid (1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) + 2 mM EDTA + 2 % d’albumine sérique bovine (BSA)) pour inactiver et lavent le tampon de lyse des globules rouges.
    7. Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C.
    8. Laver les cellules avec 25 mL de milieu RPMI complet et centrifuger à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C.
    9. Remettre en suspension les cellules dans 5 mL de milieu RPMI complet. Mélanger 50 µL de la suspension cellulaire de 1:1 avec le bleu trypan. Déterminer le nombre de cellules dans une chambre de comptage au microscope. Calculer le nombre de cellules à l’aide de la formule : cellules/mL = [(cellule non teinté comte/4) x 2 x 10 000]12.
      Remarque : Cette méthode rendements 40 x 106 à 60 x 106 OS de cellules de la moelle par 8 non infectés à 12 souris de C57BL/6 semaines.
    10. Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C.

2. DC différenciation, de Maturation et de chargement de l’antigène

  1. Cellule de BM récolte
    1. Amorcer la culture complète sur 6 puits ultra-low-attachment marbres à 106 cellules / mL de milieu, généralement en 5 mL par puits. Macrophages différenciés seront fixe sur la plaque de culture. Après 12 h, transférer le surnageant, qui contient principalement des monocytes, pour nettoyer les plaques 6 puits, jeter les vieilles plaques 6 puits avec les macrophages collés.
    2. Afin de promouvoir la différenciation cellulaire, de la culture les cellules non adhérentes à 5 x 105 cellules / mL en général de 5 mL par puits du milieu RPMI complet contenant 20 ng/mL obtenues dans le commerce recombinante murine GM-CSF à 37 ° C et 5 % de dioxyde de carbone (CO2) et observer tous les jours.
    3. Tous les 3 jours, faire tourner les cellules suspendues et recueillir les cellules adhérentes avec 5 mM EDTA dans du PBS et tournez en bas. Mélanger et remettre en suspension à 5 x 105 cellules/mL dans un milieu frais contenant 20 ng/mL rm-GM-CSF.
    4. Le jour 8, prélever des cellules adhérentes et détachés comme ci-dessus et remettre en suspension à 5 x 105 cellules/mL en moyenne contenant 20 ng/mL GM-CSF et 20 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) pendant 24 h dans une culture de tissus non traitées boîte de Petri stérile pour induire la haute MHC-II , Expression CD80 et CD86.
    5. Différenciation de cocher DC par cytométrie en flux comme indiqué dans l’étape 2.2.
  2. Différenciation de cytométrie de flux et de l’analyse de la Maturation.
    1. Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C. Répéter cette étape deux fois.
    2. Récepteurs Fc de bloc en incubant le culot resuspendues dans souris Fc bloqueur des récepteurs (purifiée anti IgG CD16/CD322 b anticorps de souris) pendant 15 min à 4 ° C selon les instructions du fabricant.
    3. Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C.
    4. Pour chaque sonde, remettre en suspension les cellules 250 000 à 300 µL de tampon de cytométrie de flux (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2 % de BSA) à 4 ° C.
    5. Transférer 30 µL de solution de cellules / puits d’une plaque à 96 puits.
    6. Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C.
    7. Jeter le surnageant et ajouter 30 µL de contenant des anticorps tampon pour chaque bien suivant les indications du fabricant. Incuber les cellules avec des anticorps pendant 20 min à 4 ° C.
      Remarque : Généralement employées des marqueurs pour les contrôleurs de domaine, les monocytes et les macrophages sont CD11b CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 et CD86 (Figure 3).
    8. Centrifuger les échantillons à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension dans 200 µL / puits de tampon de cytométrie en flux froid contenant un marqueur pour exclure les cellules mortes (p. ex., l’iodure de propidium, 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ou un colorant réactif amine ) de concentration recommandée par le fabricant13.
    9. Contrôler la différenciation cellulaire en transférant les échantillons aux tubes de cytométrie en flux et en effectuant l’analyse de cytométrie de flux à l’exclusion des cellules mortes aux jours 0, 3, 6 et 9.
  3. Chargement de l’antigène de DC.
    1. Jour 8, centrifuger les échantillons à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension les pellets dans 200 µL de milieu (RPMI + 10 % FBS sans antibiotiques). Répéter cette étape deux fois.
    2. Incuber les contrôleurs de domaine avec 10 µg/mL OVAp (323-339 ; ISQAVHAAHAEINEAGR) par 1 x 107 DCs dans 1 mL de milieu (IPMB + 1 % FBS) dans un tube en plastique pendant au moins 30 min à 37 ° C. Utiliser DCs OVAp-chargé non comme une condition de contrôle négatif.
    3. Centrifuger les échantillons à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension les pellets dans 200 µL de milieu RPMI complet. Répéter cette étape deux fois.
    4. Centrifuger les échantillons à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension les pellets dans 200 µL de milieu (RPMI + 10 % FBS) à 2 x 106 cellules/mL.

3. isolement des cellules T CD4 naïves de OTII souris

Remarque : Cette méthode donne environ 100 x 106 spleenocytes par 8 non infectés à 12 souris de C57BL/6 semaines. Les mâles et les femelles peuvent être utilisées. Lymphocytes t CD4 peut être isolés dans la rate ou les ganglions lymphatiques ; Lymphocytes t CD4 compte pour environ 25 % et 50 % des cellules de ces organes, respectivement. Effectuez les opérations suivantes dans des conditions stériles.

  1. Isoler inguinales, axillaires, brachiales, du col utérin et mésentériques ganglions lymphatiques et la rate des souris transgéniques OTII (Figure 4) et les transférer sur un plat de Pétri contenant 10 mL de milieu RPMI complet de plastique.
  2. Rincer la crépine de la cellule avec 2 mL de milieu RPMI complet et retirez-la du tube de 50 mL. Transfert de ganglions lymphatiques et la rate à une crépine de cellule de 70 µm placée dans un tube de 50 mL. Homogénéiser à l’aide d’un piston de la seringue (Figure 5) et ajouter moyen à 15 mL.
  3. Centrifuger les échantillons à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C et Resuspendre le culot dans 15 mL de milieu RPMI complet. Répéter cette étape deux fois.
  4. Pour suspension de cellules de rate, resuspendre le culot cellulaire et lyser les globules rouges, comme il est indiqué dans l’étape 1.2.5.
  5. Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C.
  6. Laver les cellules avec 25 mL de milieu RPMI complet et centrifuger à 250 x g pendant 5 min à température ambiante.
  7. Remettre en suspension les cellules dans 5 mL de milieu. Mélanger 50 µL de la suspension cellulaire de 1:1 avec le bleu Trypan. Déterminer le nombre de cellules à l’aide d’une chambre de comptage au microscope. Calculer le nombre de cellules à l’aide de la formule : cellules/mL = [(cellule non teinté comte/4) x 2 x 10 000]12.
  8. Répétez l’étape 2.2.2.
  9. Suivant les instructions du fabricant, incuber les cellules avec des dilutions de 1:800 d’anticorps biotinylé CD8α, IgM, B220, CD19, MHCII (I-Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25 et DX5 pendant 30 minutes sur la glace pour plus tard une sélection négative des cellules T CD4.
  10. Suivant les instructions du fabricant et selon le nombre de cellules et la capacité des perles, calculer la quantité nécessaire de microbilles magnétiques-streptavidine et isoler les cellules CD4 T à l’aide d’un séparateur de cellule magnétique et le cas échéant colonnes de séparation.
  11. Remettre en suspension les cellules dans 5 mL de milieu RPMI complet et les garder sur la glace lors du décompte des cellules vivantes, comme indiqué au point 3.7.
  12. Extrait 2 x 105 cellules et vérifier la pureté des cellules recueillies à l’aide d’anticorps fluorescents dans un cytomètre en flux à l’aide de fabricant-recommandant des dilutions d’anticorps anti-CD3, CD4 et CD8 de B220.
  13. Pour souiller les cellules T CD4/OTII naïf isolé, resuspendre 106 cellules de 500 µL de tampon (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2 % de BSA). Préparer 500 µL de tampon (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2 % de BSA) contenant double la concentration finale de fabricant-recommandé de colorant traceur cellule vitale. Mélanger les deux solutions en ajoutant lentement la solution de traceur cellulaire à la suspension cellulaire. Incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C.
  14. Laver les cellules avec 5 mL de milieu RPMI complet et centrifuger à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C. Répéter cette étape deux fois. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de milieu RPMI complet à 1 x 107cellules/mL.

4. in Vivo de l’Activation, la prolifération et dosage de différenciation Th1

Remarque : La cellule vitale traceur colorant carboxyfluorescéine diacétate succinimidyl ester (CFSE) et autres colorants succinimidyl ester-basée, qui sont excités et émettent de fluorescence à différentes longueurs d’onde, sont largement utilisés pour évaluer la prolifération des lymphocytes par flux cytométrie en flux, en raison de leur intensité de fluorescence élevée, longue durée de vie, faible variabilité et une toxicité faible14.

  1. Moutschen cellules de transfert par voie intraveineuse (i.v.) 1 x 106 cellules vitales vivantes traceur naïf de colorant coloré T CD4/OTII dans 100 µL de PBS par souris. Les cellules T marquées peuvent être transférées Moutschen par veine caudale ou rétro-orbitaire injection15; dans les deux cas, les cellules seront abrite les organes lymphoïdes (Figure 6 a).
  2. Contester les souris destinataires un jour plus tard en transférant Moutschen 100 000 DCs de chargement OVAp LPS-mûri par voie sous-cutanée (s.c.) dans les pattes (Figure 6 b).
  3. Récolter poplitée les ganglions lymphatiques des souris bénéficiaires et les mélanger jusqu'à l’obtention de suspensions de cellules du même suivant les mêmes étapes comme décrits aux points 3.1 et 3.2. Cela après l’immunisation de mesurer l’activation des lymphocytes T CD4/OTII jour 2 et le jour 5 pour mesurer la prolifération et la différenciation Th1.
  4. Pour analyser l’activation des cellules T au jour 2, détachant les cellules avec des anticorps fluorescents contre CD4 et CD25 CD69 (éventuellement CD45.1 et CD45.2) et détermine le pourcentage de C69+CD25+ T cells dans la population CD4. Analyse par cytométrie en flux (Figure 7).
  5. Pour contrôler la prolifération des cellules T au jour 5, tacher les cellules en utilisant des anticorps fluorescents appropriés contre CD4 et éventuellement les CD45.1 et les CD45.2. Analyser la décroissance du signal colorant traceur cellule vitale dans la population CD4 par cytométrie en flux (Figure 8). Plusieurs paramètres peuvent être déterminées dans ces études, telles que le nombre de divisions cellulaires subi par les cellules marquées avec le colorant traceur de cellule vitale, le pourcentage de cellules en Division à chaque pic de fluorescence et le pourcentage de cellules en division dans la cellule opération population.
  6. Pour déterminer la différenciation Th1 au jour 5, 400 000 cellules de plaque / puits d’une plaque 96 puits dans 200 µL de milieu RPMI complet contenant 1 µM ionomycine et 10 ng/mL phorbol 12 myristate 13 acétate (PMA) pendant 6 h à 37 ° C dans l’incubateur. Pour les dernier 4 h, ajouter 3 à 10 µg/mL bréfeldine A pour bloquer la sécrétion de cytokines au milieu.
  7. Centrifuger les plaques pendant 5 min à 250 x g à 4 ° C. Jeter le surnageant par retournement de la plaque à 96 puits.
  8. Répétez l’étape 2.2.2.
  9. Tacher les membranes cellulaires en incubant pendant 15 min à 4 ° C pour 30 µL de tampon (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2 % de BSA) contenant des anticorps de CD4 et éventuellement de CD45.1 et CD45.2 à des dilutions de fabricant-recommandé. Laver les cellules en ajoutant 150 µL de tampon (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2 % de BSA) et centrifuger les plaques pendant 5 min à 250 x g à 4 ° C et jeter le surnageant.
  10. Fixer les cellules en ajoutant 100 µL de saccharose paraformaldehyde/1% 2 % pendant 20 min à RT. centrifuger les plaques pendant 5 min à 1 000 x g et 4 ° C. Jeter le surnageant.
  11. Permeabilize des cellules en ajoutant 50 µL de tampon de perméabilisation intracellulaire (1 x PBS + 0,1 % de BSA, 0,01 M HEPES, 0,3 % de saponines) et incuber 30 min à 4 ° C.
  12. Ajouter 150 µL de PBS et centrifuger pendant 5 min à 1 000 x g à RT. jeter le surnageant.
  13. Détachant des cytokines intracellulaires en ajoutant 30 µL du fluorophore conjugué anti anticorps IFNγ dans un tampon (PBS + 0,1 % de saponines) et incuber 30 min à température ambiante.
  14. Laver les cellules en ajoutant 150 µL de tampon (PBS + 0,1 % de saponines). Centrifuger les plaques pendant 5 min à 1 000 x g à RT et éliminer le surnageant. Répéter cette étape deux fois.
  15. Analyser les populations de cellules par cytométrie en flux (Figure 8).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

La figure 1 illustre les étapes décrites dans le présent protocole. La figure 2 illustre l’isolement et la culture de cellules de souris BM. L’ajout de GM-CSF et de LPS à ces cultures permet la génération in vitro et de maturation des DCs. Figure 3 illustre l’analyse de cytométrie en flux de la différenciation et la maturation de la MDD obtenus dérivé de GM-CSF BM de DCs. OVAp-chargé et isol...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Ce protocole permet la caractérisation de la capacité des dérivés BM DCs pour moduler l’activation, la prolifération et la différenciation des cellules T CD4 naïves. Par ailleurs, également utilisable pour évaluer la sensibilité des cellules T CD4 à modulation par DCs dérivé de BM. Avec ce protocole, les changements dans ces événements peuvent être mesurées en vivo.

Selon l’hypothèse examinée, plusieurs combinaisons de lymphocytes T et les contrôleurs de domaine peuvent être utilisés....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Remerciements

Nous remercions le Dr Simon Bartlett pour l’édition anglaise. Cette étude a été financée par des subventions de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (IP14/00526 ; PI17/01395 ; CP11/00145 ; CPII16/00022), le programme de Miguel Servet et la Fundación Ramon Areces ; avec un cofinancement de l’Europeo de Fondo de Desarrollo Regional (FEDER). Le CNIC est pris en charge par le ministère de l’économie, industrie et compétitivité (MEIC) et la Fondation CNIC Pro et est un Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). RTF est fondée par la Fundación Ramon Areces et CNIC, VZG par ISCIII, BHF par Instituto de Investigación Sanitaria hôpital 12 de Octubre (imas12) et JMG-G ISCIII Miguel Servet programme et imas12.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
ÉthanolVWR Chemicals20,824,3655 L
CiseauxOutils de science fine (F.S.T.)14001-12
Pincepour outils de sciences fines (F.S.T.)11000-13
Pince fineOutils scientifiques fins (F.S.T.)11253-20
ScalpelOutils de sciences fines (F.S.T.)10020-00Boîte de 100 lames
Sérum fœtal bovinSIGMAF7524
Pénicilline/streptomycineLONZADE17-602E
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)GIBCO21875-034
Boîtes de Pétri stérilesFalcon353003
aiguille de calibre 25BD Microlance 3300600
Seringue de 1 mlNovicoN15663
Tubes coniques de 15 mlFalcon352096
Tubes coniques de 50 mlFalcon352098
70 &mu ; m filtre en nylonBD Falcon352350
Tampon de lyse du sang rougeSIGMAR7757100 Ml
EDTASIGMAED2SS-250
Albumine sérique bovineSIGMAA7906100 g
Trypan blueSIGMA302643-25G
Plaques de cultureFalcon353003
Acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthananesulfonique (HEPES)CambrexBE17-737E
Bêta-mercaptoéthanolMerck8-05740-0250
Pyruvate de sodiumLONZABE13-115E
L-glutamineLONZABE17-605E
Granulocyte murin recombinant Facteur de stimulation des colonies de macrophages (GM-CSF)Prepotech315-03
lipopolysaccharide (LPS)SIGMA-ALDRICHL2018
96-well-plateCostar3799
v450 anti-souris CD11b anticorpsBD Biosciences560455
PE anti-souris Anticorps CD64BioLegend139303
PE anti-souris Anticorps CD115BioLegend135505
FITC anti-souris Anticorps CD11cBioLegend117305
FITC Anticorps anti-souris MHCIIBioLegend125507
APC Anticorps CD86 BioLegend105011
APC anti-souris Anticorps CD80BioLegend104713
Tubes de cytométrie en fluxZelian300800-1PS 12X75 5mL
OTII Peptided’ovoalbumineInvivoGen323-339
anticorps CD8&alpha biotinylé anti-sourisTonbo Biosciences30-0081-U500
anticorps IgM biotinylé anti-sourisBioLegend406503
anticorps B220 biotinylé anti-sourisTonbo Biosciences30-0452-U500
anticorps CD19 biotinylé anti-sourisTonbo Biosciences30-0193-U500
anticorps anti-souris biotinylé MHCII (I-Ab)BioLegend115302
anticorps CD11b biotinylé anti-sourisTonbo Biosciences30-0112-U500
anticorps CD11c biotinylé anti-sourisBioLegend117303
anticorps CD44 biotinylé anti-sourisBioLegend103003
biotinylé Anticorps CD25Tonbo Biosciences30-0251-U100
Anticorps DX5 biotinylé anti-sourisBioLegend108903
microbilles magnétiques enrobées de streptavidineMACS Miltenyi Biotec130-048-101
Séparateur de cellules magnétiqueMACS Miltenyi Biotec130-090-976Séparateur QuadroMACS
Colonnes de séparationMACS Miltenyi Biotec130-042-401
Anticorps CD4 anti-sourisPEBioLegend 100408
Anticorps CD3 anti-sourisBioLegend100235
FITC Anticorps CD8 anti-sourisTonbo Biosciences35-0081-U025
Cell Violet TracerThermofisherC34557
Anticorps anti-souris CD25 APC TonboBiosciences20-0251-U100
Alexa647 anti-souris CD69 AnticorpsBioLegend104518
PerCPCY5.5 anti-souris CD45.1Tonbo Biosciences65-0453
APC anti-souris CD45.1anticorps Tonbo Biosciences20-0453
PECY7 anti-souris CD45.1Tonbo Biosciences60-0453
FITC anti-souris CD45.2 anticorpsTonbo Biosciences35-0454
IonomycineSIGMA-ALDRICHI0634
Phorbol 12 Myristate 13 Acétate (PMA)SIGMAP8139
Brefeldin A (BD GolgiPlug)BD555029
ParaformaldéhydeMillipore8-18715-02100
Tampon de perméabilisation intracellulaireeBioscience00-8333
APC anticorps anti-souris IFNgTonbo Biosciences20-7311-U100
Fc-block (anti-souris CD16/CD32)Tonbo Biosciences70-0161-U100
B6. souris SJL CD45.1Le laboratoire Jackson002014
BD LSRFortessa&trade ; Analyseur de cellulesBD Biosciences649225
DAPI SolutionThermofisher62248

Références

  1. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
  2. Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
  3. Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37(2014).
  4. Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
  5. Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
  6. Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
  7. Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
  8. Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9(2018).
  9. Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
  10. Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591(2017).
  11. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627(2014).
  12. Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976(2016).
  13. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
  14. Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
  15. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  16. Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  17. Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Activation des lymphocytes T CD4 naïfsTransfert adoptif de cellulesAnalyse par cytométrie en fluxIsolement de la moelle osseusePrélèvement des ganglions lymphatiquesProlifération des lymphocytes TMarquage intracellulaire des cytokinesSouris transgéniques OTII
Un modèle de souris In Vivo à l’Activation des cellules T CD4 naïves mesure, la prolifération et la différenciation Th1 induite par les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.