Article de méthode

Synthèse et caractérisation de 1, 2-Dithiolane modifiée Peptides auto-assemblage

DOI :

10.3791/58135

⸱

20 août 2018

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Fairfield University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un protocole pour la synthèse d’un 1, 2-dithiolane modifiée peptide et la caractérisation des structures supramoléculaires résultant de la peptide auto-assemblage.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce rapport met l’accent sur la synthèse d’un N-terminal 1, 2-dithiolane modifiée auto-assemblage de peptide et la caractérisation du résultant self-assembled structures supramoléculaires. La voie de synthèse profite de la synthèse de peptide de phase solide avec l’accouplement sur résine de la molécule précurseur dithiolane, 3-(acetylthio) -2-acide propanoïque (acetylthiomethyl) et le thioacétate assistée par micro-ondes deprotection du peptide N-terminale avant dernier clivage de la résine pour donner le 1, 2-dithiolane modifiée peptide. Après la purification de la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) du peptide 1, 2-dithiolane, dérivé de la nucléation core du peptide Aβ associée à la maladie d’Alzheimer, le peptide est avéré s’auto-assembler en fibres amyloïdes Croix-β. Protocoles pour caractériser les fibres amyloïdes par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR), spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD) et microscopie électronique à transmission (TEM) sont présentés. Les méthodes de modification de la N-terminale avec une portion de 1, 2-dithiolane aux peptides auto-assemblage bien caractérisés peuvent maintenant être explorées comme systèmes modèles pour élaborer des stratégies de modification après montage et Explorer chimie covalente dynamique sur surfaces de peptide supramoléculaire de nanofibres.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La liaison peptidique robuste formant chimie impliquée dans la synthèse de peptide de phase solide et la possibilité de contrôler la composition et la durée d’une séquence font les peptides qui s’auto-assembler en structures supramoléculaires un champ largement documenté. Les facteurs qui contrôlent et stabilisent les structures auto-assemblées peptide, y compris la chaîne latérale stérique et interactions électrostatiques, des liaisons hydrogènes et effets hydrophobes1, constituent un ensemble de règles de conception. Comme des recherches menées sur ces règles de conception fondamentale continuent de progresser, l’étape logique suivante en peptide auto-assemblage consiste à élargir la diversité des fonctions et des structures à base de peptides. Lors de l’assemblage des peptides sont un biomatériau polyvalent qui ont été utilisés pour de nombreuses applications biomédicales en syntonisant le peptide séquence ou montage conditions2,3,4, l’élaboration de stratégies pour modifications après montage peptide nanofibres5,6,7,8,9 reste un domaine relativement inexploré.

Disulfure dynamique échange thiol chimie et à la surface des structures supramoléculaires est un secteur qui a le potentiel d’engendrer des biomatériaux nouveaux et fonctionnels. L’incorporation des portions de 1, 2-dithiolane (généralement un dérivé de l’acide lipoïque (la) ou l’acide asparagusique (aa)) ont été signalés dans un liposome systèmes10,11, copolymères de bloc12,13et en tant que ancres à surfaces14,15de l’organisation. Ici, nous rapportons la synthèse et la caractérisation d’un auto-assemblage peptide dérivé de la nucléation core du peptide Aβ associée à la maladie d’Alzheimer qui est modifiée à l’extrémité N-terminale avec un 1, 2-dithiolane groupe fonctionnel16, 17. Les fibres qui en résulte supramoléculaires servent désormais une plateforme expérimentale pour étudier la réactivité disulfure intracirconscriptions et thiols en surface des fibres amyloïdes18supramoléculaire.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. synthèse et Purification de 1, 2-Dithiolane modifiés Peptide

  1. Synthèse d’un précurseur dithiolane, 3-(acetylthio) -2-(acetylthiomethyl) acide propanoïque19.
    1. Ajouter 1 g 3-bromo - 2-(bromométhyl) l’acide propionique (1 équiv.) dissous dans une quantité minimale de 1 NaOH M (environ 4 mL) pour un ballon à fond rond 25 mL réaction en agitant à 55 ° C. Sceller le ballon à réaction avec un septum et placer sous atmosphère d’azote.
    2. Préparer une solution contenant 1,49 g de potassium thioacétate (3.2 équiv.) dans 4 mL d’eau désionisée et 3 mL d’acide sulfurique 2 M (H2SO4) pour créer thioacétique acid in situ.
    3. Tirez la solution acide thioacétique dans une seringue en plastique jetable 10 mL et placer une aiguille sur la seringue. Ajouter le mélange goutte à goutte le ballon à réaction en perçant à travers le septum avec l’aiguille. Continuer la réaction du jour au lendemain à 55 ° C.
    4. Surveiller la réaction par chromatographie sur couche mince (TLC) sur gel de silice 60 F254 plaques à l’aide d’un mélange de méthanol et de dichlorométhane (1:9). Visualiser la progression de la réaction de tache de vert de bromocrésol. Le produit a un Rf = 0,57.
    5. Après la réaction est complète et refroidi à la température ambiante, acidifier le mélange à pH 1 avec 2 M H2SO4. Une huile jaune sépare hors de la solution.
    6. Extrait le produit avec du chloroforme froid (40 mL x 3). Combiner les couches organiques et sécher sur sulfate de magnésium. Retirez le chloroforme sous pression réduite.
    7. Confirmer l’identité du produit isolé, 1, par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN), comme illustré dans les Figures 1 b et C. Attendons les résultats suivants : 1H RMN, CDCl3, 300 MHz : d = 10,1 (b, 1 H), 3.2 (m, 4 H), 2,9 (m, 1 H) 2.4 (s, 6 H) ; 13 RMN du 13C, CDCl3, 75 MHz : d = 195.1 (CH3COS-), 177,6 (-OOHC), 45,1 (-CH2S), 30.5(Caba), 29.2 (-SCOCH3).
      Remarque : Le produit est une huile jaune et a un rendement global de 83 %. Utiliser le produit sans davantage de purification.
  2. RCR et le couplage sur la résine de Dithiolane précurseur
    Note : La synthèse de peptide de phase solide décrite ci-dessous a été effectuée sur un synthétiseur de peptide automatisé, suivant les protocoles du fabricant recommandée. Réactifs et des paramètres peuvent être adaptés pour d’autres instruments commerciaux ou lors de l’utilisation spécialisée des acides aminés.
    1. Peser de 0,156 g de résine de 4-methylbenzhydrylamine (MBHA) patinoire amide (0,1 mmol) et les placer dans un réacteur. Gonfler la résine dans le diméthylformamide (DMF) pendant au moins 15 minutes avant le début de la synthèse.
    2. Peser 4 équivalents de chaque fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) protégé des acides aminés (0,4 mmol) dans la séquence et 0,152 g de N, N, N', N'- tétraméthyl-O-(1H- benotriazol-1-yl) uranium hexafluorophosphate (0,4 mmol, HBTU) pour chaque acide aminé dans la séquence. Chaque cartouche contient le Fmoc-protégé des acides aminés et HBTU.
    3. Après l’exécution de synthèse avant tous les contrôles sur le synthétiseur (remplir les réactifs, vidées lignes réactif et pressurisé tous les flacons de réactifs), placer les cartouches acides aminés dans le carrousel au C' n ' direction terminus. Placez une cartouche vide après la position finale en acide aminé pour la dernière étape de déprotection Fmoc N-terminale.
    4. Synthétiser le peptide avec les paramètres recommandés standards.
      1. Déprotéger le groupe Fmoc de la résine avec 5 mL de pipéridine de 20 % dans le DMF (5 min x 2).
      2. Laver la résine avec DMF (6 x 5 mL) avant l’étape de l’accouplement.
      3. Pour une couplage unique étape, ajouter 4 mL de 0,4 M N-méthylmorpholine dans le DMF à l’aminoacide Fmoc-protégés et HBTU. Activer la solution Fmoc-protégé des acides aminés pendant 30 s avant de les transvaser la solution dans la cuve de réaction.
        Remarque : Le synthétiseur de peptide automatisé mêle la résine et la solution de propagation N2 gaz toutes les 30 s pendant 20 min alors que la réaction de couplage a lieu. Pour la synthèse peptidique manuelle, placer la cuve de réaction dans un agitateur orbital à basse vitesse pendant la durée de l’étape de l’accouplement.
      4. Egoutter la solution et laver la résine avec DMF (3 x 5 mL).
      5. Répétez les étapes 1.2.4.1 par 1.2.4.4 pour chaque acide aminé Fmoc-protégé dans la C' n '-direction terminus pour synthétiser le peptide d’intérêt.
    5. Après l’étape finale de déprotection N-terminale, transférer la résine dans une seringue jetable frittée. Laver la résine avec DMF (3 x 5 mL) et le dichlorométhane (DCM, 3 x 5 mL).
      Remarque : La résine peut-être être conservée après lavage dans un dessiccateur à vide de DCM. Si la résine a été stockée avant l’accouplement, vérifier que vous pour gonfler la résine dans le DMF avant la réaction de couplage.
    6. Coupler le précurseur dithiolane (1) sur N-terminal du peptide sur la résine en ajoutant 4 équivalents de 1, 5 mL de DMF, 4 équivalents de HBTU et 10 équivalents de N, N-diisopropyléthylamine (DIPEA). Préactiver le mélange de couplage pendant 10 min avant d’ajouter à la résine contenant une seringue frittée.
    7. Secouez la réaction de couplage pendant 2 h. Après 2 h, laver la résine avec DMF (3 x 5 mL) et répéter la réaction de couplage avec agitation du jour au lendemain.
    8. Après le deuxième couplage, laver la résine avec DMF (3 x 5 mL) et de DCM (3 x 5 mL).
      Remarque : La résine peut être stockée à ce point sous vide jusqu’au décolleté.
  3. La déprotection de thioacétate et de clivage du Peptide de résine
    1. Pour déprotéger le groupe thioacétate partir du précurseur de dithiolane aminée, transférer la résine séchée dans un tube de réaction de micro-ondes de 10 mL et ajouter 2 mL de DMF. Laisser l’échangeur gonfler, ajouter un petit magnétique au navire et remettre en suspension avec une faible vitesse de l’agitateur magnétique pendant 15 min.
    2. Ajouter 2 mL de concentré hydroxyde d’ammonium, cap de la cuve de réaction avec les septa silicone et placez la cuve dans un réacteur de micro-ondes en utilisant les paramètres de micro-ondes de 75 ° C pendant 45 min en remuant.
    3. Après que la réaction de micro-ondes est terminée, transférer la résine dans une seringue jetable propre frittée. Laver avec DMF (2 x 5 mL) et de méthanol (MeOH, 2 x 5 mL).
    4. Ajouter une solution concentrée d’hydroxyde d’ammonium dans le méthanol (1:4), pour un volume total de 5 mL. Autorisation d’agiter pendant la nuit pour augmenter l’oxydation intramoléculaire du pont disulfure dans dithiolane ring.
    5. Laver la résine avec MeOH (2 x 5 mL) et de DCM (3 x 5 mL).
      Remarque : La résine séchée peut-être être stockée à ce stade dans un dessiccateur à vide.
    6. Ajouter le cocktail de clivage de la résine contenant la seringue en agitant doucement pendant 1,5 h. Le clivage cocktail utilisé est l’acide trifluoroacétique (TFA) de 95 %, 2,5 % triisopropylsilane (conseils) et 2,5 % d’eau à un volume total de 5 mL.
      ATTENTION : Travailler sous hotte chimique seulement. TFA est volatil et corrosif.
      Remarque : Pour la majorité des séquences de peptides et acides aminés sidechain groupes protecteurs, la solution de cocktail de clivage ci-dessus est suffisante ; Toutefois, des cocktails de clivage alternatif peuvent être nécessaire pour certaine acides aminés de la chaîne de la côté protection de groupes (en particuliers peptides contenant Cys, Met, Trp et Arg) ou autre résine chimie20.
    7. Précipiter le peptide brut dans 25 mL d’éther froid dans un tube conique de 50 mL par addition de goutte à goutte de la seringue frittée. Le peptide précipite sous forme de solide blanc. Granule le peptide par centrifugation à 1300 x g pendant 10 min. décanter soigneusement l’éther dans un récipient séparé pour la collecte des déchets.
    8. Ajouter un autre 25 mL d’éther diéthylique dans le tube conique et remettre en suspension le précipité au vortex. Répétez la centrifugation à 1300 x g pendant 10 min et éliminer l’éther diéthylique à nouveau. Sécher le culot sous vide.
  4. Purification de 1, 2-Dithiolane modifiée Peptide
    Remarque : Purifier le peptide brut par HPLC en phase inverse. Recueillir et combiner les pics de peptide et confirmer la masse par spectrométrie de masse MALDI-TOF.
    1. Dissoudre le culot de peptide brut dans une quantité minimale d’acétonitrile avec 0,1 % TFA. En raison d’hydrophobicité de peptide et la propension de l’agrégation, doucement chauffer l’échantillon à 40 ° C à l’aide de solubilité.
      Remarque : Éviter les plus élevés de températures et de sonication du peptide afin d’éviter les éventuels disulfure échange réactions21,22,23.
    2. Pour préparer 1 mL de peptide brut purification HPLC, ajouter 400 μL de stock de peptide concentré dans l’acétonitrile à 600 μL de H2O avec 0,1 % TFA et filtrer à travers un filtre de seringue 22 μm dans un flacon HPLC. L’isopropanol 5 % supplémentaires peut être ajouté pour empêcher la précipitation et l’agrégation du peptide.
    3. Purifier le peptide en utilisant la colonne semi-préparative C-18 avec un débit de 3 mL/min par rapport à un gradient linéaire de 15-55 % d’acétonitrile dans 20 min. jeu de détecteurs UV à 222 nm (dorsale de l’amide) et 330 nm (pont disulfure). Rassembler et combiner les pics d’intérêt (Figure 2 a).
    4. Confirmer la masse de produit de peptide par spectromètre de masse MALDI-TOF en mode réflectron (Figure 2 b). Pour l’analyse, mélangez 0,5 μL de peak recueillie sur la plaque MALDI avec 0,5 μL de matrice (DHB) l’acide 2, 5-dihydroxybenzoïque (10 mg/mL DHB dans 50 % d’acétonitrile, 0,1 % TFA).
      Remarque : Communs adduits de MALDI-TOF spectrométrie de masse incluent le sodium et sel de potassium d’adduits ([M + Na]+ et [M + K]+) pics. Dessalage de l’échantillon avant l’analyse est recommandé si les sommets de l’adduit sel suppriment le signal du pic principal [M + H]+ . En outre, un pic oxydé de [M + O]+ est également détecté dans le peptide de 1, 2-dithiolane modifiée. Un rapport sur laser induite par oxydation de l’ionisation de MALDI à l’aide de la matrice DHB suggère que les facteurs dont la concentration de l’échantillon, solvant et intensité du laser peuvent être modifiées pour limiter la MALDI induite par oxydation artefact24.
    5. Après confirmation de MALDI-TOF de la masse correcte, lyophiliser le peptide après congélation flash. Conserver la poudre lyophilisée peptide sous vide jusqu'à l’Assemblée.

2. caractérisation des supramoléculaire auto-assemblage Structures

  1. Formation de fibres amyloïdes
    1. Pour préparer l’auto-assemblage solution, peser 1 mg de la poudre de peptide à l’aide d’une balance analytique. Dissoudre dans un mélange (pH 7.5) de 20 % d’acétonitrile et de 10 mM (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acide (HEPES) dans un tube de microtubes de 1,5 mL, à une concentration finale de 1 mg/mL peptide Assemblée du mélange. Vortex solution d’assemblage et laisser monter à température ambiante.
  2. Caractérisation spectroscopique des fibres amyloïdes
    1. Suivez le processus d’assemblage de peptide par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) tous les jours. Un pic large centré autour de 1670 cm-1 est la signature IR dus aux peptides non assemblés dans l' exemple17. Les échantillons de l’Assemblée de peptide prennent généralement une à deux semaines pour le pic large démontée à disparaître et arriver à maturation.
      1. Sécher une partie aliquote de 8-10 μL de la solution de montage comme une fine pellicule sur le cristal de diamant de RTA. Surveiller la disparition d’un pic d’eau grandes et larges de 1640 à 1630 cm-1 que les formes du feuil sec.
      2. Acquisition de spectres IR de 1500-1800 cm-1 avec une moyenne de 50 scanne avec une résolution de-1 cm 2. Acquérir et soustraire les scans de fond avant chaque analyse d’échantillon. La signature IR pour l’assemblage de feuillet β est un pic entre 1625 et 1635 cm-1 (Figure 3 a)25,26.
    2. Caractériser l’ensemble de peptide dans des structures supramoléculaires riches feuillet β par dichroïsme circulaire (CD). Enregistrer les spectres à l’aide d’un spectropolarimètre CD avec un système de contrôle de température Peltier.
      1. Distribuer 30 μL de la solution d’assemblage dans une cuvette de longueur de chemin d’accès de 0,1 mm.
        Remarque : Un porte-cuve est nécessaire pour le fixer et positionner la cellule de longueur de chemin d’accès court dans l’instrument.
      2. Pour chaque gamme, définissez l’instrument CD aux paramètres suivants : analyse des longueurs d’onde de 300 nm à 180 nm, taux d’echantillonage de 100/min, largeur de bande de 1 nm, 25 ° C, en moyenne trois balayages.
      3. Recueillir un éventail de la mémoire tampon (20 % d’acétonitrile/10 mM, HEPES, pH 7,5) et soustraire de chaque analyse de l’échantillon sous forme de contrôle. La signature de CD pour les β-feuilles est qu'une ellipticité minimale centrée autour de 220 nm (Figure 3 b)27.
  3. Microscopie de fibres amyloïdes
    1. Laisser deux à trois semaines pour les échantillons de peptide à mûrir dans des structures supramoléculaires riches feuillet β.
      Remarque : Les assemblys peuvent être photographiées en utilisant la microscopie électronique à transmission (TEM) aux premiers stades de la procédure de l’Assemblée ainsi.
      1. Pipeter 10 μL de la solution d’assemblage de peptide à la surface de la grille de carbone TEM.
        Remarque : prenez soin de ne pas pour toucher le bout de la pipette à la surface de la grille. Haute précision, à fermeture automatique pinces servent à retenir la grille TEM pendant la préparation.
      2. Attendre 1-2 min pour permettre les assemblées s’adsorber sur la surface de la grille. Retirer les excès d’échantillon en touchant le papier filtre au bord de la grille.
      3. Préparer une tache 2 % de l’acétate d’uranyle en ajoutant 100 μL d’eau déionisée à la solution d’acétate d’uranyle 4 % disponibles dans le commerce. Distribuer 10 μL de la tache de l’acétate d’uranyle de 2 % sur la surface de la grille et incuber pendant 2-3 min. Après l’incubation, enlever tache excès en touchant le papier filtre au bord de la grille.
      4. Placer les grilles TEM dans un dessiccateur à vide pendant la nuit. Conserver sous vide jusqu'à l’imagerie.
      5. Les échantillons préparés avec TEM (Figure 3) de l’image. Voici les paramètres typiques pour la microscopie : images à grossissements allant de 9 300 X 23, 000 X, filament de tungstène avec une tension d’accélération de 120 kV.
        Remarque : ImageJ peut être utilisé pour mesurer la largeur de la fibre moyenne des structures supramoléculaires d’acquis TEM images28.
        ATTENTION : Veuillez consulter toutes les fiches de données de sécurité (SDS) avant utilisation. Plusieurs produits chimiques utilisés dans la synthèse, la purification, et la caractérisation des peptides auto-assemblage décrit 1, 2-dithiolane modifiée corrosifs ou toxiques et ne doit être utilisé sous une hotte chimique. Utilisez toujours l’équipement de protection individuelle approprié (y compris les lunettes de sécurité, blouse de laboratoire, pleine longueur pantalon, chaussures fermées) lorsque vous travaillez dans le laboratoire.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En dehors de la synthèse en une étape initiale de la molécule précurseur de dithiolane, le reste de la synthèse de peptide de 1, 2-dithiolane modifiée se produit sur un support solide (Figure 1 a). La conversion de 3-bromo - 2-(bromométhyl) propionique acide 3-(acetylthio) -2-(acetylthiomethyl), acide propanoïque, le précurseur de dithiolane, est confirmée par 1H et de 13C RMN (Figure 1 b et C

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article explique les détails de la synthèse et la purification d’un peptide auto-assemblage de N-terminal 1, 2-dithiolane modifiée et la caractérisation des structures supramoléculaires qui en résulte. La synthèse du peptide 1, 2-dithiolane rapporté ici a des avantages, y compris une synthèse en une étape pour produire le précurseur dithiolane, 3-(acetylthio) -2-acide propanoïque (acetylthiomethyl) et la résine sur micro-ondes réaction de déprotection de la précurseur thioacétate de groupe pour obtenir la fraction ox...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tiennent à remercier Dr B. Ellen Scanley pour sa formation technique et aider grâce à la TEM au Connecticut State Colleges and University (CSCU) Center for Nanotechnology et Dr Ishita Mukerji à la Wesleyan University pour son CD spectrophotomètre. Le travail a été en partie pris en charge par l’Institut des sciences à l’Université de Fairfield, la NASA Connecticut Space Grant Consortium et par la National Science Foundation sous Grant nombre CHE-1624774.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Rink amide Résine MBHA, charge élevéeGyros Protein TechnologiesRAM-5-HLÉviter le contact avec la peau et les yeux ; ne pas inhaler
N,N-DiméthylformamideFisher ScientificD119-4Liquide et vapeur inflammables ; irritant pour les yeux et la peau ; Utiliser de l’équipement de protection individuelle ; tenir à l’écart des flammes nues
Fmoc-L-Val-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-VPorter un équipement de protection individuelle ; ne pas inhaler
Fmoc-L-Leu-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-LPorter un équipement de protection individuelle ; ne pas inhaler
Fmoc-L-Lys(Boc)-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-KBCPorter un équipement de protection individuelle ; ne pas inhaler
Fmoc-L-Phe-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-FPorter un équipement de protection individuelle ; ne pas inhaler
Fmoc-L-Ala-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-APorter un équipement de protection individuelle ; ne pas inhaler
Fmoc-L-Gln(Trt)-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-QTPorter un équipement de protection individuelle ; ne pas inhaler
N,N,N&prime ;,N&prime ;-Tétraméthyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)hexafluorophosphate d’uroniumGyros Protein Technologies26432Provoque une irritation de la peau, des yeux et des voies respiratoires ; ne pas inhaler ; utiliser sous la cagoule ou dans un endroit bien ventilé
0,4 M N-méthylmorpholine dansDMF Gyros Protein TechnologiesPS3-MM-Lhautement inflammable ; porter un équipement de protection individuelle ; tenir à l’abri de la chaleur et garder le récipient bien fermé ; ne pas inhaler ni avaler ; laver soigneusement la peau après avoir manipulé
de la pipéridine à 20 % dans DMFGyros Protein TechnologiesPS3-PPR-LProvoque de graves brûlures des yeux et de la peau ; Liquide et vapeur inflammables ; Ne pas inhaler le
dichlorométhaneFisher ScientificD37-4Peut causer le cancer ; Ne pas inhaler ; Porter un équipement de protection individuelle ; à utiliser uniquement sous le capot ; en cas de contact, augmenter avec de l’eau pendant au moins 15 minutes et obtenir des soins médicaux
acétonitrileFisher ScientificA998-4Inflammable ; irritant pour les yeux ; Utiliser de l’équipement de protection individuelle ; Utiliser uniquement sous une hotte ; tenir à l’écart des flammes nues ou des surfaces chaudes ; en cas de contact, rincer à l’eau pendant au moins 15 minutes et obtenir des soins médicaux
trifluoroacétiqueFisher ScientificA116-50Provoque de graves brûlures ; ne pas inhaler ; nocif pour la vie aquatique ; utiliser un équipement de protection individuelle ; utiliser uniquement sous une hotte ; en cas de contact, rincer à l’eau pendant au moins 15 minutes et obain soins médicaux immédiats
acétate d’uranyle à 4Microscopie électronique Sciences22400-4Ne pas inhaler ; nocif pour la vie aquatique
Acide 4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-éthanesulfoniqueAcros OrganicsAC172571000Ne pas inhaler ; utiliser à l’extérieur ou dans un endroit bien ventilé
azote GazTechAirLe contenu sous pression, peut exploser s’il est chauffé
Acide 3-bromo-2-(bromométhyl)propioniqueAlfa AesarAAA1963014Ne pas inhaler ; provoque une irritation de la peau et des yeux ; corrosif
hydroxyde de sodiumFisher ScientificS318-100Utiliser un équipement de protection individuelle ; utiliser uniquement sous une hotte ; en cas de contact, rincer la zone pendant au moins 15 minutes et obtenir des soins médicaux
thioacétatede potassium Acros OrganicsAC221300250Provoque une irritation de la peau et des yeux ; ne pas inhaler ; utiliser un équipement de protection individuelle
acide sulfuriqueFisher ScientificSA213Provoque des brûlures ; tenir à l’écart de l’eau ; tenir à l’écart des matériaux combustibles ; ne pas inhaler ; utiliser de l’équipement de protection individuelle ; en cas de contact, rincer la zone pendant au moins 15 minutes et obtenir des soins médicaux
chloroform-dAcros OrganicsAC320690075Risque possible de cancer ; irritant pour la peau et les yeux ; ne pas inhaler ; Utiliser de l’équipement de protection individuelle ; Utiliser uniquement sous la hotte ; En cas de contact, rincer la zone pendant au moins 15 minutes et obtenir des soins médicaux
chloroformeFisher ScientificC298-4Risque possible de cancer ; irritant pour la peau et les yeux ; ne pas inhaler ; Utiliser de l’équipement de protection individuelle ; Utiliser uniquement sous la hotte ; En cas de contact, rincer la zone pendant au moins 15 minutes et obtenir des soins médicaux
N,N-diisopropyléthylamineAcros OrganicsAC367841000Hautement inflammable ; nocif pour la vie aquatique ; porter un équipement de protection individuelle ; ne pas avaler
d’hydroxyde d’ammoniumFisher ScientificA669S-500Corrosif ; ne pas inhaler
méthanolFisher ScientificA452-4Liquide et vapeur inflammables ; utiliser de l’équipement de protection individuelle ; ne pas inhaler ; En cas de contact, rincer la zone pendant au moins 15 minutes et obtenir des soins médicaux
triisopropylsilaneSigma Aldrich233781Inflammable ; utiliser un équipement de protection personnel ; garder le récipient bien fermé
ScientificE138-1Extrêmement inflammable ; Irritant pour la peau et les yeux ; Utiliser un équipement de protection individuelle
Acide 2,5-dihydroxybenzoïqueSigma Aldrich39319-10x10MG-Fne pas inhaler ; irritant pour la peau et les yeux
Acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamiqueAlfa AesarAAJ67635EXK
c18 Zip-tipMilliporeZTC18S096
tris(2-carboxyéthyl) chlorhydrate de phospineThermo ScientificPI20490
gel de silice 60 F254 feuilles TLC revêtues d’aluminiumEMD Millipore1.05549.0001
Tubes RMN de précision à paroi minceBel-Art6630005855mm OD
Seringues Norm-Ject entièrement en plastiqueAir TiteAL10
BD PrecisionGlideBD 305185aiguilles usagées sont jetées dans un conteneur à déchets tranchants
Seringue frittée jetable Seringue frittéeTorviqSF1000LL10 ml ont été utilisées dans le rapport, mais des seringues plus grandes sont disponibles si nécessaire pour une synthèse à plus grande échelle.
grille de carboneTed Pella, Inc.CF200-CUAssurez-vous de préparer les échantillons et la coloration du côté de la grille de carbone, et non du côté cuivre brillant de la pince
épiler à fermeture automatiqueMicroscopie électronique Sciences78318-3Xpointes très pointues, longueur : 120 mm
0,1 mm Cellule de longueur de trajet courtStarna Cells, Inc.20/C-Q-0.1
Fragile 10mL Vessel CapsCEM909210
10mL Pressure VesselsCEM908035
Aeris Semi-Prep HPLCcolumn Phenomenex00F-4632-N0150 x 10mm
support de cellulesStarna Cells, Inc.CH-2049Nécessaire lors de l’utilisation de cellules à court trajet
Synthétiseur de peptides PS3Gyros Protein Technologies
DiscoverSP Réacteur à micro-ondesCentrifugeuse CEM
HERMLEZ 206 Autilisé un rotor fixe de 6x50 mL
HPLCDétecteur UV ShimadzuSpectromètre à
résonance magnétique nucléaireAvance, BrukerSpectromètre
de masse MALDI-TOFAxima Confidence,
technologie MillrockBT85A
spectromètre infrarouge à transformée de Fourier,tenseur Alpha, Bruker
microscope électronique à transmission, Tecnai Spirit, FEIutilisé avec la caméra numérique CCD à fibre optique Gatan Orius. Accessible au CSCU Center for Nanotechnology
Circular Dichroism SpectropolarimeterJ-810, JASCOUtilisé avec un contrôleur de température Peltier à six cellules. Consulté à l’Université Wesleyan.
le acide % de, Fisher Aiguille à usage unique à de la grille 300 MHz lyophilisateur Shimadzu,, ,,,

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, J., Liu, K., Xing, R., Yan, X. Peptide self-assembly: Thermodynamics and kinetics. Chemical Society Reviews. 45, 5589-5604 (2016).
  2. Dong, R., et al. Functional supramolecular polymers for biomedical applications. Advanced Materials. 27, 498-526 (2015).
  3. Edwards-Gayle, C. J. C., Hamley, I. W. Self-assembly of bioactive peptides, peptide conjugates, and peptide mimetic materials. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 5867-5876 (2017).
  4. Goor, O. J. G. M., Hendrikse, S. I. S., Dankers, P. Y. W., Meijer, E. W. From supramolecular polymers to multi-component biomaterials. Chemical Society Reviews. 46, 6621-6637 (2017).
  5. DiMaio, J. T. M., Doran, T. M., Ryan, D. M., Raymond, D. M., Nilsson, B. L. Modulating supramolecular peptide hydrogel viscoelasticity using biomolecular recognition. Biomacromolecules. 18, 3591-3599 (2017).
  6. DiMaio, J. T. M., Raymond, D. M., Nilsson, B. L. Display of functional proteins on supramolecular peptide nanofibrils using a split-protein strategy. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 5279-5283 (2017).
  7. Mahmoud, Z. N., Gunnoo, S. B., Thomson, A. R., Fletcher, J. M., Woolfson, D. N. Bioorthogonal dual functionalization of self-assembling peptide fibers. Biomaterials. 32, 3712-3720 (2011).
  8. Petkau-Milroy, K., Uhlenheuer, D. A., Spiering, A. J. H., Vekemans, J. A. J. M., Brunsveld, L. Dynamic and bio-orthogonal protein assembly along a supramolecular polymer. Chemical Science. 4, 2886-2891 (2013).
  9. Li, A., et al. Neurofibrillar tangle surrogates: Histone H1 binding to patterned phosphotyrosine peptide nanotubes. Biochemistry. 53, 4225-4227 (2014).
  10. Sadownik, A., Stefely, J., Regen, S. L. Polymerized liposomes formed under extremely mild conditions. Journal of the American Chemical Society. 108, 7789-7791 (1986).
  11. Zhang, N., et al. ATN-161 Peptide functionalized reversibly cross-linked polymersomes mediate targeted doxorubicin delivery into melanoma-bearing C57BL/6 mice. Molecular Pharmaceutics. 14, 2538-2547 (2017).
  12. Margulis, K., et al. Formation of polymeric nanocubes by self-assembly and crystallization of dithiolane-containing triblock copolymers. Angewandte Chemie International Edition. 56, 16357-16362 (2017).
  13. Zhang, X., Waymouth, R. 1,2-Dithiolane-Derived Dynamic, Covalent Materials: Cooperative Self-Assembly and Reversible Cross-Linking. Journal of the American Chemical Society. 139, 3822-3833 (2017).
  14. Sakia, N., Matile, S. Stack exchange strategies for the synthesis of covalent double-channel photosystems by self-organizing surface-initiated polymerization. Journal of the American Chemical Society. 133, 18542-18545 (2011).
  15. Uji, H., Morita, T., Kimura, S. Molecular direction dependence of single-molecule conductance of a helical peptide in molecular junction. Physical Chemistry Chemical Physics. 15, 757-760 (2013).
  16. Liang, C., Ni, R., Smith, J. E., Childers, W. S., Mehta, A. K., Lynn, D. G. Kinetic intermediates in amyloid assembly. Journal of the American Chemical Society. 136, 15116-15149 (2014).
  17. Smith, J. E., et al. Defining the dynamic conformational network of cross-β peptide assembly. Israel Journal of Chemistry. 55, 763-769 (2015).
  18. Black, S. P., Sanders, J. K. M., Stefankiewicz, A. R. Disulfide exchange: Exposing supramolecular reactivity through dynamic covalent chemistry. Chemical Society Reviews. 43, 1861-1872 (2014).
  19. Vendetti, A., et al. Dihydroasparagusic acid: Antioxidant and tyrosinase inhibitory activities and improved synthesis. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 6848-6855 (2013).
  20. Stawikowski, M., Fields, G. B. Introduction to peptide synthesis. Current Protocols in Protein Science. 26, (2002).
  21. Canadell, J., Goossens, H., Klumperman, B. Self-healing materials based on disulfide links. Macromolecules. 44, 2536-2541 (2011).
  22. Lafont, U., van Zeijl, H., van der Zwaag, S. Influence of cross-linkers on the cohesive and adhesive self-healing ability of polydisulfide-based thermosets. ACS Applied Materials and Interfaces. 4, 6280-6288 (2012).
  23. Komaromy, D., Stuart, M. C. A., Santiago, G. M., Tezcan, M., Krasnikov, V. V., Otto, S. Self-assembly can direct dynamic covalent bond formation toward diversity or specificity. Journal of the American Chemical Society. 139, 6234-6241 (2017).
  24. McAvery, K. M., Guan, B., Fortier, C. A., Tarr, M. A., Cole, R. B. Laser-induced oxidation of cholesterol observed during MALDI-TOF mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 659-669 (2011).
  25. Krimm, S., Bandekar, J. Vibrational spectroscopy and conformation of peptides, polypeptides, and proteins. Advances in Protein Chemistry. 38, 181-364 (1986).
  26. Halverson, K. J., Sucholeiki, I., Ashburn, T. T., Lansbury, P. T. Location of β-sheet-forming sequences in amyloid proteins by FTIR. Journal of the American Chemical Society. 113, 6701-6703 (1991).
  27. Greenfield, N., Fasman, G. D. Computed circular dichroism spectra for the evaluation of protein confirmation. Biochemistry. 8, 4108-4116 (1969).
  28. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij (2016).
  29. Roy, S., Shinde, S., Hamilton, G. A., Hartnett, H. E., Jones, A. K. Artificial [FeFe]-hydrogenase: On resin modification of an amino acid to anchor a hexacarbonyldiiron cluster in a peptide framework. European Journal of Inorganic Chemistry. 2011, 1050-1055 (2011).
  30. Van Duinen, S. G., Castano, E. M., Prelli, F., Bots, G. T. A. B., Luyendijk, W., Frangione, B. Hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis in patients of Dutch origin is related to Alzheimer disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 5991-5994 (1987).
  31. Barth, A. The infrared absorption of amino acid sidechains. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 74, 141-173 (2000).
  32. Jayaraman, M., et al. Slow amyloid nucleation via α-helix-rich oligomeric intermediates in short polyglutamine-containing Huntingtin fragments. Journal of Molecular Biology. 415, 881-899 (2012).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Peptide 12 dithiolanesynth se sur support solided protection par micro ondespurification par HPLCanalyse MALDI TOFspectroscopie FT IRdichro sme circulairemicroscopie lectronique transmissionfibres amylo des

Articles connexes