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Article de méthode

Formation de luminophore dans différentes Conformations de l’albumine sérique Bovine en se liant d’or

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DOI :

10.3791/58141

⸱

31 août 2018

 , 
1Department of Physics and Optical Science, Center for Biomedical Engineering & Science, University of North Carolina

Dans cet article

Résumé

Les protocoles pour l’étude de la liaison des cations or (Au(III)) à différentes conformations de l’albumine sérique bovine (BSA) ainsi que pour caractériser la fluorescence dépendante conformationnelle de la BSA-Au unique sont présentées.

Résumé

Les protocoles présentés vise à étudier le processus de liaison d’au (III) à BSA, rendement de fluorescence rouge induite par le changement de conformation (λem = 640 nm) des BSA-Au(III) complexes. La méthode permet d’ajuster le pH pour montrer que l’émergence de la fluorescence rouge est en corrélation avec les transitions d’équilibre induite par le pH des conformations BSA. Rouge fluorescent BSA-Au(III) complexes peuvent seulement être formés avec un ajustement du pH égale ou supérieure à 9,7, qui correspond à la conformation « A-form » de BSA. Le protocole d’ajuster la BSA au rapport molaire Au et de suivre l’évolution temporelle du processus de liaison d’au (III) est décrit. Le nombre minimal d’au (III) par BSA, à produire la fluorescence rouge, est inférieur à sept. Les auteurs décrivent le protocole en étapes pour illustrer la présence de plusieurs sites de fixation d’au (III) dans le BSA. Tout d’abord, par l’ajout de cuivre (Cu(II)) ou nickel (Ni(II)) cations suivies d’au (III), cette méthode révèle un site de liaison au (III) qui n’est pas le fluorophore rouge. Deuxièmement, en modifiant les BSA de thiol des agents de recouvrement, un autre site de liaison au (III) formant des nonfluorophore se révèle. En troisième lieu, les lieux possibles de liaison au (III) modifier la conformation de BSA par clivage et bouchage des liaisons disulfide, sont illustrées. Le protocole décrit, pour contrôler les conformations de la BSA et la liaison d’au (III), peut être généralement appliqué pour étudier les interactions entre d’autres protéines et les cations métalliques.

Introduction

Un BSA-Au composé présentant un rayonnement ultraviolet (UV)-excitable fluorescence rouge, avec remarquables déplacement de stokes, a été initialement synthétisé par Xie et al. 1. la fluorescence rouge unique et stable peut trouver diverses applications dans des domaines tels que la détection de2,3,4,5,6,7d’imagerie ou nanomédecine8 ,9,10,11,12,13. Ce composé a été étudié abondamment par de nombreux chercheurs dans le domaine des nano-sciences dans ces dernières années14,15,16. Le composé de BSA-UA a été interprété comme UA25 nanoclusters. L’objectif de la méthode présentée est d’examiner ce composé en détail et de comprendre l’origine de la fluorescence rouge. En suivant l’approche présentée, la présence de multiples sites de liaison Au et l’origine de la fluorescence, alternative à la nucléation de site unique d’UA25 nanoclusters, peuvent être illustrées. La même approche peut être utilisée pour étudier comment les autres protéines17,18,19 complexé au (III) peut changer leurs propriétés fluorescentes.

La synthèse du composé fluorescent rouge BSA-Au requiert un contrôle étroit des rapports molaires de BSA à UA (BSA:Au) afin de maximiser l’intensité de la fluorescence et la localisation des pics dans l’excitation-émission carte (EEM)20. Il peut être démontré que plusieurs sites de fixation existent pour au (III) lier, y compris le fragment de l’Asparagine (ou fragment de l’Asp, les quatre premiers résidus d’acides aminés à l’extrémité N-terminale de BSA)21,22. L’acide aminé le 34ème de BSA (Cys-34) montre aussi de coordonner au (III) et d’être impliquée dans le mécanisme de la fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III)) rouge20. Dès coupant tous les ponts disulfures Cys-Cys et couvrant tous les fluorescence de thiols, rouge n’est pas produite ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). Cela indique la nécessité de liaisons disulfide Cys-Cys comme le site de liaison au (III) pour produire la fluorescence rouge.

Techniques de chimie des protéines n’ont pas été couramment pour étudier les complexes BSA-Au(III) dans la communauté des nano-sciences. Toutefois, il serait utile d’employer ces techniques pour comprendre certains aspects de ces complexes, aussi bien quant à détaillée comprendre les sites de fixation d’au (III) dans la BSA. Cet article est destiné à montrer certaines de ces techniques.

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Protocole

1. synthèse du complexe BSA-Au(III)

  1. Dissoudre 25 mg de BSA dans 1 mL d’eau de qualité de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) dans un flacon de 5 mL réaction.
    Remarque : La solution doit apparaître clairement.
  2. Dissoudre or (III) chlorure trihydraté (acide chloraurique) à une concentration de 5 mM dans l’eau de qualité HPLC.
    Remarque : La solution doit apparaître jaune. Solution d’acide chloraurique préparée à cette concentration entraînera une BSA ratio Au 01:13.
    1. Vous pouvez également préparer une solution d’acide chloraurique avec une concentration de n’importe où entre 0,38 mM (BSA:Au = 1:1) à 20 mM (BSA:Au = 01:50) en HPLC grade l’eau.
      NOTE : Différentes proportions de BSA à l’or seront traduira dans les profils de fluorescence rouge radicalement différente de la carte d’excitation-émission.
  3. Placez la cuvette de la réaction de BSA dans un bain-marie à 37 ° C et mélanger vigoureusement à 750 tr/min avec un agitateur magnétique.
  4. Immédiatement après le début de l’agitation, ajouter 1 mL d’acide chloraurique à la solution. La couleur de la solution devrait transformer de clair à jaune.
  5. Agiter le mélange pendant 2 min à 37 ° C et à 750 tr/min avec un agitateur magnétique.
  6. Dans le flacon de réaction, ajouter 100 μL de 1 NaOH M à la solution pour amener le pH à 12.
    NOTE : Immédiatement après l’ajout de NaOH, la solution devrait assombrir un peu au jaune-marron et ensuite retourner en arrière au jaune.
  7. Continuez à remuer à 750 tr/min pendant 2 h et 37 ° C. La solution devrait lentement passent du jaune au jaune/brun foncé. Ce changement de couleur indique la formation de la BSA-Au(III) de fluorescence rouge complexe.
  8. Laisser reposer à température ambiante pendant 2 jours, l’échantillon et la solution continuera à s’assombrir à un brun ambré et augmentera l’intensité de la fluorescence.
    1. Vous pouvez également laisser l’échantillon continuez à remuer à 37 ° C pendant 12 h de plus que la couleur de la solution évolue à un brun ambré.

2. synthèse des BSA-Cu(II)-Au(III)

  1. Dissoudre 25 mg de BSA dans 1 mL d’eau de qualité HPLC. La solution doit apparaître clairement.
  2. Dissoudre le cuivre (II) dihydrate de chlorure dans l’eau de qualité HPLC à une concentration de 5 mM. La solution doit apparaître la lumière bleue.
  3. Ajouter 1 mL de la solution aqueuse de BSA dans un flacon de réaction de 5 mL et placer dans un bain-marie à 37 ° C. Incorporer le mélange à 750 tr/min.
  4. Immédiatement ajouter 0,5 mL de la solution de dihydraté chlorure de cuivre (II) dans le flacon de réaction et mélanger pendant 2 min. La solution restera la lumière bleue.
  5. Ajouter 75 μL de 1 NaOH M pour amener le pH à 12 et de permettre de mélanger pendant 2 h. La solution va devenir pourpre.
  6. Dissoudre l’acide chloraurique dans l’eau de qualité HPLC à une concentration de 5 mM.
  7. Ajouter 0,5 mL d’acide chloraurique aqueux dans le flacon de réaction et ajuster le pH à 12 à l’aide de 1 NaOH M.
  8. Remuer le mélange réactionnel pendant 2 h.
    NOTE : La solution doit évoluer vers une couleur brune.

3. synthèse des BSA-Ni(II)-Au(III)

  1. Dissoudre 25 mg de BSA dans 1 mL d’eau de qualité HPLC. La solution doit apparaître clairement.
  2. Dissoudre l’hexahydrate de chlorure de nickel (II) dans l’eau de qualité HPLC à une concentration de 5 mM. La solution doit apparaître la lumière verte.
  3. Ajouter 1 mL de la solution aqueuse de BSA dans un flacon de réaction de 5 mL et placer dans un bain-marie à 37 oC. remuer le mélange à 750 tr/min.
  4. Immédiatement ajouter 0,5 mL de la solution d’hexahydrate de chlorure de nickel (II) au flacon de réaction et mélanger pendant 2 min.
    Remarque : La solution reste lumière verte.
  5. Ajouter 75 μL de 1 NaOH M pour amener le pH à 12 et de permettre de mélanger pendant 2 h.
    Remarque : La solution deviendra jaune foncé.
  6. Dissoudre l’acide chloraurique dans l’eau de qualité HPLC à une concentration de 5 mM.
  7. Ajouter 0,5 mL de l’acide chloraurique aqueux dans le flacon de réaction et ajuster le pH à 12.
  8. Remuer le mélange réactionnel pendant 2 h.
    NOTE : La solution doit évoluer vers une couleur brune.

4. synthèse du [Cys34-capped-BSA]-Au(III)

  1. Dissoudre 2 mg de N-éthylmaléimide (NEM) dans 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4).
  2. Dissoudre 2 mg de BSA dans 1 mL de solution de PBS-NEM.
  3. Transvaser la solution dans un flacon de 5 mL réaction et remuez à 20 ° C à 500 tr/min pendant 1 h.
  4. Dialyser la solution à l’aide de 12 tubes de dialyse kDa dans 500 mL de PBS, en remuant à 50 tr/min avec un agitateur magnétique pendant la nuit pour enlever le NEM n’ayant pas réagi.
  5. Dissoudre l’acide chloraurique dans du PBS à une concentration de 0,4 mM.
    Remarque : La solution sera un jaune pâle.
  6. Transférer le flacon de réaction dans un bain-marie à 37 ° C. Remuer à 750 tr/min.
  7. Ajouter 1 mL de solution d’acide chloraurique dans le flacon de réaction immédiatement et permettent de mélanger pendant 2 min.
  8. Ajouter 75 μL de 1 NaOH M dans le flacon de réaction pour amener le pH à 12 et laissez pour mélanger pendant 2 h.

5. synthèse du [all-thiol-capped-BSA]-Au(III)

  1. Préparer une solution de 2 M urée et 50 mM bicarbonate d’ammonium (NH4HCO3, pH 8,0) dans l’eau de qualité HPLC.
  2. Dissoudre 3,3 mg de BSA dans 1 mL de la solution et le transfert à un flacon de 5 mL réaction ci-dessus.
  3. Préparer une solution stock de 0,25 M tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) en dissolvant 62,5 mg de TCEP dans 1 mL d’eau de l’HPLC.
  4. Verser la solution mère de TCEP dans la cuvette de réaction jusqu'à ce que la concentration finale de PTCE est 8 mM.
  5. Incuber la solution dans un bain-marie pendant 1 h à 50 ° C. Remuer à 500 tr/min avec un agitateur magnétique.
  6. Laisser la solution refroidir complètement à température ambiante.
  7. Préparer une solution de 100 mM NEM en dissolvant 12,5 mg de NEM dans 1 mL d’eau de qualité HPLC.
  8. Verser la solution mère de NEM dans la cuvette de réaction jusqu'à ce que la concentration finale de NEM est 16 mM.
  9. Laissez agir la solution combiner pendant 2 h à 20 ° C. Remuer à 500 tr/min.
  10. Dialyser la solution à l’aide d’un tube de dialyse de 12 kDa, agitant la solution à 50 tr/min avec un agitateur magnétique du jour au lendemain dans 500 mL de 50 mM NH4HCO3 pour éliminer les excès TCEP, NEM et urée.
  11. Déplacer le flacon de réaction à un bain d’eau à 37 ° C et mélanger à 750 tr/min.
  12. Dissoudre l’acide chloraurique dans l’eau de qualité HPLC à une concentration de 0,66 mM.
  13. Ajouter 1 mL de solution d’acide chloraurique dans le flacon de réaction immédiatement et permettent de mélanger pendant 2 min.
  14. Ajouter 1 NaOH M jusqu'à ce que le pH de la solution est de 12 et laisser la solution de continuer à mélanger pendant 2 h.

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Résultats

De la fluorescence du complexe BSA-Au(III), il a été observé que la conversion de la fluorescence bleue intrinsèque du BSA (λem = 400 nm) à fluorescence rouge (λem = 640 nm) se produit à pH 9,7 grâce à un équilibre d’environ transition (Figure 1). ESEE de BSA-Au(III) à différent BSA à rapports molaires Au est illustré à la Figure 2, et ces données montrent comment modifier les rapports mola...

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Discussion

Les composés de BSA-Au(III) préparés à pH 12 présentent une fluorescence rouge à une longueur d’onde d’émission de λem= 640 nm lorsqu’il est excité avec rayonnement ultraviolet (UV) légère λex= 365 nm (Figure 1 a). L’émergence de la fluorescence rouge est un processus lent et prendra quelques jours à température ambiante pour passer à une intensité maximale. À 37 ° C en cours d’exécution de la réaction produira les résultats optimales, même si une température p...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

S.E. reconnaît l’appui du Fonds d’Initiative spéciale Duke Endowment, Wells Fargo fonds, Fondation de PhRMA, ainsi que des fonds de démarrage de l’University of North Carolina, Charlotte.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Albumine sérique bovine (BSA), 96 %Sigma-AldrichA5611
, 99,9 %Sigma-Aldrich
, 99,999 %
Sigma-Aldrich65450799,9
% N-éthylmaléimide (NEM) >99,0 %Sigma-Aldrich4259
Chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP), >98,0 %Sigma-AldrichC4706
Hydroxyde de sodium, >98,0 %Sigma-AldrichS8045
urée, 99,5 %Chem-Implex Int’l30142
Solution saline tamponnée au phospate (PBS)CorningMT21040CV
Bicarbonate d’ammonium, 99,5 %Sigma-Aldrich9830
chlorure d’or (III) trihydraté chlorure de cuivre (II) dihydraté 520918 chlorure de nickel (II) hexahydraté 459097

Références

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