Article de méthode

Cellulaire et acellulaire poumon modèle pour étudier les métastases tumorales

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DOI :

10.3791/58145

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19 août 2018

 , 
1Department of Surgery, Houston Methodist Hospital Research Institute, 2Division of Thoracic Surgery, Department of Surgery, Weill Cornell Medical College, Houston Methodist Hospital

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour un ex vivo du poumon Cancer du modèle qui imite les étapes de la progression tumorale et contribue à isoler une tumeur primaire, diffuser les cellules tumorales et les lésions métastatiques.

Résumé

Il est difficile d’isoler des cellules tumorales à différents moments de la progression tumorale. Nous avons créé un modèle ex vivo du poumon qui peut montrer l’interaction des cellules tumorales avec une matrice naturelle et un flux continuel d’éléments nutritifs, ainsi qu’un modèle qui montre l’interaction des cellules tumorales avec les composants cellulaires normales et naturelles de la matrice. Le modèle de poumon acellulaire ex vivo est créé en isolant un bloc coeur-poumon de rat et enlever toutes les cellules en utilisant le procédé de DÉCELLULARISATION. La bronche principale droite est liée au large et les cellules tumorales sont placés dans la trachée par une seringue. Les cellules se déplacent et remplir le poumon gauche. Le poumon est ensuite placé dans un bioréacteur où l’artère pulmonaire reçoit un flux continu de médias dans un circuit fermé. La tumeur sur le poumon gauche est la tumeur primitive. Les cellules tumorales qui sont isolées dans les médias circulants sont en circulation les cellules tumorales et les cellules tumorales dans le poumon droit sont des lésions métastatiques. Le modèle de poumon cellulaires ex vivo est créé en sautant le processus DÉCELLULARISATION. Chaque modèle peut être utilisé pour répondre aux questions de recherche différents.

Introduction

Métastases du cancer est le coupable derrière la plupart des décès liés au cancer et pose le défi ultime dans l’effort pour combattre le cancer. L’objectif général de cette méthode est de concevoir un protocole pour une culture de quatre dimensions (4D) cellulaire qui a une dimension de flux, en plus de la croissance tridimensionnelle (3d) cellulaire. Il représente les trois phases du processus de métastase [c'est-à-dire, la tumeur primitive, tumeur cellules circulantes (CTC) et lésions métastatiques].

Durant les trois dernières décennies, les scientifiques du monde entier a donné une richesse inégalée d’informations pour comprendre les mécanismes qui sous-tendent la progression métastatique dans différents cancers qui ont amélioré la perspective d’une guérison ou de survie sans progression. La prise en charge clinique de certains cancers, comme le cancer, sensiblement améliorée1; Cependant, certains cancers, tels que le cancer du poumon, ont toujours un faible taux de survie à2. Modèles animaux in vitro et in vivo ont grandement contribués à générer de nouvelles connaissances sur les mécanismes qui sous-tendent le développement de la maladie. Dans ces dernières années, dérivé de xénogreffes (CDX) de cellules et xénogreffes dérivés de patient (PDX) ont été plus intéressants car ils conservent de nombreuses fonctionnalités pertinentes de tumeur humaine primaire3, telles que la cinétique de croissance, les caractéristiques histologiques, comportementales caractéristiques et la réponse au traitement. Toutefois, chaque modèle a ses limites pour comprendre le mécanisme de formation de la CCT et métastase d’un organes éloignés4,5,6.

Récemment, nous avons développé un modèle 4D ex vivo pulmonaire du cancer en utilisant le concept de réingénierie d’orgue et culture cellulaire basé sur la perfusion. Elle imite la croissance du cancer du poumon chez l’humain en formant des nodules pleins : tumeurs qui se développent au fil du temps avec un homme similaire du cancer-sécrétée protéine production7. Il représente la signature d’expression de gène qui prédit faible taux de survie chez les patients atteints de cancer et montre également une réponse thérapeutique par une régression tumorale sur cisplatine traitement8,9. Le modèle du poumon a été modifié afin qu’il peut former des lésions métastatiques. La CTC se développent à partir d’une tumeur primaire et intravasate dans le système vasculaire et extravasate dans le poumon controlatéral pour former des lésions métastatiques10. Études d’expression de gène suggèrent un profil d’expression distincte de la tumeur primitive, la CTC et les lésions métastatiques et la stimulation de l’expression du sous-ensemble de gènes nécessaires pour le phénotype10. Ce processus métastatique se produit en raison de la présence de conditions biologiques observées chez les patients atteints de cancer. L’avantage de ce modèle est la présence d’une matrice naturelle et l’architecture et une perfusion de nutriments qui conduit à la formation de nodules de la tumeur. En outre, il fournit également l’occasion d’étudier les effets des différentes composantes du microenvironnement tumoral ou de la drogue sur la progression tumorale dans le temps. Ce modèle peut être utilisé pour développer une gamme de cellules cancéreuses (cancer du poumon, cancer du sein, sarcome etc.) dans une mise en place de laboratoire.

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Protocole

Les protocoles pour l’expérimentation animale ont été approuvés par le Comité de l’urbanisme à l’Institut de recherche de méthodiste de Houston et d’institutionnels animalier et effectuées conformément à tous les règlements, lois, directives et politiques.

1. récolte de poumon de rat

  1. Anesthésier un rat Sprague-Dawley mâle de 4 à 6-semaines par injection intrapéritonéale (IP) de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) dans son flanc. S’assurer que l’anesthésie en vérifiant l’absence de mouvement quand l’orteil du membre postérieur est pincé avec une pince.
  2. Après 10 min, raser la poitrine et l’abdomen et essuyer la peau avec un tampon de la chlorhexidine.
  3. Enlever la peau par ramasser avec une pince et il inciser avec un scalpel jetable. Après avoir ouvert la cavité thoracique par incision avec bistouri, réaliser une thoracotomie bilatérale en coupant la partie antérieure de la cage thoracique, à gauche et à droite du diaphragme avec des ciseaux.
    Remarque : Il s’agit d’une chirurgie sans survie.
  4. Tenez la cage thoracique vers le haut et injecter 2 mL d’héparine (1 000 unités/mL) dans le ventricule droit du cœur battant à l’aide d’une aiguille de 27 G.
    Remarque : Cela empêchera toute formation de caillots sanguins dans les poumons.
  5. Complètement enlever la cage thoracique avec des ciseaux et une aiguille 18 G dans le ventricule gauche comme un évent, jusqu'à ce que le sang sort. Ensuite, injecter 15 mL de solution saline tamponnée au phosphate héparinée (12,5 unités/mL ; PBS hépariné) dans le ventricule droit à l’aide d’une aiguille 25 G.
  6. Couper la veine inférieure et supérieure, cave deux grosses veines sur le côté droit du cœur, puis rincez les poumons avec une autre 10 mL de PBS hépariné dans le ventricule droit à l’aide d’une aiguille de 27 G.
    Remarque : La veine cave inférieure est visualisée sous le fond du cœur comme un grand navire rempli de sang rouge. De même, la veine cave supérieure est visualisée dans la partie supérieure du cœur comme un gros navire.
  7. Couper la trachée à la base de la thyroïde. Retirer délicatement l’aorte au niveau de la veine hémiazygos et les branches de l’aorte à l’arche.
  8. Retirez le bloc coeur-poumons de la cavité thoracique et le reste de l’organisme du rat.
  9. Exécuter ventriculotomy en coupant la moitié des ventricules droit et gauche et placer une canule de l’aiguille en acier inoxydable 18 G préremplie sur mesure à travers le ventricule droit dans l’artère pulmonaire (PA).
  10. Fixer la canule avec une cravate de soie de 2-0 et exposer avec soin le ventricule droit et l’atrium.
  11. Placer une cloison Luer femelle dans le ventricule gauche et le fixer avec une cravate de soie de 2-0.
  12. Rincer le bloc coeur-poumons avec 20 mL de PBS hépariné via la canule de PA et le placer dans un tube de 50 mL contenant des milieux de culture ou hépariné PBS.
    Remarque : Pour un modèle cellulaire, passez à l’étape 3.1 à mettre en place le bioréacteur. Pour un modèle acellulaire, passez à l’étape 2.1 pour la DÉCELLULARISATION.

2. poumon DÉCELLULARISATION

  1. Préparation de l’unité de DÉCELLULARISATION
    1. Préparer chaque chambre DÉCELLULARISATION/bouteille en perçant deux trous dans le bouchon de la bouteille et en coupant un raccord Luer femelle dans les trous (Figure 1 a et 1 b). Fixer avec une bague en nylon noir de l’autre côté. De même, percez un petit trou dans un autre bouchon de la bouteille pour attacher ensemble par voie intraveineuse (Figure 1).
      Remarque : La Figure 1 a et 1 b sont des capsules de bouteille même des deux côtés différentes. La figure 1 est un plafond différent avec un seul trou comme indiqué ci-dessus dans l’étape 2.1.1.
    2. Fixez un tube de 0,5 pouce (à l’artère pulmonaire ou à la fin de la PA) et les tubes de 6 pouces (Figure 1J) à un raccord Luer femelle d’à l’intérieur des capsules de bouteilles (Figure 1 a et 1 b) et fixez un raccord Luer-lock mâle aux extrémités. Régler le verrouillage avec une bouteille de 500 mL comme la chambre de DÉCELLULARISATION/bouteille.
    3. Connectez une extrémité de deux tubes de 2 pi (qui sont raccordés avec un raccord Luer-lock mâle) aux deux extrémités du tube pompe (Figure 1 H), qui est attaché à la tête de pompe (Figure 1E et 1F) par une cartouche (Figure 1) avec un raccord Luer femelle serrure (Figure 1I).
    4. Branchez l’autre extrémité des ft 2 tubes (de l’étape 2.1.3) chacun à une tête de verrouillage Luer femelle sur le chapeau de chambre/bouteille DÉCELLULARISATION (Figure 1 L).
    5. Mettre en place une 250 mL héparinée bouteille de PBS (avec 200 mL de PBS) en accrochant une bouteille renversée sur un stand avec l’extrémité proximale d’un ensemble par voie intraveineuse (Figure 1) inséré dans le bouchon de la bouteille et l’extrémité distale, remplacement du tube de 2pi relié à la c DÉCELLULARISATION Hamber/bouteille à la fin de la PA (Figure 1 b). Connectez ce tube 2 ft à la bouteille de défausse.
      Remarque : Les bouteilles sont configurées en carton, comme illustré à la Figure 1 K. Les tubes intraveineux sortent les bouteilles pendaison pour distribuer les réactifs de l’échafaud de poumon.
  2. Processus de DÉCELLULARISATION poumon
    1. Exécutez le PBS hépariné à une pression de perfusion physiologique de 30 mm Hg (Figure 1 K) jusqu'à ce qu’il coule à flot dans la chambre de DÉCELLULARISATION/bouteille et, ensuite, fixez le bloc coeur-poumons à l’extrémité de PA par la canule de PA.
    2. Garder de faire fonctionner la pompe en permanence, afin que toute solution de tampon/excès à l’intérieur de la chambre/bouteille DÉCELLULARISATION obtient mis au rebut.
    3. Le PBS hépariné, traversent la PA pendant 15 min à une pression de perfusion de 30 mm Hg pour le lavage initial (Figure 1 K).
    4. Remplacer la bouteille de PBS héparinée avec 0,1 % dodécylsulfate de sodium (SDS) dans l’eau désionisée et perfuse le poumon pendant 2 h pour la DÉCELLULARISATION.
    5. Après la DÉCELLULARISATION, perfuse autoclavée désionisée par le biais de l’échafaud de poumon pendant 15 min.
    6. Puis, perfuse 1 % de détergent non ionique dans l’eau désionisée pendant 10 min.
    7. Remplacer la DÉCELLULARISATION chambre/bouteille 500 ml de PBS autoclavé additionné d’antibiotiques de x 1 (pénicilline-streptomycine amphotéricine), conservant le poumon suspendus avec le bouchon à l’intérieur de la bouteille.
    8. Jeter l’intraveineuse la valeur, mettre le tuyau de 2 pieds attaché au conteneur discarding remonte à la fin de l’artère pulmonaire de la chambre de DÉCELLULARISATION et faire fonctionner la pompe à 6 mL/min (Figure 1D).
    9. Perfuse les poumons pendant 72 h et garder changeant le PBS avec antibiotiques toutes les 12 h.
      Remarque : Le poumon acellulaire est prêt pour une utilisation immédiate. Il peut être conservé à-80 ° c jusqu'à ce que nécessaire. Si les taches roses ou des caillots de sang peuvent être visualisées clairement dans les lobes pulmonaires, jeter le poumon. Il est possible de tester au hasard pour l’ADN ou l’histopathologie. Un poumon acellulaire complet n’affichera pas de cellules et 99,9 % de l’ADN vont être lavé.
      Remarque : Lorsque vous travaillez avec un modèle cellulaire pulmonaire, ignorez la DÉCELLULARISATION. Le poumon récolté (étape 1) peut être défini directement dans le bioréacteur.

3. bioréacteur Set-up

  1. Préparer le biberon de bioréacteur et les éléments nécessaires à la mise en place.
    1. Percez trois trous dans un bouchon de bouteille de 500 mL à égale distance et fixer un raccord Luer femelle dans chacun des trois trous, à l’aide de bagues en nylon noir (Figure 2 a et 2 b).
      Remarque : Dans les deux trous, le raccord Luer lock termine face l’extérieur, tandis que l’intérieur de la bouteille fait face à une extrémité.
    2. Couper un 6 en tube de la pompe, un 2 en tube, un 6 en tube, un tube de 1,5 pi, un tube de 2 pieds et un tube d’oxygénateur de 10pi par bioréacteur.
    3. Couper une aiguille en acier inoxydable de 18 G et, encore une fois, raccordez les extrémités avec la tuyauterie biocompatible pour une canule trachéale.
    4. Enrouler le tube de l’oxygénateur, avec raccords Luer lock aux extrémités, sur un treillis de solénoïde utilisant des bandes de l’autoclave (Figure 2).
    5. Autoclave susmentionné points et conservez-les dans UV lumière pendant 10 min.
  2. Mettre en place la pompe à l’intérieur de l’incubateur de culture cellulaire normale (37 ° C, 5 % de CO2) avec un espacement approprié entre les plateaux pour s’adapter facilement à une bouteille de 500 mL.
  3. Pulvériser de l’éthanol à 70 % sur la cartouche de pompe et connecter le tuyau de la pompe avec la femelles raccords Luer lock aux deux extrémités à la pompe.
  4. Mettre en place l’oxygénateur enroulé autour de solénoïde grillage à l’intérieur de l’incubateur de culture cellulaire en branchant une extrémité (la sortie) de l’oxygénateur sur le tuyau de la pompe et l’autre extrémité avec le tube de 1,5 pi dans le bioréacteur.
  5. Mettre en place la bouteille de bioréacteur à une prévention des risques biotechnologiques armoire avec des conditions d’asepsie.
    1. Attacher un robinet à 3 voies (jaune) à la tête de l’un de la femelle Luers pour contrôler le flux par le biais de l’autorité palestinienne.
    2. Brancher un robinet à sens unique (bleu) d’une autre cloison de serrure de Luer femelle pour cellule ensemencement par le biais de la trachée (Figure 2F).
    3. Connecter 2 dans un tube à l’extérieur (blanc) et 6 dans un tube à l’intérieur de la bouteille pour faire circuler les médias dehors. Monter un raccord Luer-lock mâle dans un tube de 2 pieds et attachez un style de cosse Luer femelle Tee à fournir l’accessibilité pour ajouter ou supprimer quoi que ce soit.
    4. Fixer un robinet à sens unique sur une des ouvertures du connecteur 3 voies (femelle Luer patte style Tee).
    5. Fixez un raccord Luer-lock mâle et une femelle Luer-lock à tubes de 2 pi.
    6. Ajouter 200 mL de RPMI1640 avec 10 % SVF et 1 % antibiotiques milieu de culture cellulaire (varie selon l’exigence de la cellule) et placer le bioréacteur dans l’étuve. Connecter le tuyau de l’oxygénateur aux deux extrémités ouvertes (robinet unidirectionnel et connecteur Tee) d’en faire un bioréacteur à boucle fermée.
  6. Pré de fonctionner la pompe à 6 mL/min à l’intérieur de l’incubateur de culture cellulaire avec des milieux de culture cellulaire pour remplir les tubes et oxygénateur, afin qu’aucune bulle d’air n’existe dans le tube.
  7. Une fois que les tubes sont remplis de médias, fermer le robinet et enlever la bouteille de bioréacteur de l’incubateur en déconnectant les oxygénateurs des deux extrémités de la bouteille de bioréacteur.
  8. Placer le biberon de bioréacteur dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet, à passer des milieux de culture à travers le robinet d’arrêt et fixer la canule de PA de l’échafaudage de poumon (acellulaire ou cellulaire) au robinet d’arrêt à travers le connecteur Luer mâle.
    NOTE : Ici, il est possible d’utiliser le modèle acellulaire (suivant le processus de DÉCELLULARISATION) ou un bloc coeur-poumon fraîchement récoltés (c'est-à-dire, le modèle cellulaire, car il conserve les cellules natives de rat).
  9. Passer des milieux de culture à travers un aller simple robinet pour enlever tout l’air et attacher la canule trachéale par un fil de soie à la trachée.
  10. Veillez à éviter toute torsion de la PA et de la trachée. Fermer le bouchon du flacon bioréacteur avec le poumon échafaudage à l’intérieur encore une fois, aseptiquement placer le bioréacteur dans l’étuve et, démarrer la pompe à une vitesse de 6 mL/min.
  11. Exécuter des milieux de culture pendant 10-15 min pour s’assurer que tous les lobes se gonflaient et le poumon semble en bonne forme (Figure 2).

4. modèle métastases et ensemencement de la cellule

Remarque : Passez à la cellule d’ensemencement avec le modèle de poumon ci-dessus pour une étude de la croissance de la tumeur primaire. Modifier l’échafaud de poumon (acellulaire ou alvéolaire) comme suit pour le modèle métastatique.

  1. Retirez le bioréacteur à l’échafaud de poumon de l’incubateur et mettez-le dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.
  2. Utiliser une seringue à embout Luer lock pour passer de 5 mL de milieu de culture à travers la trachée et ouvrir le bouchon de bioréacteur avec la pendaison échafaudage pulmonaire (Figure 2F).
  3. À cette étape, une personne de plus est nécessaire pour aider à la modification du poumon à un modèle métastatique.
  4. Téléchargez soie 2-0 prêt et pince angulaire permet de faire un passage à travers la trachée au point de bifurcation.
  5. Attachez la trachée va du poumon droit au point de bifurcation et vérifier la libre circulation des médias par le biais de la trachée au poumon gauche en passant des milieux de culture.
    Remarque : Une fois que la trachée est liée au point de bifurcation, cellules ensemencées à travers la trachée seront automatiquement dirigés aux semences aux lobes gauche. Il peut être testé avant d’ensemencer les cellules par des milieux de culture pousse à travers la trachée. Dans le modèle métastatique, les médias seront déplacera aux lobes gauche uniquement, qui seront gonfle, et pas aux lobes droite10.
  6. Définir une seringue 20 mL de verrouillage Luer sur le dessus de la canule trachéale et ajouter des cellules de cancer du poumon ATCC (A549, H1299) dans 50 mL de milieu de culture complet RPMI1640 (Figure 2F).
  7. Effectuer la cellule ensemencement dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet. Ajouter 15 mL de cellules dans la seringue et laisser passer à travers les lobes pulmonaires par gravité. Ajouter le reste des cellules avant que les bulles d’air passent à travers.
  8. Dans le poumon acellulaire ensemencement, recueillir les médias perfusés gouttes vers le bas dans la bouteille de bioréacteur et laisser passer à travers la trachée à nouveau 3 x.
    NOTE : Les médias perfusé ont parfois les cellules cancéreuses ensemencées. Par conséquent, pour l’ensemencement efficace, remettre les médias encore une fois dans la trachée par le biais de la seringue.
  9. Une fois que les graines, enlevez la seringue, attendre 15 min, ajouter les supports neufs et revenir le bioréacteur à un incubateur. Éliminez les bulles d’air dans le tuyau.
  10. Démarrer la pompe pour perfuse les médias à 6 mL/min.

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Résultats

Le poumon récolté rat maintient intact système vasculaire et les alvéoles11 (figures 3 a et 3 b). Après DÉCELLULARISATION, les composants de la matrice extracellulaire d’un poumon acellulaire, telles que l’élastine, collagène et la fibronectine sont préserver11 (Figure 3, 3D, 3Eet 3F). La DÉCELLULARISATION conduit à...

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Discussion

Le poumon de 4D ex vivo fournit l’occasion d’étudier la croissance tumorale et les métastases dans une configuration de laboratoire. Une matrice de poumon natif est un système complexe qui offre un soutien aux tissus normaux et maintient les interactions cellule-cellule, interactions cellule-matrice, différenciation cellulaire et organisation tissulaire. Il offre la possibilité d’ajouter des composants de microenvironnement tumoral pour étudier leurs effets sur la croissance tumorale et l’interaction avec d’autr...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Kim P. min bénéficié du soutien de subvention le deuxième John W. Kirklin bourse de recherche, American Association for thoracique chirurgie, Graham Research Foundation, Houston méthodiste spécialité médecin subvention de groupe et M. Michael et Joann H. cône Research Award. Nous remercions Ann Saikin pour la langue de rédaction du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Sprague Dowley ratHarlan206MÉcouvillon mâle
la chlorhexidinePrevantics, NY, USANDC 10819-1080-1
HeparineSagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USANDC 25021-400-10
Aiguille de calibre 18McMaster Carr, USA75165A249
2-0 cravate en soieEthicon, San Angelo, TX, USAA305H
Pompe Masterflex L/SCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USAEW-07554-80
Tête de pompe Masterflex L/SCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USAEW-07519-05
Cartouche de pompe Masterflex L/SCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USAEW-07519-70
Tube TygonCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA14171211
Tube de pompe MasterFlexCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA06598-16
Connecteurs Luer lock femellesCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA45508-3475165A249
Connecteurs Luer lock mâlesCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA45513-04
anneau en nylon noirCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USAEW-45509-04
Set intraveineuxCareFusion41134E
Dodécylsulfate de sodium (FDS)Fisher ScientificCAS151-21-3
Triton X-100Sigma-AldrichX100-1L
AntibiotiquesGibco15240-062
Oxygénateur en siliconeCole-Parmer, Vernon Hills, IL, États-UnisABW00011Saint-GoBain-Wire
mesh1164610105LowesNew York Fil
Femelle luer Lug Style TEECole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA45508-56
Bague de verrouillage intégrale luer mâle à la série 200 BarbCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA45518-08
Coupleur de style filetage luer femelleCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA45508-22
Connecteur ClaveICU Medical11956
Hi-Flo et commerce ; Robinet d’arrêt 4 voies avec serrure luer mâle pivotanteMédicalMX9341L
MasterFlex Tube de pompeCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA06598-13pour canule
à

Références

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Mots-clés

Mod le de cancer du poumonpoumon ex vivoprocessus de d cellularisationsyst me de bior acteurcellules tumorales circulantesl sions m tastatiquesperfusion d h parineanalyse histopathologiqueensemencement cellulaire

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