Quantification des Efferocytosis en microscopie par Fluorescence des cellules individuelles

Résumé

Efferocytosis, la suppression phagocytaire des cellules apoptotiques, est nécessaire pour maintenir l’homéostasie et est facilitée par les récepteurs et les voies de signalisation qui permettent la reconnaissance, d’une durée et l’internalisation des cellules apoptotiques. Ici, nous présentons un protocole de microscopie de fluorescence pour la quantification de l’efferocytosis et l’activité des voies de signalisation d’efferocytic.

Résumé

Étudier la régulation de l’efferocytosis exige que les méthodes qui sont en mesure de quantifier avec précision la captation des cellules apoptotiques, d’étudier les processus cellulaires et signalisation contrôlant efferocytosis. Cette quantification peut être difficile à réaliser car les cellules apoptotiques sont souvent efferocytosed fragmentaire, d'où nécessité de méthodes qui peuvent délimiter avec précision entre la partie efferocytosed d’une cible apoptose versus résiduelle cellulaire unengulfed fragments. L’approche décrite ci-après utilise double-marquage des approches afin de quantifier avec précision la dynamique de capacité efferocytosis et efferocytic des efferocytes tels que les macrophages. Le cytosol de la cellule apoptotique est marqué par un agent de la cellule de suivi pour permettre un suivi de toutes les matières de culture cellulaire apoptotique, tandis que biotinylation surface de la cellule apoptotique permet la différenciation entre intériorisée et non-internalisés fractions de cellules apoptotiques. La capacité d’efferocytic d’efferocytes est déterminée en prenant des images fluorescentes des cellules vivantes ou fixes et quantifier la quantité de lié par rapport aux cibles intériorisées, comme dissociés par coloration de streptavidine. Cette approche offre plusieurs avantages par rapport aux méthodes telles que de la cytométrie en flux, à savoir la délimitation exacte des non-efferocytosed versus efferocytosed fractions de cellules apoptotiques, la capacité de mesurer la dynamique efferocytic par microscopie des cellules vivantes et le capacité d’effectuer des études de signalisation cellulaire dans les cellules exprimant des transgènes fluorescent marqué. Les méthodes décrites dans le présent protocole combiné, servent de base pour une approche expérimentale flexible qui peut être utilisée pour quantifier avec précision l’activité efferocytic et interroger les voies de signalisation cellulaires actives au cours de l’efferocytosis.

Introduction

L’apoptose ou mort cellulaire programmée, est un processus physiologique fortement réglementé qui se produit dans la plupart des organismes pluricellulaires et est essentiel pour leur développement et l’homéostasie du¹. En plus d’être impliqué dans le renouvellement cellulaire normale et le développement embryonnaire, l’apoptose permet l’élimination des cellules infectées ou endommagées, des tissus et peut être déclenchée en réponse à l’infection, inflammation, cancer et aussi par des interventions médicales comme la radiothérapie ou stéroïdes¹. Exposent les cellules apoptotiques « manger-moi » sur leur surface des cellu....

Protocole

Collecte de sang des volontaires sains a été approuvé par la Health Sciences Research Ethics Board de l’Université de Western Ontario. Ponction veineuse a été effectuée conformément aux directives de l’énoncé de politique des trois conseils sur la recherche humaine.

1. culture et préparation de la lignée Monocyte THP-1

1. Monocytes THP-1 de la culture comme une culture en suspension dans des flacons de T25 à 37 ° C + 5 % de CO₂. Les cellules doivent être cultivées dans 5 mL de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10 % de sérum fœtal (SVF).
2. Chaque jour suspend des cellules uniformément parto....

Résultats

Culture de cellules Jurkat avec résultats la staurosporine 1 µM dans l’apoptose de la nuit > 95 % des cellules, qui peuvent être confirmés avec l’annexine V, coloration (Figure 1). Autres types de cellules peuvent être utilisés pour ces expériences, même si la concentration de la staurosporine et la durée du traitement la staurosporine auront besoin d’être optimisé pour chaque lignée cellulaire. Pour une détection fiable et la quantification des efferocyto.......

Discussion

Les méthodes décrites dans le présent protocole permettent l’imagerie et la quantification du processus dynamique d’efferocytic, en utilisant des approches tant fixe-cellules et cellules vivantes. Ces approches offrent plusieurs avantages par rapport aux flux couramment utilisés méthodes axées sur la cytométrie en flux^23,24. L’utilisation de dedans-dehors la coloration avec des échantillons fixes permet une quantification plus robuste et plus précise du taux et l.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RPMI 1640 Média	Wisent	3500-000-EL
Média DMEM	Wisent	319-005-CL
Sérum fœtal bovin (FBS)	Wisent	080-150
	PBS Wisent	311-010-CL
18 mm lamelles circulaires en verre #1.5 épaisseur	Microscopie électronique Sciences	72290-08	La taille et la forme de la lamelle ne sont pas critiques, mais 18 mm s’insèrent dans les puits d’une plaque standard à 12 puits, ce qui simplifie la culture cellulaire
Staurosporine	Cayman Chemical	81590	Dissoudre dans le DMSO à 1 mM (solution mère 1 000x)
Annexine V-Alexa 488	ThermoFisher	R37174
EZ-Link NHS-Biotine	ThermoFisher	20217	Stocker dans un dessicateur. Ne préparez pas de solution mère.
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
CellTrace FarRed	ThermoFisher	C34572
CellTrace Orange	ThermoFisher	C34851
Hoescht 33342	ThermoFisher	62249
FITC-Streptavadin	ThermoFisher	SA1001
Milieu de séparation lympholyte-polycellulaire	Cedarlane Labs	CL5071
Humain recombinant M-CSF	Peprotech	200-04
Humain recombinant IL-4	Peprotech	300-25
J774.2 Lignée cellulaire de macrophage	Sigma-Aldrich	85011428-1VL
THP-1 Lignée cellulaire de monocyte humain	ATCC	TIB-202
Lignée de cellules T Jurkat	ATCC	TIB-152