Article de méthode

Quantification des Efferocytosis en microscopie par Fluorescence des cellules individuelles

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DOI :

10.3791/58149

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18 août 2018

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1Department of Microbiology and Immunology and the Center for Human Immunology, University of Western Ontario, 2Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, 3Department of Respiratory Research, Aintree University Hospital NHS Foundation Trust

Dans cet article

Résumé

Efferocytosis, la suppression phagocytaire des cellules apoptotiques, est nécessaire pour maintenir l’homéostasie et est facilitée par les récepteurs et les voies de signalisation qui permettent la reconnaissance, d’une durée et l’internalisation des cellules apoptotiques. Ici, nous présentons un protocole de microscopie de fluorescence pour la quantification de l’efferocytosis et l’activité des voies de signalisation d’efferocytic.

Résumé

Étudier la régulation de l’efferocytosis exige que les méthodes qui sont en mesure de quantifier avec précision la captation des cellules apoptotiques, d’étudier les processus cellulaires et signalisation contrôlant efferocytosis. Cette quantification peut être difficile à réaliser car les cellules apoptotiques sont souvent efferocytosed fragmentaire, d'où nécessité de méthodes qui peuvent délimiter avec précision entre la partie efferocytosed d’une cible apoptose versus résiduelle cellulaire unengulfed fragments. L’approche décrite ci-après utilise double-marquage des approches afin de quantifier avec précision la dynamique de capacité efferocytosis et efferocytic des efferocytes tels que les macrophages. Le cytosol de la cellule apoptotique est marqué par un agent de la cellule de suivi pour permettre un suivi de toutes les matières de culture cellulaire apoptotique, tandis que biotinylation surface de la cellule apoptotique permet la différenciation entre intériorisée et non-internalisés fractions de cellules apoptotiques. La capacité d’efferocytic d’efferocytes est déterminée en prenant des images fluorescentes des cellules vivantes ou fixes et quantifier la quantité de lié par rapport aux cibles intériorisées, comme dissociés par coloration de streptavidine. Cette approche offre plusieurs avantages par rapport aux méthodes telles que de la cytométrie en flux, à savoir la délimitation exacte des non-efferocytosed versus efferocytosed fractions de cellules apoptotiques, la capacité de mesurer la dynamique efferocytic par microscopie des cellules vivantes et le capacité d’effectuer des études de signalisation cellulaire dans les cellules exprimant des transgènes fluorescent marqué. Les méthodes décrites dans le présent protocole combiné, servent de base pour une approche expérimentale flexible qui peut être utilisée pour quantifier avec précision l’activité efferocytic et interroger les voies de signalisation cellulaires actives au cours de l’efferocytosis.

Introduction

L’apoptose ou mort cellulaire programmée, est un processus physiologique fortement réglementé qui se produit dans la plupart des organismes pluricellulaires et est essentiel pour leur développement et l’homéostasie du1. En plus d’être impliqué dans le renouvellement cellulaire normale et le développement embryonnaire, l’apoptose permet l’élimination des cellules infectées ou endommagées, des tissus et peut être déclenchée en réponse à l’infection, inflammation, cancer et aussi par des interventions médicales comme la radiothérapie ou stéroïdes1. Exposent les cellules apoptotiques « manger-moi » sur leur surface des cellules, des signaux qui sont reconnues par les récepteurs sur un éventail de phagocytes professionnels et non professionnels, appelés « efferocytes ». L’engagement de ces récepteurs induit la captation et la dégradation de la cellule apoptotique de l’efferocyte par un processus appelé efferocytosis2,3. Phosphatidylsérine est le meilleur caractérisés manger-me signal conduite efferocytosis. Il se limite normalement au feuillet interne de la membrane plasmique, avec l’apoptose activant un scramblase de lipides qui perturbe cette asymétrie de la membrane, exposant ainsi la phosphatidylsérine à la surface cellulaire4. Phosphatidylsérine se trouve sur la surface extracellulaire de certaines cellules non-apoptotique, tels que les macrophages matures et activation des plaquettes. Cependant, ces cellules ne sont pas efferocytosed en raison de la présence de « ne me mangez pas » signaux comme CD47, sur leur cellule surface5,6,7. Phosphatidylsérine exposée est reconnu par un tableau d’efferocytic récepteurs exprimés par efferocytes. La liaison de ces récepteurs de phosphatidylsérine, soit directement, soit par le biais de l’aide des opsonines, active des voies de signalisation qui favorisent l’enlisement de la cellule apoptotique dans une vacuole de membrane-bondissent, nommée l’efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. l’efferosome fusibles séquentiellement avec les endosomes et les lysosomes, qui fournissent les mécanismes moléculaires nécessaires pour acidifier l’efferosome et de dégrader l’apoptose cellulaire fret13,14. Une fois dégradée, les matériaux de culture cellulaire apoptotique sont victimes de la traite à l’endosome recyclage — un processus qui limite la réponse immunitaire aux antigènes de culture cellulaire apoptotique, et qui peut permettre la récupération des éléments nutritifs de l’apoptose cellulaire13, 15. Un échec en efferocytosis résultats de la clairance réduite de cellules apoptotiques ; ces cellules désamorcées subissent finalement une nécrose secondaire. Les cellules nécrotiques libèrent pro-inflammatoires contenu cytosolique, des pathogènes et des antigènes dans le milieu extracellulaire, conduisant ainsi une gamme de maladies infectieuses, inflammatoires et autoimmunes16,17. Ensemble, l’apoptose et efferocytosis facilitent l’élimination des cellules mourantes et morts et permettent le maintien de l’homéostasie tissulaire.

Étudie les mécanismes moléculaires sous-jacents efferocytosis nécessite des méthodes qui fournissent une quantification claire de l’apport des cellules apoptotic. Cette quantification est compliquée par le fait que contrairement aux autre absorption des mécanismes tels que l’endocytose et phagocytose18,19, efferocytosis ne peuvent conduire à l’enlisement de la cellule cible intactes, ce qui entraîne l’absorption au coup par coup de la cellule apoptotique de la efferocyte20. Le protocole décrit ci-après décrit une analyse d’efferocytosis in vitro qui prévoit la délimitation précise de l’intériorisée par rapport à des portions non intériorisé de cellules apoptotiques individuels et peut être combiné avec une variété de cellules fixes et approches de la microscopie des cellules vivantes. Dosages traditionnels phagocytose ajouter des anticorps spécifiques à la cible phagocytaire à la fin de l’expérience afin d’étiqueter les cibles non-internalisés, alors que notre méthode se distingue par l’étiquetage la cible apoptotique avec biotine covalente21 , 22. alors que les anticorps spécifiques des cellules apoptotic peuvent être utilisés dans cet essai, l’approche biotinylation permet n’importe quelle cible portant des protéines doivent être étiquetées et évite les problèmes potentiels avec réaction croisée des anticorps secondaires si immunostaining est effectuée . Plus précisément, nous exposons la préparation de cellules Jurkat apoptotiques qui ont été à double marquage avec un colorant de repérage des cellules et la biotine. La cellule colorant de repérage permet pour les matériaux de culture cellulaire apoptotique devant être suivi lors du efferocytosis, tandis que la surface biotinylation permettant la discrimination des intériorisé à des parties non intériorisé d’efferocytosed les cellules apoptotiques. Nous décrivons également la culture et la préparation des lignées de cellules J774.2 et THP-1 pour utilisation comme efferocytes murins et humains, les macrophages dérivés de monocytes de M2 à titre d’exemple de cellules primaires efferocytosis et cellules Jurkat pour utilisation en tant que cibles efferocytic. Ces méthodes peuvent facilement être appliquées à d’autres lignées cellulaires ou de cellules primaires, pour cibler les cellules subissant toute forme de mort cellulaire (apoptosepar exemple , une nécrose et necroptosis) et imite taille micron qui simulent les cellules apoptotiques par les revêtements de lipides ou revêtement avec des ligands spécifiques à un récepteur d’efferocytic d’intérêt.

La méthode décrite dans le présent protocole présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes écoulement cytometry basé couramment utilisés dans le champ23,24. Par imagerie directement l’interaction cellule phagocyte-apoptotiques, combinée à un étiquetage clair des deux matériau à cellules apoptotic total et non intériorisé, mesures quantitatives des efferocytosis sont possibles. En outre, l’utilisation de fluorophores insensible à pH limite des facteurs confondants tels que la suppression de la fluorescence FITC et GFP à pH lysosomal qui confond certaines méthodes alternatives25. Enfin, ne pas décrite en détail, ces méthodes peuvent être employées à l’aide d’efferocytes exprimant des transgènes fluorescent marqué, ou avec l’immunomarquage après fixation, afin de permettre à la quantification de l’activité de la molécule de signalisation et de surveillance de la processus cellulaires au cours de l’efferocytosis.

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Protocole

Collecte de sang des volontaires sains a été approuvé par la Health Sciences Research Ethics Board de l’Université de Western Ontario. Ponction veineuse a été effectuée conformément aux directives de l’énoncé de politique des trois conseils sur la recherche humaine.

1. culture et préparation de la lignée Monocyte THP-1

  1. Monocytes THP-1 de la culture comme une culture en suspension dans des flacons de T25 à 37 ° C + 5 % de CO2. Les cellules doivent être cultivées dans 5 mL de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10 % de sérum fœtal (SVF).
  2. Chaque jour suspend des cellules uniformément partout dans les milieux de culture en le secouant doucement le flacon, puis compter immédiatement les cellules avec un hémocytomètre. Les cellules doivent être repiquées lorsque la densité cellulaire atteint 1 x 106 cellules/mL :
    1. Préchauffer le RPMI 1640 + 10 % FBS dans un bain-marie à 37 ° C.
    2. Transfert de 2 x 105 cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL ou un tube conique de 15 mL et les pellets par centrifugation à 500 g à température ambiante pendant 5 min.
    3. Retirez le surnageant sans déranger le culot et Resuspendre le culot dans 1 mL (tube de microtubes de 1,5 mL) ou 5 mL (tube conique de 15 mL) de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    4. Centrifuger le tube à 500 g à la température ambiante pendant 5 min. Retirez le PBS sans déranger le culot cellulaire.
    5. Remettre culot dans 1 mL de fresh RPMI 1640 + 10 % FBS.
    6. Dans un nouveau lieu de fiole T25 4 mL de médias réchauffé et pour cela ajouter les cellules resuspendues de 1.2.5. La culture dans un incubateur à 37 ° C + 5 % CO2 jusqu'à ce que les cellules nécessitent le passage (en général 3 jours), ou jusqu'à ce que les cellules sont nécessaires pour une expérience.
  3. Pour une expérience avec le THP-1-dérivés de monocytes, retirer le nombre nécessaire des cellules de la fiole et la plaque avant le passage :
    1. Placer le nombre requis de lamelles de verre circulaire de 18 mm (épaisseur 1.5) dans les puits d’une plaque de 12 puits — généralement 1 lamelle par condition et/ou validant. Dans chaque bien aliquote monocytes4 THP-1 de 5 x 10. Le nombre de cellules a ajouté à chaque puits peut être modifiée, si nécessaire.
    2. Faire apparaître le volume total de chaque cellule contenant bien à 1 mL à l’aide de RPMI + 10 % FBS chauffé à 37 ° C.
    3. Ajouter 100 nM phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) dans chaque puits et la culture pendant 3 jours induire la différenciation des monocytes THP-1 dans les cellules de type macrophages.

2. culture et préparation de la lignée de cellules macrophages J774.2

  1. Cellules J774.2 de culture dans des flacons de T25 à 37 ° C + 5 % de CO2. Les cellules doivent être cultivées dans 5 mL de Dulbecco Eagle modifié (DMEM) + 10 % FBS et subcultures lorsque la culture atteint 80 à 90 % confluence. Pour cellules de passage :
    1. Retirez tous les médias de la fiole et la hausse une fois avec 5 mL de PBS.
    2. Supprimez les PBS de la fiole et remplacez-les par 5 mL de fresh DMEM + 10 % FBS.
    3. À l’aide d’un grattoir de cellules, grattez le fond du flacon de suspendre les cellules dans les médias. Pipetter vigoureusement les cellules plusieurs fois pour casser vers le haut de n’importe quel agrégat de cellules.
    4. Diluer 1:5 de cellules en retirant 4 mL de la suspension cellulaire de la fiole et remplacez-le avec 4 mL de supports neufs. La suspension de cellules restantes peut être mis au rebut, utilisée pour démarrer une nouvelle culture de cellule dans une fiole de T25 frais ou utilisée pour une expérience.
  2. De mettre en place pour un test d’efferocytosis en utilisant des cellules J774.2 :
    1. Un jour avant le début de l’expérience, suspendre les cellules J774.2 dans 5 mL de supports neufs, selon les étapes 2.1.1–2.1.3. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et préparer la quantité nécessaire de cellules à une concentration de 5 x 104 cellules/mL.
    2. Placer le nombre nécessaire de lamelles de verre circulaire de 18 mm (épaisseur 1.5) dans les puits d’une plaque de 12 puits. Dans chaque bien aliquote 1 mL de la suspension cellulaire de 5 x 104 cellules/mL.
    3. La culture du jour au lendemain pour permettre aux cellules d’adhérer à la lamelle et récupérer à partir de passage.

3. culture des Macrophages primaires humaines M2

  1. Collecter 10 mL de sang hépariné pour chaque plaque de 12 puits de macrophages M2 requis.
  2. Dans un tube à centrifuger 15 mL, couche 5 mL de sang humain sur le dessus de 5 mL de milieu de séparation préchauffé Lympholyte-poly cellule. Préparer les tubes multiples si traitement > 5 mL de sang plutôt que d’utiliser les plus grands tubes de volume.
  3. Centrifuger à 300 x g pendant 35 min, à l’aide de l’accélération moyenne et sans pause.
  4. Retirer délicatement la bande de riche-monocytaire supérieure à l’aide d’une pipette en plastique et le transfert dans un tube à centrifuger 50 mL. Si plusieurs tubes ont été préparées à l’étape 3.2, les bandes peuvent être regroupés dans un tube unique de 50 mL. Mettre le volume du tube à 50 mL avec du PBS.
  5. Centrifuger à 300 x g pendant 8 min et retirez le surnageant. Au cours de cette étape placer autoclavés 18 mm diamètre circulaire lamelles couvre-objet (épaisseur 1.5) dans chaque puits d’une plaque de 12 puits.
  6. Resuspendre le culot dans 300 µL de milieu sans sérum RPMI 1640 par le nombre désiré de puits ; par exemple, si 10 mL de sang a été traité pour préparer un plat bien complet 12, suspension culot cellulaire dans 3,6 mL de médias.
  7. Ajouter 300 µL de la suspension cellulaire à chaque lamelle contenant bien dans la plaque de 12 puits. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C + 5 % de CO2.
  8. Laver délicatement lamelle 3 x 1 ml de PBS chauffée pour enlever toutes les cellules non adhérentes.
  9. Ajouter 1 mL de milieu RPMI 1640 + 10 % BF + 10 recombinante ng/mL humain M-CSF + cell culture antibiotique/antimycosiques. Incuber à 37 ° C + 5 % CO2 pendant 5 jours.
  10. Remplacer le support avec RPMI 1640 + 10 % BF + 10 ng/mL recombinante humaine M-CSF + 10 ng/mL recombinante humaine IL-4 + cell culture antibiotique/antimycosiques. Incuber à 37 ° C + 5 % CO2 pendant 2 jours compléter la polarisation M2.
  11. Macrophages polarisées doivent être utilisés dans les 3 prochains jours.

4. préparation des cellules Apoptotic Jurkat

  1. La culture de cellules Jurkat dans 5 mL de milieu RPMI 1640 + 10 % FBS à 37 ° C + 5 % de CO2. Jurkats sont une lignée cellulaire de suspension et peut être maintenus par passage 1:5 dans les milieux frais, pré chauffées tous les 3 à 5 jours.
  2. Pour préparer les cellules apoptotiques, permettent la culture Jurkat à haute densité (4 – 5 jours après le passage). Aliquote 1,5 mL dans un 1,5 mL microcentrifugeuse tube granules des cellules et par centrifugation à 500 g pendant 5 min.
  3. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 1 mL de milieu RPMI 1640 sans sérum contenant 1 µM staurosporine.
  4. Incuber pendant 16 heures à 37 ° C + 5 % de CO2 pour rendre les cellules apoptotiques.
  5. Si vous le souhaitez, confirmer l’induction de l’apoptose par coloration avec l’annexine v :
    1. Aliquote 100µl de la staurosporine imprégnées de culture de cellules Jurkat dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Cellules de granule par centrifugation à 500 g pendant 5 min, jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 100 µL de milieu RPMI 1640 sans sérum.
    2. Ajouter 1 µL d’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-conjugué annexine V et incuber pendant 10 min à température ambiante dans l’obscurité.
    3. Ajouter 900 µL de PBS et transférer la totalité du volume d’un seul puits d’une plaque de 12 puits contenant une lamelle de verre circulaire de 18 mm (épaisseur 1.5). Tournez en bas dans une centrifugeuse équipée d’un adaptateur de plaque à 200 x g pendant 1 min forcer les cellules à adhérer à la lamelle. Par ailleurs, les cellules peuvent être placés dans une diapositive chambrée pour l’imagerie.
    4. Image à l’aide d’un microscope à fluorescence.

5. quantification Efferocytic absorption et dynamique en utilisant une méthode de criblage cellulaire fixe Efferocytosis et coloration dedans-dehors

  1. Préparer des macrophages humains THP-1, J774.2 ou M2 tel que décrit dans les chapitres 1 à 3, respectivement.
  2. Le soir avant le début de l’expérience préparer apoptose des cellules Jurkat tel que décrit à la Section 4.
  3. Immédiatement avant l’expérience, compter les cellules apoptotiques utilisant un hémocytomètre. Transfert d’un nombre suffisant de cellules apoptotic dans un tube de microtubes de 1,5 mL – nous ajoutons généralement 5 x 105 cellules/puits, offrant un ratio cible : efferocyte de 10:1.
  4. Granules des cellules Jurkat par centrifugation à 500 g pendant 5 min et remettre en suspension dans 500 μl de PBS.
  5. Pendant la centrifugation, aliquote à 10 µL de DMSO dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL. Dissoudre dans du DMSO une quantité minimale de N-hydroxysuccinimidobiotin (NHS-biotine). 5-10 cristaux (~0.005 mg) est suffisante.
  6. Transférer la suspension de cellules/PBS 500 μL apoptotiques dans la DMSO/NHS-biotine contenant un tube. Diluer une cellule colorant de repérage à la concentration recommandée par le fabricant dans la suspension de cellules apoptotiques. Assurez-vous de sélectionner une cellule suivi colorant qui ne se chevauche pas spectralement avec streptavidine-FITC(par exemple rouge ou infra-rouge élément colorant de repérage).
  7. Incuber la suspension pendant 20 min à température ambiante dans l’obscurité. Ajouter un volume égal de RPMI 1640 + 10 % FBS et incuber pendant 5 min à température ambiante dans l’obscurité pour assouvir n’importe quel colorant n’a pas réagi.
  8. Cellules de granule par centrifugation à 500 g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules apoptotiques tachée dans 100 µL de milieu RPMI 1640 + 10 % FBS / puits des macrophages.
  9. Ajouter 100 µL de la suspension de cellules apoptotiques tachée goutte à chaque puits des macrophages. Centrifuger à 200 x g pendant 1 min dans une centrifugeuse équipée d’un adaptateur de plaque pour forcer le contact entre les macrophages et les cellules apoptotiques.
  10. Incuber les plaques pour la période souhaitée de temps à 37 ° C + 5 % de CO2 dans un incubateur de culture de tissus. Pour les macrophages, efferocytosed matériel est habituellement d’abord détectable après 20 à 30 min et se termine après 120 – 180 min.
  11. Point (s) au moment voulu déloger les cellules de l’incubateur. Laver les cellules deux fois avec 1 mL de PBS pour arrêter efferocytosis et supprimer les cellules apoptotiques non-efferocytosed de la température ambiante.
  12. Ajouter FITC conjugué streptavidine à une dilution de 1 : 1 000 à chaque puits et incuber pendant 20 min dans le noir. Cela étiquettera la biotine exposée sur tout matériel non-efferocytosed de cellules apoptotiques.
    Remarque : Si vous le souhaitez, noyaux des cellules peuvent être colorés au cours de cette étape par addition de dilution de 1/20 000 de Hoechst 33342 ou 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, dichlorhydrate (DAPI).
  13. Laver les cellules 3 fois avec 1 mL de PBS, secouant doucement ou de balancement les échantillons pendant 5 min par rinçage. Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde 4 % (PFA) dans du PBS pendant 20 min à température ambiante. Rincer les cellules une fois avec du PBS pour enlever l’excès PFA.
  14. Monter les lamelles couvre-objet sur une diapositive pour l’imagerie et le transfert d’un microscope à fluorescence. Z-piles d’un nombre suffisant de cellules pour la quantification précise de capture — généralement 10 à 30 cellules / condition. Matériau à cellules apoptotic non-internalisé sera apparent dans l’image résultante comme cellule colorant étiqueté matériel enveloppé par la coloration de streptavidine-FITC, tandis qu’efferocytosed matériel forme discrète cellule suivi colorant examen gratuit de n’importe quel streptavidine de repérage la coloration.
  15. Quantifier les efferocytosis dans les images obtenues via une série de mesures :
    1. Calculer l’indice d’efferocytic en déterminant le nombre moyen de discrets efferosomes (cellule colorant+/streptavidin– examen de suivi) par les macrophages. Quantifier les uniquement les macrophages lié à une cellule apoptotique ou contenant ≥ 1 efferosomes visibles. Macrophages Records lié à une apoptose cellulaire, mais manquent efferosomes discrets, comme ayant un indice d’efferocytic de 0.
    2. Calculer l’efficacité efferocytic par la mesure de la fraction des macrophages contenant ≥ 1 efferosome.
    3. Calculer le taux d’efferocytosis par les cellules d’imagerie fixe et tachée à plusieurs points de temps. Seuls les macrophages image lié à cellules apoptotiques, ou contenant des efferosomes visibles, avec z-piles capturé de chaque cellule. Une fois l’image, déterminer le taux d’efferocytosis :
      1. À l’aide de la coloration de la Streptavidine comme un guide et l’outil de sélection à main levée ou Polygone dans26 Fidji/ImageJ (ou autre progiciel d’analyse image), entourez tous de la cellule de suivi colorant+/streptavidin– (p. ex. intériorisé) matériau en un seul plan de la z-pile. Mesurer l’intensité intégrée de la cellule de colorant de repérage de cette région. Des mesures individuelles pour chaque efferosome (par exemple diamètre, positionnement par rapport à la bordure de cellule ou de noyau, etc.)15,27 peuvent facilement être acquises en même temps avec ces mesures, grandement augmenter les données recueillies lors de l’analyse.
      2. Sur le même profilé en z, à l’aide de la Streptavidine coloration comme guide et l’outil de sélection à main levée ou Polygone, entourez tous de la cellule de suivi colorant+/streptavidin+ (p. ex. non intériorisé) matériel dans un seul plan de la z-pile . Inclure seulement la coloration des cellules apoptotiques au contact du phagocyte. Mesurer l’intensité intégrée de cette région.
      3. Répétez les étapes 4.2.3.1 à 4.2.3.2 pour profilés en z restants de l’image. Somme de l’intensité intégrée du efferocytosed (ΣFEP) et des matériaux non-efferocytosed (Σne). La fraction de la cellule apoptotique qui a été efferocytosed peut être calculée pour la cellule sous la forme :
        figure-protocol-1
      4. Quantifier la fraction efferocytosed pour toutes les cellules à tous moments. Notez que l’intensité de fluorescence de l’apoptose des cellules/efferosomes peut varier entre les images, en raison des variations dans l’absorption de la cellule de suivi des colorants de cellules apoptotiques individuels et en raison de changements dans les paramètres d’acquisition image par exemple de temps d’exposition. À ce titre, seule comparaison normalisée valeurs telles que la Fraction Efferocytosed, ou valeurs d’intensité indépendante comme indice d’efferocytic et efferocytic efficacité, entre les images, entre les conditions expérimentales et entre répéter les expériences.
    4. Afin d’assurer que l’ensemble de données qui en résulte reflète fidèlement la variation d’efferocytosis entre les cellules, effectuer ces analyses sur le nombre maximal de cellules possibles dans chaque expérience.
      NOTE : Indice de l’efficacité et d’efferocytic Efferocytic on peut calculer rapidement (quelques secondes/cellule), et nous visent généralement à analyser au moins 100 cellules par expérience, répétant chaque expérience au moins 3 fois. Calcul de la fraction d’efferocytosed matériel et des mesures spécifiques efferosome sont plus laborieux, prenant généralement 2 à 3 min/cellule pour un analyste expérimenté. Pour ces calculs, Nous quantifions un minimum de 15 cellules par État, par l’expérience.
    5. Indice efferocytic record, fraction efferocytosed et efferosome des données sur une base par cellule.
      NOTE : Cela permet l’analyse des données en utilisant des approches de cellule unique, permettant ainsi des variations inter-cellules à quantifier. Des analyses de niveau de la population peuvent encore se dérouler sur ces ensembles de données en faisant la moyenne unicellulaires données acquises lors d’expériences individuelles. Efferosome spécifiques des mesures peuvent être analysées au niveau de la population, niveau unicellulaire et sous ensembles (par exemple sous forme de populations d’efferosomes indépendante des cellules qui les contiennent)15.

6. analyse de Efferocytosis des cellules à l’aide de cellules apoptotiques de vivre

  1. Préparer les macrophages THP-1, J774.2 ou M2 comme décrit aux étapes 1-3, respectivement. Si nécessaire, les cellules doivent être transfectées avec transgènes ou autres génétiques construit au moins 18 h avant d’effectuer toutes les expériences.
  2. Le soir avant le début de l’expérience, préparer apoptose des cellules Jurkat tel que décrit dans les Sections 4 et 5 avec les modifications suivantes :
    1. Diluer les cellules et induisent l’apoptose selon 4.1 à 4.3 et collecter le nombre requis de cellules apoptotiques selon 5.3 – 5,4.
    2. Ajouter une cellule à colorant à la concentration recommandée par le fabricant de repérage à la suspension de cellules apoptotiques. Incuber la suspension pendant 20 min à température ambiante dans l’obscurité. Ajouter un volume égal de RPMI 1640 + 10 % FBS et incuber pendant 5 min à température ambiante dans l’obscurité pour assouvir n’importe quel colorant n’a pas réagi. N’ajoutez pas de NHS-biotine pour ces expériences.
    3. Cellules de granule par centrifugation à 500 g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules apoptotiques tachée dans 100 µL de milieu RPMI 1640 + 10 % FBS / puits des macrophages.
  3. Si nécessaire, étiquette les macrophages en supprimant des milieux de culture dans chaque puits et ajouter 500 µL de PBS contenant les fabricants recommandés de dilution d’une cellule de suivi de colorant qui ne se chevauche pas spectralement par la cellule de colorant de repérage ajouté pour les cellules apoptotic ou toute transgènes fluorescentes exprimées par les macrophages. Incuber pendant 20 min à température ambiante dans l’obscurité, puis ajouter un volume égal de DMEM + 10 % FBS et incuber pendant 5 min à température ambiante dans l’obscurité pour assouvir n’importe quel colorant n’a pas réagi.
  4. Transférer la lamelle contenant des macrophages dans une chambre de Leyde. Ajouter 400 µL de DMEM + 10 % FBS, suivi par 100 µL de la suspension de cellules apoptotiques étiquetées. Mélanger doucement pipetage médias 2 à 3 fois.
  5. Transfert de la chambre de Leiden à une chauffée et CO2-perfusée chambre d’un microscope à fluorescence de cellules vivantes.
    Remarque : Pour les configurations de microscope qui n’ont pas de capacités de perfusion2 CO, utilisez des tissus milieu de culture mis en mémoire tampon avec 1 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acide (HEPES) plutôt que le bicarbonate de sodium pour maintenir un pH physiologique tout en le la culture est exposée à l’air.
  6. Capturer une série Time-lapse contenant une image de lumière blanche (contraste de phase ou DIC) et des images de toutes les étiquettes fluorescentes :
    1. Utiliser une lentille d’objectif X 100 pour les expériences où régler les détails fins est requis (par exemple dynamique de membrane des interactions cellulaires phagocyte-apoptotiques). Pendant ce temps, des mesures plus générales (taux d’apport des cellules apoptotiques, temps d’interaction entre les macrophages et les cellules apoptotiques, etc.) sont mieux imagés à l’aide d’un 60 X ou 63 X objectif.
    2. Le cas échéant, utiliser point-visite à l’image de plusieurs champs de vision au cours d’une seule acquisition, augmentant ainsi le nombre d’événements efferocytic, capturé dans une expérience simple
    3. Parce qu’efferocytes engloutir souvent de petits fragments de cellules apoptotiques, plutôt que des cellules intactes, il est préférable de capturer z-piles. Pour minimiser la phototoxicité, capturer z-sections séparées par la profondeur focale de votre objectif de microscopes (généralement de 0,5 à 1,0 µm), l’épaisseur de la cellule (en général 8 à 10 µm pour les macrophages, par exemple 8 – 20 tranches/cellule). Cela garantit que tous les engouffrement et traite des événements seront visibles dans au moins un plan z. Également utiliser gros imite de cellule apoptotique (1 à 5 µm de diamètre) ou les cellules apoptotiques qui subissent une fragmentation minime au cours de l’efferocytosis (p. ex. chaleur neutrophiles choqués) plutôt sans z empilement. Nous avons décrit la préparation de mimiques et de neutrophiles apoptotic précédemment28.
    4. Pour minimiser le photoblanchiment, utiliser des fluorophores lumineux et capture des images en utilisant des paramètres d’acquisition qui réduisent au minimum le photoblanchiment — par exemple les excitation de faible intensité combinée avec caméra haute gain et courte exposition fois29. Nous recommandons fortement d’utiliser un microscope équipé d’une caméra de haute sensibilité électromagnétique couplé dispositif de charge (EM-CCD) ou spinning-disque confocale et une platine mécanique piézoélectrique à grande vitesse, pour cette forme d’imagerie.
  7. Le nombre de méthodes d’analyse possibles qui peuvent s’appliquer à ces vidéos time-lapse est étendu et au-delà de notre capacité d’examiner ici. Comme exemples, utilisez manuel ou automatisé, logiciel de suivi pour suivre la fusion, la fission et la circulation des efferosomes dans les cellules15, quantifier efferosome dynamique de fusion avec endolysosomes par analyse de colocalisation dans les macrophages exprimant Compartiment spécifique fluorescente transgènes13, surveiller les processus de capture telles que sonder et coupe formation30, déterminer la dynamique de recrutement de la signalisation et le trafic des protéines à l’efferosome13, et/ou quantifier l’activité de dégradation des efferosomes à l’aide de cellules apoptotiques marquées avec des fluorophores sensibles au pH, oxydant sensibles ou activés par protéase31.

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Résultats

Culture de cellules Jurkat avec résultats la staurosporine 1 µM dans l’apoptose de la nuit > 95 % des cellules, qui peuvent être confirmés avec l’annexine V, coloration (Figure 1). Autres types de cellules peuvent être utilisés pour ces expériences, même si la concentration de la staurosporine et la durée du traitement la staurosporine auront besoin d’être optimisé pour chaque lignée cellulaire. Pour une détection fiable et la quantification des efferocyto...

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Discussion

Les méthodes décrites dans le présent protocole permettent l’imagerie et la quantification du processus dynamique d’efferocytic, en utilisant des approches tant fixe-cellules et cellules vivantes. Ces approches offrent plusieurs avantages par rapport aux flux couramment utilisés méthodes axées sur la cytométrie en flux23,24. L’utilisation de dedans-dehors la coloration avec des échantillons fixes permet une quantification plus robuste et plus précise du taux et l...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Cette étude a été financée par les instituts de la santé (IRSC) Operating Grant MOP-123419, Sciences naturelles et ingénierie recherche Conseil de Canada Discovery Grant 418194 et un Ontario Ministère de la recherche et Innovation recherche précoce des prix à la BH. DGW a contribué à certaines des images présentées, à l’optimisation des protocoles et à la rédaction du manuscrit ; Il a été financé par une subvention de l’amorçage de l’Université de Liverpool. CY est financé par une bourse d’études supérieures Vanier et la bourse de doctorat des IRSC. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
RPMI 1640 MédiaWisent3500-000-EL
Média DMEMWisent319-005-CL
Sérum fœtal bovin (FBS)Wisent080-150
PBS Wisent311-010-CL
18 mm lamelles circulaires en verre #1.5 épaisseurMicroscopie électronique Sciences72290-08La taille et la forme de la lamelle ne sont pas critiques, mais 18 mm s’insèrent dans les puits d’une plaque standard à 12 puits, ce qui simplifie la culture cellulaire
StaurosporineCayman Chemical81590Dissoudre dans le DMSO à 1 mM (solution mère 1 000x)
Annexine V-Alexa 488ThermoFisherR37174
EZ-Link NHS-BiotineThermoFisher20217Stocker dans un dessicateur. Ne préparez pas de solution mère.
DMSOSigma-AldrichD2650
CellTrace FarRedThermoFisherC34572
CellTrace OrangeThermoFisherC34851
Hoescht 33342ThermoFisher62249
FITC-StreptavadinThermoFisherSA1001
Milieu de séparation lympholyte-polycellulaireCedarlane LabsCL5071
Humain recombinant M-CSFPeprotech200-04
Humain recombinant IL-4Peprotech300-25
J774.2 Lignée cellulaire de macrophageSigma-Aldrich85011428-1VL
THP-1 Lignée cellulaire de monocyte humainATCCTIB-202
Lignée de cellules T JurkatATCCTIB-152

Références

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Quantification de l eff rocytoseCaptation de cellules apoptotiquesApproche de double marquageMarqueur de suivi cellulaireBiotinylation de surfaceMarquage la streptavidineMicroscopie sur cellules vivantesG nes rapporteurs fluorescentsAnalyse en pile Z

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