Une méthode efficace de tamisage pour isoler Intact glomérules du rein de Rat adulte

Le glomérule est une touffe hautement spécialisée des capillaires responsables de la filtration du plasma en circulation. Elle forme le début du néphron, qui est l’unité fonctionnelle de base du rein. Fonction glomérulaire est définie par un endothélium capillaire unique fenêtré, la membrane de la fente des podocytes et une membrane basale intermédiaire. Ces couches forment une barrière semi-perméable permettant l’excrétion sélective des substances dans le filtrat. L’eau, d’ions et autres petites molécules passent généralement par, tandis que les plus grosses molécules sont conservés dans le plasma. Podocytes sont des cellules épithéliales spécialisées qui se répandent sur la membrane basale, qui entourent les capillaires avec des projections cytoplasmiques appelées processus de pied. Le pied traite des podocytes adjacentes pavimenteuses et est traversé par des diaphragmes de fente composés de protéines telles que néphrine, podocin, P-cadhérine et ZO-1¹. En coupe transversale, ces pieds processus sont uniformément disposées sur la membrane basale. Dans les glomérules malades, le processus de pied devient grossièrement anormale ou « effacés », menant à une fuite anormale des matières de plasma dans le filtrat. Ainsi, les lésions glomérulaires sont caractérisées par la présence de quantités anormalement élevées de protéines (p. ex., protéinurie) et/ou de globules rouges (p. ex., hématurie) dans l’urine. En outre, les podocytes blessés perdre expression de néphrine ainsi que son régulateur 1 tumeur de Wilms (WT1), une protéine clé responsable de la maintenance de différenciation^2,3. Les glomérules sont une cible principale des dommages dans la néphropathie diabétique et autres glomerulonephritides comme la maladie minimale de changement, néphropathie membraneuse et glomérulosclérose segmentaire. Ces maladies sont des causes majeures de l’insuffisance rénale progressive et le développement de l’insuffisance rénale terminale, une condition dans laquelle la survie repose sur la dialyse ou transplantation rénale. Par conséquent, il est important d’étudier les glomérules pour comprendre la pathologie des maladies rénales chroniques.

Un système de culture cellulaire est essentiels à l’étude de la biologie glomérulaire. En raison de son rôle central dans la génération de la membrane de la fente, ainsi que l’existence de certaines maladies protéinuries due à des mutations de protéine de membrane fente, beaucoup de recherches a tout naturellement utilisé le podocyte isolément. Cela a conduit à la génération de lignées cellulaires primaires podocyte d’utiliser in vitro. Ces cellules peuvent être cultivées dans une variété de conditions et peuvent même être cultivés sur des supports perméables pour évaluer la perméabilité⁴. Toutefois, l’isolement des cellules en prolifération souvent sélectionne les cellules dédifférenciées qui ont perdu certains de leurs marqueurs podocyte. Cela a conduit à la génération des podocytes conditionnellement immortalisées dérivé d’une souche de souris transgéniques portant un mutant thermosensibles SV40 grand T du gène de la (par exemple immortomouse), qui pourrait être cultivé en culture, mais aussi être différenciés pour exprimer toute une gamme de marqueurs de podocyte⁵. Ces méthodes de culture primaire ont été déterminant dans la compréhension podocyte biologie^4,6,7.

Néanmoins, cultures contenant des types de cellule unique n’ont pas les relations intercellulaires qui se produisent in vivo ainsi que la structure de soutènement et matrices et monocouches de ces cellules ne pas nécessairement récapituler tridimensionnelles architecture des glomérules. Les podocytes immortalisées peut également être lourd et difficile à la culture de⁸et exigent la possession de l’autre immortomouse ou une portion de départ de cellules d’établi enquêteurs pour commencer. En outre, le glomérule regroupe non seulement podocytes, mais aussi les cellules endothéliales des capillaires et la membrane basale, ainsi que les cellules mésangiales qui assurent un soutien pour la structure. Il est donc utile de développer une ex vivo approche disponible à tous les chercheurs pour l’étude des glomérules intacts qui conservent leur architecture native ainsi que toutes les cellules constituant le glomérule normal.

En 1958, Cook et Pickering a décrit le premier isolement des glomérules du rein de lapin. Après les observations que l’embolie est devenu déposée dans les glomérules, ils ont postulé que les particules de taille identique pourraient servir à isoler spécifiquement ces structures. En effet, l’injection de particules d’oxyde de fer dans le rein a conduit à la capture de ces particules dans les glomérules. Après dissociation mécanique et tamisage du rein, les glomérules pourraient être isolés intact et avec pureté grâce à l’utilisation de la séparation magnétique,⁹. En 1971, Misra a montré que l’oxyde de fer perfusions pouvaient être supprimées et l’isolement glomérulaire réalisé avec tamisage d’homme hachée, chien, lapin ou rat rein tissu¹⁰. Cette technique a été modifiée depuis puis selon l’objectif des enquêteurs mais a essentiellement entraîné des préparations purifiées qui pourrait être approfondie ou dont les cultures de cellules primaires pourraient être établi^{11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17}.

Nous décrivons ici un protocole pour l’isolement d’intacts viables glomérules du rein de rat. L’ensemble du protocole prend seulement quelques heures. Bien qu’ils ne prolifèrent pas, les plans expérimentaux de toute taille peuvent être soutenus en augmentant tout simplement le nombre de reins comme matériau de départ. Bien qu’il existe des protocoles publiés pour la séparation de billes magnétiques des glomérules, ils nécessitent une injection intraveineuse de perles, sont plus chers et peuvent altérer la biologie puisque les perles sont soit conservés par les glomérules en culture ou exigent glomérulaires » lyse » et extraction par centrifugation,¹⁹. Par rapport aux glomérules de souris, la grande taille de glomérules de rat (près de 100 µm en deux mois vieux rats¹⁸) rend beaucoup plus facile de les séparer des autres structures du rein à l’aide d’une technique simple de tamisage.

Comme preuve de leur utilité, nous avons caractérisé les glomérules pour illustrer les différents types de cellules. Elles peuvent être exposées à des agents connus pour blesser les glomérules in vivo, et on démontre les effets néfastes du sulfate de protamine (PS) sur ces cultures. PS est une polycation qui neutralise les sites anioniques le long de la paroi capillaire glomérulaire²⁰. Cette neutralisation a un effet dramatique sur la barrière de filtration glomérulaire et donc augmente la protéinurie et pied effacement de processus. Ces glomérules pouvant être évaluées par immuno-Blot pour les protéines clés tels que néphrine et WT1 afin d’évaluer l’état de santé général. En outre, leur structure peut être évaluée avec, immunofluorescence, microscopie photonique et électronique.

Dans l’ensemble, ce protocole est accessible à la plupart des enquêteurs (il suffit d’un accès pour les animaux et du matériel simple). Avec des caractéristiques morphologiques, laissés intacts, le chercheur est en mesure d’analyser les glomérules et voir comment les autres types de cellules importantes et préservation de matrice dans les glomérules affectent la fonction et maladie la progression, une lacune des cultures podocyte.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Pittsburgh.

1. isolement des glomérules de Rat

1. Pour préparer un tampon d’isolement 1 % stérile, ajouter 5 g d’albumine sérique bovine (BSA) dans un bécher de 600 mL.
   1. Verser 500 mL de 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans le bol et remuer avec un agitateur magnétique jusqu'à ce que tous les BSA est dissoute.
   2. Filtre stérile le tampon de BSA/PBS 1 % sous une hotte de culture cellulaire.
      Remarque : Le tampon stérile de BSA/PBS 1 % peut être conservé à 4 ° C pendant une semaine.
2. Obtenir des rats Sprague-Dawley de 2 à 4 150 à 200 grammes.
   1. Euthanasier rats via le dioxyde de carbone par inhalation en utilisant une chambre où 100 % de dioxyde de carbone est introduit à un taux de 10 à 30 % du volume de la chambre par minute. Observer les animaux à l’arrêt de la respiration et s’est évanouie à la couleur des yeux avant son renvoi du dioxyde de carbone.
   2. Préparer la peau sur l’abdomen antérieur avec l’éthanol à 70 % et d’utiliser des tondeuses à cheveux pour enlever les poils, si vous le souhaitez. Faire une incision médiane dans la peau à l’aide de ciseaux chirurgicaux ou un scalpel. Faire une autre incision médiane à travers la couche de muscle pour exposer des organes internes. Prolonger l’incision supérieurement par le diaphragme et le sternum ou la cage thoracique comme méthode secondaire de l’euthanasie.
   3. Isoler et supprimer les deux reins et placer dans un tube conique en plastique stérile de 50 mL avec 30 mL de solution saline tamponnée Hanks (HBSS) sur la glace.
      Remarque : Plusieurs rats peuvent être euthanasiés dans la même chambre et tous les reins peuvent être placés dans le même tube à fond conique.
3. Garder les reins sur glace et le transport d’un capot de culture de cellules stériles. Transférer les reins dans une boîte de Petri stérile contenant 5 mL de HBSS, également sur la glace et retirer et jeter la graisse périrénales avec des ciseaux et forte pince. S’il est toujours présent, également retirer et jeter la capsule entourant le rein en faisant une petite incision superficielle et puis utiliser forceps pointus pour éloigner doucement l’orgue.
   NOTE : Gardez toujours rein isolats sur glace et la pratique technique stérile tout au long de. Un morceau de gaze stérile peut être placé dans la boîte de Pétri comme une surface texturée pour maintenir les reins en place au cours de la manipulation.
   1. Couper les rognons en deux dans la longueur (section médio-sagittal) et enlevez et jetez la medulla (ce qui est de couleur plus foncée) avec un scalpel dans une seconde boîte de Pétri avec 5 mL de HBSS.
   2. Transférer les morceaux restants, qui sont principalement le cortex rénal, dans une troisième boîte de Pétri avec 5 mL de HBSS et découper avec une lame de rasoir stérile jusqu'à ce que les morceaux sont de taille inférieure à 1 mm, ou jusqu'à forme une pâte.
4. Mouiller le dessus et le fond d’un tamis de 180 µm à 1 % BSA/PBS dans un bécher de 500 mL des déchets. Cette étape est essentielle car elle enrobe le tamis avec protéine et réduit l’adhérence des glomérules, qui améliorera le rendement.
5. Placez le cortex haché sur un petit bord de la passoire et utilisez la bride de piston texturé (du côté opposé le joint en caoutchouc) d’une seringue de 10 mL pour mush le tissu à travers le tamis dans un moule à fond assis sur la glace. Rincer périodiquement HBSS, mais utiliser aussi peu que possible pour éviter la dilution de l’échantillon.
   Remarque : Ne pas dépasser les 30 mL du total de la mémoire tampon, donc seulement 25 mL plus peuvent être utilisé ici. La raison pour placer le tissu haché sur un seul bord du filtre est de réduire l’adhérence des glomérules en limitant l’exposition à la partie de la passoire plutôt que la surface entière de tamis.
   1. Pour faciliter cela, réutiliser le liquide de collecte dans la casserole de bas à rincer le tamis. Une fois que le tamisage est terminé, se laver soigneusement le fond de la passoire sur un nouveau tampon BSA/PBS 1 % du fond de la casserole pour capturer des glomérules qui peuvent être plus ou moins collés.
   2. Recueillir l’ensemble du liquide dans la casserole de bas dans plusieurs seringues de 10 mL munis de 20 G aiguilles puis le passer dans l’aiguille au moins 2 fois supplémentaires. Sur la dernière collection, garder le glomérules contenant le liquide dans la seringue jusqu’au moment de passer à travers le tamis 90 µm.
6. Tandis que le liquide est stocké dans les seringues, laver le plat de bas en la rinçant avec 1 % BSA/PBS dans le bécher de déchets et de l’eau le haut et le bas du tamis 90 µm avec 1 % BSA/PBS. Placez le tamis sur le faitout bas sur la glace.
   1. Déposer l’échantillon dans les seringues sur un bord du tamis et bouillie dans le tamis avec une autre seringue comme décrit ci-dessus. Laver avec une solution de la cuve inférieure à recueillir tout ce sur un bord de la passoire.
   2. Une fois le tamisage est terminé, Lavez soigneusement le fond de la passoire comme à l’étape 1.5.1. Recueillir tout le liquide dans le moule à fond dans un tube conique en plastique de 50 mL.
7. Laver le plat de bas avec 1 % BSA/PBS dans un bécher de déchets et mouillé le haut et le bas du tamis 75 µm avec 1 % BSA/PBS. Placez le tamis sur le faitout bas sur la glace.
   1. Déposer l’échantillon sur un bord de la passoire. Liquide doit s’écouler facilement à travers. Rincer par le haut avec au moins 20 mL de 1 % BSA/PBS dans bécher de déchets. Laver soigneusement le fond de la passoire ainsi. Les glomérules restera sur le dessus de ce tamis 75 µm.
   2. HBSS permet de recueillir des glomérules dans une boîte de Pétri en rinçant à travers le tamis à l’envers. Utilisez ici autant HBSS selon les besoins. Recueillir dans un ou plusieurs 50 mL en plastique tubes coniques sur la glace.
8. Centrifuger à 1800 x g pendant 5 min à 4 ° C, retirez le surnageant soigneusement avec une pipette et Resuspendre le culot dans 10 mL de HBSS froid. Combiner les échantillons si plusieurs tubes coniques ont été recueillis en 1.7.2. Répétez l’étape de centrifugation.
9. Remettre en suspension les glomérules dans 5 mL de HBSS jusqu’au moment de passer à l’étape suivante.
10. Si vous le souhaitez, effectuer un comptage des glomérules totales. Pour cela, Prélevez un échantillon de 10 µL avec une pipette et déposer la goutte sur une lame de verre. Afficher sous un microscope, compter les glomérules dans le domaine et multiplier par 500 pour obtenir le rendement total.
    NOTE : La pureté peut être déterminée en comptant le nombre de tubules vu sur le terrain et en divisant par le nombre total de glomérules et les tubules structures. Il devrait y avoir les glomérules de > 95 % dans le champ visuel.
    1. S’il y a une contamination importante tubulaire, répétez les étapes 1.6.1 à partir et n’oubliez pas de laver à fond quand remplir étape 1.7.1. Il s’agit de l’étape dans laquelle contamination tubulaire est plus susceptible de se produire.

2. lésion des glomérules

1. Recueillir les glomérules dans un tube conique en plastique de 15 mL et un essorage vers le bas à 200 x g. remettre dans une quantité appropriée de HBSS basée sur le rendement total afin qu’il y a environ 9 000 glomérules par puits. Pipetter 450 µL de l’échantillon dans chaque puits d’une plaque 24 puits, ou n’importe quel format de plaque qui tient les dosages en aval requis.
   NOTE : Pipetage de haut en bas pour mélanger les glomérules dans un tampon assure une homogénéité de la solution. Les glomérules sont très collante et lourde et seront coller les uns aux autres ainsi que régler au fond d’une solution rapidement et sur les parois du tube.
2. Pour rendre protamine 6 mg/mL sulfate solution (PS), tout d’abord dissoudre 1 g de PS dans 10 mL de dH2O chauffé à 40 ° C dans un tube conique en plastique de 15 mL et vortex soigneusement. Prendre 30 µL de la solution et ajouter à 470 µL de dH2O.
   NOTE : Ceci va produire une solution de 6 mg/mL, et lorsque 50 µL sont ajoutés au puits comme décrit ci-dessous, la concentration finale est 0,6 mg/mL.
   1. En double, ajouter 50 µL de sulfate de protamine (il s’agit d’un 01:10 dilution) à chaque puits d’un groupe, tout en fournissant un autre groupe de 50 µL de HBSS (témoin négatif).
3. Incuber les plaques pendant 4 h à 37 ° C.
4. Tournez en bas le contenu de chaque puits dans un tube de microcentrifuge (4 000 x g, 4 ° C, 10-15 s) et laver deux fois avec 1 mL de PBS chaque.
5. Aspirer hors le lavage final et resuspendre dans 300 µL de PBS. Divisé en trois parties aliquotes à établir à l’isolement des protéines, la transmission electron microscope (TEM) visualisation et immunofluorescence souillant (si).

3. préparation des glomérules pour analyse

1. Tournez en bas le contenu des trois aliquotes (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) et aspirer hors tampons restants et procéder à l’analyse de l’échantillon de TEM, IF, ou l’isolement des protéines.
2. Traitement pour TEM
   1. Difficulté des granulés glomérulaires dans 150 µL de froid glutaraldéhyde à 2,5 % dans du PBS 0,01 M. Retirer soigneusement le fixateur le culot à l’aide d’une pipette Pasteur, en faisant attention à ne pas perturber la pastille, puis rincé avec du PBS et post le fixer dans le tétroxyde d’osmium 1 % avec le ferricyanure de potassium 1 %.
   2. Déshydrater l’échantillon à travers une série graduée de l’éthanol (30, 50, 70, 90, 100, 100, 100 %) et l’oxyde de propylène puis incorporez en époxy, incorporation de matériel.
   3. Coupe semi-mince (300 nm) sections sur un ultramicrotome. Tache avec 0,5 % de bleu de Toluidine dans le borate de sodium 1 % et les examiner sous microscope photonique.
   4. Coupe des coupes ultrafines (65 nm), les taches avec l’acétate d’uranyle et citrate de plomb de Reynold et interroger sous un microscope électronique à transmission.
3. Traitement car si
   1. Ajouter 150 µL d’une gélatine de 12 % dans une solution de PBS et placer immédiatement sur la glace sèche pour former une boulette. Tremper la pastille dans 500 µL de paraformaldéhyde de 2 % / 1 x PBS dans un tube de microcentrifuge durant la nuit à 4 ° C.
   2. Placez la dans un moule et incorporer en ajoutant des moyennes de température (OCT) de coupe optimale sur la glace sèche. 5-10 µm coupes sur un cryotome et procéder à l’immunofluorescence/immunohistochimie ou taches histologiques standards.
4. Pour l’isolement des protéines
   1. Ajouter 150 µL de tampon de RIPA centrifugé granule glomérulaire avec 1,5 µL d’inhibiteur de protéase et dounce avec les homogénéisateurs de tissus.
   2. Procéder au dosage de la protéine et immunoblotting ou toute autre analyse de protéines.

Le protocole de l’époque de l’euthanasie à l’isolement des glomérules peut être complété en moins de 2 h et a un débit élevé et le rendement. Avec une bonne utilisation de la technique, le rendement des glomérules par rein de rat varie de 6 000-10 000 glomérules lors du démarrage avec 8 reins. La suspension définitive est dense avec des glomérules et a une pureté > 95 % globale, montrant une contamination minimale de segments tubulaires ou autres types de cellules (Figure 1A, B). En outre, les glomérules OCT incorporé peuvent être colorés à l’hématoxyline et éosine (H & E) taches de voir la morphologie (Figure 1C). Ces glomérules maintiennent leur structure dans tout le protocole entier, même après traitement. Nous démontrons que les glomérules isolés possèdent podocytes intact et viable (Figure 2A), les cellules mésangiales (Figure 2B) et les cellules endothéliales (Figure 2C).

Une fois isolés, les glomérules peuvent être exposés à des blessures chimiques connus pour simuler en vivo de pathologie. Dans ce cas, le sulfate de protamine (PS) a été choisi pour sa capacité à perturber la charge de la barrière de filtration glomérulaire, qui conduit finalement à l’effacement du processus des pieds. Glomérules imprégnées par le PS ont une diminution frappante néphrine (rouge) et un certain nombre de noyaux positifs pour WT1 (vert) par immunofluorescence (Figure 3A, B). Les glomérules peuvent également être préparés pour la microscopie électronique à transmission (Figure 3C). Échantillons de contrôle ont la morphologie normale podocyte et processus de pied tandis que les glomérules imprégnées par le PS ont effacement de processus de pied (Figure 3D), qui est un signe de dysfonctionnement podocyte et se voit dans des modèles in vivo utilisant PS21. Cela correspond aussi à une diminution de néphrine détecté par immunotransfert (Figure 3E, F).

Pour déterminer la viabilité, clivés caspase-3 a été évaluée comme un marqueur de l’apoptose. À l’aide d’immunofluorescence, clivés caspase-3 apparaît dans quelques cellules à partir de 2 h après l’isolement (Figure 4). Le nombre de cellules exprimant cette protéase devenue plus abondant au fil du temps, les plus hautes concentrations observées à 24 et 48 h. Ceci suggère que l’apoptosis produit-elle relativement tôt dans la culture et que les applications en aval doivent être effectuées rapidement après l’isolement pour de meilleurs résultats.

Figure 1 . Aspect typique des cultures glomérulaire de rat après isolement. (A) image de fond clair de culture glomérulaire. Nous avons choisi un domaine dans lequel il y a un seul tubule rénal dans cette micrographie (pointe de flèche), mais les cultures obtenues sont généralement > 95 % pur. Barre d’échelle est égale à 100 µm. (B) grande image d’un glomérule unique. (C) l’hématoxyline et éosine teinté d’un glomérule unique. Barres d’échelle B et C égale à 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 . Types de cellules constitutives sont conservés dans les glomérules isolés. La microscopie confocale immunofluorescence a été réalisée pour néphrine (rouge, podocytes) et des marqueurs spécifiques des cellules pour identifier les podocytes, cellules mésangiales et l’endothélium. (A) Costain néphrine et WT1 (vert, podocytes). (B) Costain néphrine et PDGFR-β (vert, les cellules mésangiales, flèche). (C) Costain néphrine et CD31 (cellules endothéliales, verts, des vases en coupe transversale, marquée par des pointes de flèche). Echelle = 25 µm sur tous les panneaux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 . Podocyte blessure peut être induit in vitro à l’aide de glomérules isolés de rat. (A) la microscopie confocale immunofluorescence pour néphrine et WT1 dans une culture glomérulaire non traitée. Notez le linéaire néphrine coloration (rouge) et la présence de noyaux positifs WT1 (vert) que l'on voit généralement lorsqu’il y a les podocytes sains. (B) après le traitement, néphrine expression de sulfate de protamine est réduite et non linéaires, et WT1 est absent, indiquant podocyte blessure. (C) Affichage image de Transmission électronique microscpy (TEM) pied processus, membrane basale et un endothélium fenêtré typique de structure glomérulaire normale. Bar équivaut à 500 nm. (D) après le sulfate de protamine, processus de pied sont allongés ou effacés (pointes de flèches), qui indique podocyte blessure. (E) Western blot pour néphrine montrant une diminution néphrine après traitement de sulfate de protamine. Actine (F) contrôle pour la tache occidentale de chargement est illustré. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 . Évaluation de la viabilité cellulaire dans les glomérules isolés. Microscopie confocale immunofluorescence pour clivées caspase-3 (vert) a été réalisée. Une tache de co néphrine a été réalisée pour localiser facilement les glomérules. Bien qu’il n’a aucune positivité clivée de caspase-3 à 0 et 1 h après l’isolement des glomérules, signal de fluorescence dans quelques cellules a été remarqué à 2 h. progressivement que plus de cellules devenue positive la plus longue après l’isolement qu’ils ont été examinés. Le plus grand nombre de caspase-3 cellules positives ont été observée à 24 et 48 h. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.