Saccharomyces cerevisiae Cinétique de croissance exponentielle en Culture pour analyser le métabolisme respiratoire et fermentatif

Summary

Nous présentons ici un protocole afin d’évaluer le métabolisme respiratoire et fermentatif en ajustant la croissance exponentielle des Saccharomyces cerevisiae à l’équation de croissance exponentielle. Calcul des paramètres cinétiques permet le dépistage des influences de substances/composés sur la fermentation ou la respiration mitochondriale.

Abstract

Cellules de Saccharomyces cerevisiae en phase exponentielle soutiennent leur croissance par la production d’ATP par fermentation ou la respiration mitochondriale. La concentration de carbone fermentescibles principalement régit la façon dont les cellules de levure génèrent de l’ATP ; ainsi, la variation des niveaux de glucides fermentescibles lecteurs le métabolisme énergétique de S. cerevisiae. Cet article décrit une méthode de haut débit basée sur la croissance exponentielle de levure pour estimer les effets des changements de concentration et la nature de la source de carbone sur le métabolisme respiratoire et fermentatif. La croissance de S. cerevisiae est mesurée dans une microplaque ou secouée conique fiole par la détermination de la densité optique (do) à 600 nm. Ensuite, une courbe de croissance est construite par traçage OD par rapport au temps, qui permet l’identification et la sélection de la phase exponentielle et est équipé de l’équation exponentielle pour obtenir des paramètres cinétiques. Les taux de croissance spécifique faible avec des temps de doublement supérieurs représentent généralement une croissance respiratoire. À l’inverse, des taux plus élevés de croissance spécifique avec des temps de doublement inférieurs indiquent une croissance fermentaire. Seuils de doubler le temps et le taux de croissance spécifique sont estimées à l’aide de conditions respiratoires ou fermentatives bien connues, telles que les sources de carbone non fermentescibles ou des concentrations plus élevées de sucres fermentescibles. Ceci est obtenu pour chaque souche spécifique. Enfin, les paramètres cinétiques calculées sont comparées avec les valeurs de seuil pour établir si la levure montre la croissance fermentaire et/ou respiratoire. L’avantage de cette méthode est sa relative simplicité pour comprendre les effets d’un substance/composé sur le métabolisme fermentaire ou respiratoire. Il est important de souligner que la croissance est un processus biologique complexe et complex ; par conséquent, les données préliminaires de cette méthode doivent être corroborées par la quantification de la consommation d’oxygène et l’accumulation des sous-produits de la fermentation. Ainsi, cette technique peut servir comme un examen préliminaire des composés/substances susceptibles de déranger ou améliorer le métabolisme fermentaire ou respiratoire.

Introduction

Croissance de Saccharomyces cerevisiae a été un outil précieux pour identifier des dizaines de mécanismes physiologiques et moléculaires. La croissance est mesurée principalement par trois méthodes : dilutions en série pour spot test, unité formant colonie comptant et courbes de croissance. Ces techniques peuvent servir seul ou en combinaison avec une variété de substrats, les conditions environnementales, des mutants et produits chimiques pour l’étude des réponses spécifiques ou phénotypes.

La respiration mitochondriale est un processus biologique dans lequel cinétique de croissance a été appliquée avec succès pour découvrir les m....

Protocol

1. milieux de Culture et de la préparation de l’Inoculum

1. Préparation de 100 mL de milieu liquide extrait-peptone-dextrose (DPJ) levure de 2 % (ajouter 1 g de levure extrait, 2 g de peptone de caséine, et 2 g de glucose pour 100 mL d’eau distillée). Diluer 3 mL des médias dans des tubes coniques stérilisable 15 mL. Autoclave les médias pendant 15 min à 121 ° C et 1,5 lb/po2.
   Remarque : Les médias peuvent être stockés pendant jusqu'à un mois, 4 – 8 ° c.
2. Ensemencer un tube conique rempli de 3 mL de bouillon de la DPJ 2 % stérile cool avec 250 μl de cellules de S. cerevisiae conservés en glycérol à-20 ° C. Incuber pendant la nuit dans un ag....

Results

Courbes de croissance peuvent être utilisés pour distinguer provisoirement respiratoires et fermentatives phénotypes dans la levure S. cerevisiae . Donc, nous avons effectué des cultures en batch de S. cerevisiae (BY4742) avec des concentrations de glucose différentes qui ont été signalées pour induire la croissance par fermentation : 1 %, 2 % et 10 % (p/v)⁹. Les cultures présentant un phénotype fermentatif ont une phase de latence faible et une p.......

Discussion

Beaucoup de temps s’est écoulé depuis J. Monod¹⁰ exprimé que l’étude de la croissance des cultures bactériennes est la méthode de base de la microbiologie. L’avènement des outils moléculaires retarde l’utilisation et l’étude de la croissance en tant que technique. Malgré la complexité de la croissance, ce qui implique de nombreux processus interdépendants, ses mécanismes sous-jacents peuvent être décrit en utilisant des modèles mathématiques¹¹. Il s’agit d’une approche soli.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agitateur orbital	Thermo Scientific	4353	Pour l’incubation d’inoculum ou les cultures en fût coniques
Bioscreen  ;	Courbes de croissance	C MBR	Pour les cultures discontinues en microplaques
Glucose	Sigma  ;	G7021	Pour la préparation du bouillon YPD
Peptone à partir de caséine, digest enzymatique	Sigma  ;	82303	Pour la préparation du bouillon YPD
Extrait de levure	Sigma  ;	09182-1KG-F	Pour la préparation du bouillon YPD
Gélose bactériologique	Sigma  ;	A5306	Pour la préparation de gélose YPD
NaH2PO4	Sigma  ;	S8282	Pour la préparation de bouillon SC
(NH4)2SO4	Sigma  ;	A4418	Pour la préparation de bouillons SC
Base d’azote de levure sans acides aminés et sulfate d’ammonium	Sigma  ;	Y1251	Pour la préparation du bouillon SC
Levure synthétique drop-Out medium suppléments	Sigma  ;	Y1501	Pour la préparation de bouillon SC
Sulfate d’ammonium granulaire	J.T. Baker	0792-R	Pour une supplémentation moyenne, exemple
Resvératrol	Sigma  ;	R5010	Pour une supplémentation moyenne, exemple
Galactose	Sigma  ;	G8270	Pour une supplémentation moyenne, exemple
Saccharose	Sigma  ;	S7903	Pour une supplémentation moyenne Exemple
Absolut éthanol	Merck	107017	Pour une supplémentation moyenne Exemple
Glycérol	J.T. Baker	2136-01	Pour une supplémentation moyenne
Exemple GraphPad Prism	GraphPad Logiciel		Pour l’analyse de données
Microplaques en nid d’abeille	Thermo Scientific	9502550	Pour les cultures de microplaques