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Article de méthode

Neutrophiles pièges extracellulaires générées par les neutrophiles faible densité obtient du liquide de Lavage péritonéal médiat attachement et la croissance des cellules tumorales

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DOI :

10.3791/58201

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3 août 2018

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1Department of Gastrointestinal Surgery, Jichi Medical University

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici une méthode dans laquelle neutrophiles humains de faible densités (LDN), récupérés du liquide de lavage péritonéal postopératoire, produisent massives pièges extracellulaires neutrophiles (filets) et efficacement emprisonnent quelques cellules tumorales gratuit qui poussent par la suite.

Résumé

Activé des neutrophiles libération neutrophiles extracellulaire pièges (filets), qui peuvent capturer et détruire les microbes. Des études récentes suggèrent que les filets sont impliqués dans divers processus morbides, comme auto-immunes métastases maladie, thrombose et la tumeur. Ici, nous montrons une technique détaillée in vitro pour détecter les activités NET durant le piégeage des cellules tumorales libre, ce qui poussent après fixation de filets. Tout d’abord, nous avons recueilli des neutrophiles faible densité (LDN) du liquide de lavage péritonéal postopératoire des patients qui ont subi les laparotomies. Culture à court terme de la LDN a entraîné formation nette massive qui a été visualisée avec nucléaire vert fluorescent et contre-colorant chromosome. Après incubation Co de lignées cellulaires de cancer de l’estomac humain MKN45, IC-1 et NUGC-4 avec les filets, nombreuses cellules tumorales ont été piégés par les filets. Par la suite, la pièce jointe a été complètement abrogée par la dégradation des filets avec la DNase I. décomposée vidéo a révélé que les cellules tumorales, pris au piège par les NETs ne sont pas mort mais a grandi au contraire vigoureusement dans une culture continue. Ces méthodes peuvent être appliquées à la détection des interactions adhésives entre les filets et les différents types de cellules et de matériaux.

Introduction

Neutrophiles nucléaires polymorphe dans le sang circulant sont généralement séparés de cellules mononucléaires via la méthode de préparation de gradient de densité. Toutefois, certains neutrophiles appelés neutrophiles faible densités (LDN), avec des phénotypes CD11b(+), CD15(+), CD16(+) et CD14(-), sont conjointement purifiées avec des cellules mononucléaires. Le nombre relatif de LDN augmente de manière significative dans diverses conditions pathologiques, y compris les maladies auto-immunes1,2, septicémie3et cancer4,5. Des études antérieures ont montré que LDN constituent une classe phénotypiquement et fonctionnellement distincte de neutrophiles6. Il est à noter que LDN dans le sang circulant sont plus susceptibles de produire des pièges extracellulaires neutrophiles (filets) que la densité normale neutrophiles2,7. Les filets sont des structures de toile d’araignée composés d’acides nucléiques, histones, protéases et protéines granulaires et cytosoliques, et ils peuvent efficacement piéger et détruire les agents pathogènes8.

Récemment, les filets ont démontré pour capturer non seulement les microbes, mais aussi les plaquettes et circulation de cellules tumorales qui peuvent aider à thrombus formation9 et tumeur métastases10,11. Cependant, les mécanismes moléculaires interactions adhésives entre les filets et les plaquettes ou les cellules tumorales sont encore peu claires. Plus récemment, un essai d’adhérence in vitro ont révélé que les cellules de la leucémie myéloïde (K56212) et de cellules de carcinome du poumon (A54913) attachent à filets via les intégrines β1 et β3. Les auteurs ont utilisé le stock NET isolés des neutrophiles et activé par phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) comme l’adhérence substrat14. Bien que ce test permet de détecter des interactions réelles avec composantes nettes en l’absence des neutrophiles, on peut affirmer si la « acellulaire stock NET » isolé par centrifugation à haute vitesse est toujours la structure moléculaire identique à filets produits dans vivo. Récemment, nous avons trouvé ce liquide de lavage péritonéal après que chirurgie abdominale contenait de nombreux LDN mature, qui généré des filets massives et attachés aux cellules tumorales causant des métastases péritonéales,15. Dans cette étude, nous avons examiné avec succès l’adhérence des cellules tumorales aux filets intacts sans aucune manipulation physique. Ici, nous montrons les détails d’une technique pour détecter des interactions adhésives entre les filets et les cellules tumorales gratuit.

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Protocole

LDN provenaient de patients recrutés pour cette étude et ont été approuvées par les institutionnels Review Board de Jichi Medical University.

1. isolement de la LDN de Lavages de la cavité abdominale et détection NET

  1. Acquisition de l’échantillon
    1. Infuser 1 000 mL de sérum physiologique stérile directement dans la cavité abdominale avant de refermer les plaies chez les patients ayant subi une chirurgie abdominale due à une tumeur maligne gastro-intestinale.
      NOTE : Échantillons provenaient de patients qui ont subi une gastrectomie, une colectomie ou OESOPHAGECTOMIE sans préjugé fondé sur l’âge ou le sexe. Une solution saline a été transférée dans un récipient et versée dans l’abdomen entier dans la minute. Ceci est habituellement exécuté comme un lavage péritonéal postopératoire sans effets significatifs sur les patients.
    2. Lavage de la cavité abdominale durant au moins 1 minute.
      Remarque : Il est recommandé que le liquide perfusé est agité doucement avec les mains du chirurgien afin que les échantillons soient uniformes.
    3. Récupérer 200 mL de liquide de lavage avec quatre seringues de 50 mL.
      NOTE : Parfois un raccord en caoutchouc est utilisé pour absorber les liquides.
  2. Accomplissent la purification du LDN péritonéale à l’aide de granulocytes spécifiques mAb, CD66b16.
    Remarque : Étant donné que la couche intermédiaire après centrifugation en gradient de densité contient beaucoup de cellules mononucléées, sélection positive des neutrophiles polymorphe à l’aide de CD66b mAb a été réalisée.
    1. Transférer le liquide de lavage péritonéal dans un tube de 50 mL.
      Remarque : Dans cette étape, passer les fluides par un filtre de nylon 100 µm pour éliminer les impuretés.
    2. Centrifuger le liquide péritonéal à 270 g pendant 7 min à température ambiante.
    3. Remettre en suspension les pellets dans 5 mL de PBS avec EDTA de 0,02 %.
    4. Soigneusement superposer les 5 mL de suspension cellulaire sur une solution de gradient de densité 3 mL.
    5. Centrifuger à 1 700 x g pendant 15 min à ta sans les pauses.
    6. Récolter le ~ 2-3 mL de solution contenant les couches intermédiaires (Figure 1 a) à l’aide d’une pipette et mélangez-le avec 10 mL de PBS avec EDTA de 0,02 %.
    7. Centrifuger le liquide péritonéal à 400 g pendant 7 min à ta et éliminer le surnageant.
    8. Ajouter un autre 10 mL de PBS avec 0,02 % EDTA et centrifuger à 270 x g pendant 7 min à RT. jeter le surnageant.
    9. Dissoudre le culot cellulaire (1 × 10-7) en 60 µL de tampon pour le kit de séparation cellule magnétique.
    10. Ajouter 20 µL du bloc Fc dans les granules et incuber pendant 10 min à 4 ° C.
    11. Ajouter 20 µL de l’anti-CD66b conjugué avec microbilles et incuber pendant une supplémentaire de 10 min à 4 ° C.
    12. Laver et remettre en suspension les pellets dans 500 µL de tampon de MACS.
    13. Appliquer la suspension cellulaire à une colonne magnétique du champ magnétique d’un séparateur magnétique approprié et de recueillir les intermédiaires contenant CD66b(-) des cellules de la colonne avec 15 mL de tampon de lavage.
    14. Retirer la colonne du séparateur magnétique et rincer immédiatement les cellules CD66b(+) magnétiquement étiquetées en appuyant fermement sur le piston dans la colonne.
      Remarque : La population de cellules CD66b(+) se compose principalement des neutrophiles, tel que déterminé par analyse de FACS indiquant que > 95 % de la fraction CD66(+) sont positives pour CD11b CD15 et CD16, mais négatives pour CD14.
  3. Génération des filets
    1. Après centrifugation à 270 g pendant 7 min à ta, remettre en suspension la LDN isolée (5 x 106) dans 1 mL de RPMI1640 avec 10 % FCS.
    2. Culture de la LDN sur une plaque enduite de 6 puits poly-L-lysine (6 cm de diamètre) pendant 2 h à 37 ° c à 5 % de CO2.
    3. Ajouter le contre-colorant fluorescent vert (un membrane imperméable au colorant pour colorer le noyau et les chromosomes) à la concentration finale de 5 µM.
    4. Immédiatement, observer la morphologie des filets (les composantes ADN extracellulaires expulsés de la LDN en microscopie de fluorescence).

2. la coloration des cellules tumorales avec cellule fluorescente rouge Linker Dye

  1. Préparer le cancer chez l’humain des lignées de cellules MKN45, NUGC et IC-1.
  2. Laver 1 x 107 cellules avec PBS + 0,02 % et d’EDTA dans un tube de 15 mL et centrifuger à 270 x g pendant 7 min à température ambiante.
  3. Ajouter 1 mL de solution de colorant, coloration pour les pellets et Pipeter doucement.
  4. Dissoudre 4 µL de colorant rouge Fluorescent cellule Linker dans 1 mL de solution de coloration et mélanger avec la suspension de cellules de l’étape 2.2.
  5. Incuber les boulettes pendant 4 min à température ambiante.
  6. Ajouter 4 mL de DMEM (10 % FBS) pour arrêter la réaction de coloration.
  7. Centrifuger 270 x g pendant 7 min et éliminer le surnageant.
  8. Répétez les étapes 2.6 et 2.7 deux fois.
  9. Vérifier avec un microscope à fluorescence (excitation = 551 nm, émettant = 567 nm) que les cellules tumorales sont colorés de rouge.

3. analyse de l’adhésion cellulaire tumorale aux filets

  1. Remettre en suspension les cellules de tumeur tachée fluorescent rouge (1 x 10-6) dans 1 mL de milieu RPMI 1640 additionné de 0,1 % de BSA.
  2. Ajouter les cellules tumorales à la culture de la LDN qui produit les filets tel que décrit à l’étape 1.3.
  3. Incuber pendant 5 min à 37 ° c, ce qui permet aux cellules tumorales de contacter les filets.
    Remarque : D’incubation longue induit adhérence de cellules tumorales à LDN ou aux plaques.
  4. Enlever le support et laver délicatement les puits en ajoutant 2 mL de médias préchauffée (0,1 % de BSA + RPMI 1640) et en agitant le plat.
  5. Répéter la procédure de nettoyage à l’étape 3.4 deux fois.
    NOTE : Depuis les filets faiblement fixer sur la plaque, le lavage se fasse aussi doucement que possible pour éviter la suppression des filets eux-mêmes.
  6. Ajouter le colorant fluorescent vert pour colorer le noyau et les chromosomes à une concentration finale de 5 µg/mL pour la visualisation des filets.
  7. Observer les filets et attaché en utilisant les filtres appropriés des cellules tumorales (verte, excitation = 504 nm, émettant = 523 nm ; rouge, excitation = 551 nm, émettant = 567 nm).
  8. Fusionner les chiffres pour montrer les cellules tumorales qui sont piégés par les filets.
    NOTE : Dans certaines expériences, enzyme de dégradation de l’ADN a été ajoutée à la culture de la LDN (concentration finale de 100 U/mL) 5 min avant incubation co pendant 5 min.

4. time Lapse analyse vidéo des cellules tumorales piégés

  1. Culture la LDN péritonéale dans un 35 mm rond plat recouvert de poly-L-lysine, tel que décrit à l’étape 1.3.
  2. Ajouter le colorant fluorescent vert pour colorer le noyau et les chromosomes de visualiser les filets tel que décrit à l’étape 1.3.
  3. Après 1 min d’incubation, retirez le support et ajouter 2 mL de 0,1 % de BSA + RPMI 1640.
  4. Retirez le support et ajouter sans coloration 1 x 106 MKN45 cellules en suspension dans 0,1 % BSA + RPMI 1640. Incuber 5 min à température ambiante.
  5. Supprimez toutes les cellules tumorales seules en lavant doucement comme indiqué au point 3.4 et DMEM avec 10 % de FCS additionné de 100 u/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine.
  6. Monter la boîte de Petri dans un système d’observation de vue ensemble cellule, puis sélectionnez le champ approprié dans les tumeurs des cellules sont pris au piège par les filets.
  7. Continuer de co-culture pendant encore 2 jours et prendre des photos continues du champ toutes les 6 minutes sous une lumière normale et la fluorescence, qui permet de détecter les cellules MKN45 et filets, respectivement.
  8. Superposer les images à chaque validant et construire des vidéos time-lapse utilisant le logiciel Image Viewer.

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Résultats

Dans la culture de 2 heures, LDN CD66b(+) dérivées de structures fluide chaîne montraient lavage péritonéal teinté avec un colorant fluorescent vert pour nucléaire et chromosome (Figure 1 b), tout en CD66b(-) les cellules mononucléaires n’ont pas (Figure 1). Toutefois, lorsque les cultures LDN prétraités avec 100 U/mL DNase I, la structure a été détruite (Figure 1), indiquant qu’ils étaient composés ...

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Discussion

Des études antérieures ont signalé que les cellules tumorales circulantes peut être piégé par des substrats NET en vivo10,,11. Les cellules de cancer du sein métastatique ont été démontrés pour stimuler des neutrophiles et induisent la formation des filets, qui contribue à la croissance des cellules tumorales dans les organes de cible17. En outre, nous avons constaté que les cultures à court terme de LDN de liquide de lavage posto...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

Nous remercions Mme J. Shinohara et I. Steve de travail technique et clérical. Aussi, nous remercions les Drs Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina et Kazuya Takahashi pour leur coopération pour acquisition d’échantillon en salle d’opération. Ce travail a été soutenu par une subvention pour la recherche scientifique du ministère de l’éducation, Science, Sports et Culture du Japon et la société japonaise pour la Promotion de la Science (17K 10606).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare, SUÈDE17-1440-02
DirectFrom&trade ; Microbilles de sang total CD66bMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne130-104-913
Bloc FcMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne130-059-901
Solution de rinçage MACSMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne130-091-222
Solution mère MACS BSAMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne130-091-376
LS ColumnsMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne130-041-306
Séparateur magnétique MACSMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne130-042-501
SYTOX colorant d’acide nucléique vert 5mM solution dans DMSOThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAS7020
PKH26 Kit de liaison cellulaire fluorescente rouge pour le marquage général de la membrane cellulaireSigma-Aldrich, St Louis, MO, États-UnisP9691
Diluant CSigma-Aldrich, St Louis, MO, États-UnisCGLDIL RPMI1640
MediumSigma-Aldrich, St Louis, MO, États-UnisR8758
Dulbecco' s Eagle modifié à glucose moyen-élevé (DMEM)Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USAD5796
Dulbecco' s Solution saline tamponnée au phosphate (DPBS)Sigma-Aldrich, St Louis, MO, États-UnisD8537
0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0)nacalai tesque, Japon06894-14
Sérum de veau fœtal, qualifié, régions approuvées par l’USDAgibco by life technologies, Mexique10437-028
Poudre lyophilisée d’albumine sérique bovine, &ge ; 96 % (électrophorèse sur gel d’agarose)Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USAA2153
Pénicilline StreptomycineLife Technologies Japon15140-122
Plasmocin ProphylactiqueInvivoGen, San Diego, CA-USAant-mpp
DNase IWorthington, Lakewood NJ)LS002138
MICROPLAQUE enrobée de poly-L-Lysine 6WellIWAKI, Japon4810-040
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24WellIWAKI, Japon4820-040
Stéréomicroscope à fluorescéineBX8000, Keyence, Osaka JaponBZ-X710
Système d’observation de cellules à vue d’ensembleNikon, Kanagawa, JaponBioStudio (BS-M10)
MKN45 lignée cellulaire de cancer gastrique humainRiken, Tukuba JaponN/A
Lignée cellulaire de cancer gastrique humain NUGC-4Riken, Tukuba JaponN/A
OCUM-1 Lignée cellulaire de cancer gastrique humainUniversité de la ville d’Osaka, JaponN/ADon du Dr M.Yashiro

Références

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Réimpressions et autorisations

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