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Article de méthode

Synthèse et caractérisation de placentaire chondroïtine Sulfate un (plCSA) - ciblage lipide - des nanoparticules polymériques

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DOI :

10.3791/58209

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18 septembre 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory for Reproductive Health, Institute of Biomedicine and Biotechnology, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences (CAS), 2Guangdong Key Laboratory of Nanomedicine, CAS Key Lab for Health Informatics, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences (CAS), 3Department of Chemistry, Guangdong Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour la synthèse de peptide de liaison placentaire chondroïtine sulfate A (plCSA-BP)-conjugués de lipide-polymère nanoparticules via seule étape sonication et bioconjugate techniques. Ces particules constituent un nouvel outil pour l’administration ciblée d’agents thérapeutiques tumeurs plus humaines et les trophoblastes placentaires pour traiter des cancers et des troubles placentaires.

Résumé

Une méthode thérapeutique efficace cancer réduit et élimine les tumeurs avec une toxicité systémique minimale. NANOPARTICULES activement ciblage offrent une approche prometteuse pour le traitement du cancer. Le sulfate de chondroïtine placentaire glycosaminoglycan un (plCSA) s’exprime sur une large gamme de cellules cancéreuses trophoblastes placentaires et protéine malarique VAR2CSA peut se lier spécifiquement à plCSA. Un peptide de liaison déclarés placentaire chondroïtine sulfate A (plCSA-BP), dérivé de protéine malarique VAR2CSA, pouvez également spécifiquement lier à plCSA sur les cellules cancéreuses et les trophoblastes placentaires. C’est pourquoi, plCSA-BP-conjugués de nanoparticules pourraient servir un outil pour la livraison de médicaments ciblés aux cancers humains et trophoblastes placentaires. Dans le présent protocole, on décrit une méthode pour faire la synthèse des nanoparticules de plCSA-BP-conjugué lipide-polymère chargés avec la doxorubicine (plCSA-DNPs) ; la méthode consiste à une sonication seule étape et bioconjugate techniques. En outre, plusieurs méthodes pour caractériser plCSA-DNPs, y compris la détermination de leurs propriétés physico-chimiques et la capture cellulaire de cellules de choriocarcinome placentaire (JEG3), sont décrites.

Introduction

Une méthode thérapeutique efficace cancer réduit et élimine les tumeurs avec une toxicité systémique minimale. Par conséquent, ciblage tumoral sélective est la clé à l’exploration de méthodes thérapeutiques efficaces. NANOPARTICULES offrent une opportunité prometteuse pour le traitement du cancer et des assemblages moléculaires avec différents groupes fonctionnels améliorera l’efficacité du médicament et réduire des effets secondaires associés1,2. En outre, des systèmes de nanoparticules utilisent principalement passives et actives visant à atteindre la cible des tumeurs3.

Ciblage passive exploite les caractéristiques innées des nanoparticules et perméabilité améliorée et des effets de rétention (EPR) pour atteindre les cellules tumorales. Les liposomes cationiques ont été utilisés avec succès pour libérer des médicaments anticancéreux diverses tumeurs dans des applications cliniques4,5,6. Malgré l’effet thérapeutique potentiel de cancer efficace, une concentration faible de drogue dans la région de la tumeur et une incapacité à distinguer les cellules tumorales des tissus normaux sont les deux principales limites de nanoparticules de ciblage passif7.

Les stratégies de ciblage actifs Profitez d’antigène-anticorps, ligand-récepteur et autres interactions de reconnaissance moléculaire à libérer spécifiquement des médicaments tumeurs8. Le sulfate de chondroïtine placentaire glycosaminoglycan un (plCSA) est largement exprimé sur la plupart des cellules cancéreuses et des trophoblastes placentaires. En outre, la protéine malarique VAR2CSA pouvez spécifiquement lier à plCSA9,10. Par conséquent, VAR2CSA peut être un outil pour cibler les cellules cancéreuses humaines. Cependant, lorsque VAR2CSA est conjugué aux nanoparticules, la protéine pleine longueur peut-être limiter la pénétration des nanoparticules dans les cellules tumorales. Récemment, nous avons découvert un peptide de la liaison plCSA (plCSA-BP), dérivé de la protéine malarique VAR2CSA. plCSA-BP-conjugué lipide-polymère nanoparticules rapidement collé sur choriocarcinome cellules et une augmentation significative de doxorubicine (DOX) activité anticancéreuse in vivo11; ces particules aussi spécifiquement lié à trophoblastes placentaires et pourraient servir d’outil pour l’administration ciblée des médicaments au placenta12.

NANOPARTICULES lipidiques-polymère sont constitués d’une enveloppe de monocouche de lipides et un noyau de polymère hydrophobe et représentent un nouveau transporteur pour la livraison de drogue. Ces nanoparticules combinent les avantages des liposomes et nanocarriers polymères, tels que les nanoparticules contrôlables taille haute biocompatibilité, libération du médicament soutenue, drogue haute chargement (LE) et l’efficacité excellente stabilité13. Dans ce travail, nous avons utilisé une méthode seule étape sonication à synthétiser des nanoparticules lipidiques-polymère. Cette méthode est rapide, pratique et adapté pour l’intensification et a été largement utilisée pour préparer des nanoparticules lipidiques-polymère par notre groupe de11,14 et d’autres15,16,17,18 .

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) chlorhydrate de carbodiimide (EDC) est un populaire carbodiimide, utilisé comme un agent de réticulation pour la conjugaison des biomolécules contenant des amines et carboxylates19. En plus de l’EDC, N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) est le plus commun réactif de conjugaison en surface et nanoparticules conjugaison réactions20,21. NHS peut réduire le nombre de réactions secondaires et améliorer la stabilité et le rendement d’ester INTERMEDIAIRES22,23.

Nous décrivons ici un protocole pour la synthèse de nanoparticules lipidiques-polymère plCSA ciblées. Tout d’abord, la synthèse de la seule étape sonication de nanoparticules lipidiques-polymère DOX-chargé (DNPs) est décrite. Ensuite, une technique de bioconjugate EDC/NHS pour générer des nanoparticules de polymère lipidique plCSA-BP-conjugué est introduite. Cette technique de bioconjugate permet aussi de conjuguer les autres anticorps et les peptides aux nanoparticules. Enfin, nous décrivons le dosage physico-chimiques, propriétés et in vitro , utilisé pour caractériser des nanoparticules lipidiques-polymère plCSA ciblées. Nous croyons que ces nanoparticules lipidiques-polymère plCSA ciblées pourraient constituer un système efficace pour l’administration ciblée des médicaments à des cancers plus humains et de l’administration ciblée de charges utiles pour le placenta pour traiter les troubles placentaires.

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Protocole

1. préparation des Solutions mères

  1. Préparer une solution aqueuse d’éthanol de 4 % en diluant avec 4 mL d’éthanol absolu avec 100 mL d’eau ultrapure. Conserver la solution à 4 ° C.
    NOTE : L’eau Ultrapure est définie comme l’eau sans contaminants tels que des bactéries, des particules, des ions ou des nucléases. Eau ultrapure provient d’un système de purification de l’eau avec une résistivité de cible de jusqu'à 18,2 mΩ·cm, qui signifie faible contamination anionique.
  2. Préparer un 1 mg/mL de solution mère de lécithine de soja en dissolvant 20 mg de lécithine de soja dans 20 mL de la solution aqueuse d’éthanol de 4 %. Stocker la solution mère de lécithine de soja à 4 ° C.
  3. Préparer un 25 mg/mL DSPE-PEG (2000)-COOH solution en dissolvant 100 mg de DSPE-PEG-COOH dans 4 mL de la solution aqueuse d’éthanol de 4 %. Conserver la solution stock à-20 ° C.
  4. Préparer un 10 mg/mL solution DOX en dissolvant 50 mg de DOX dans 5 mL d’eau ultrapure. Stocker la solution mère de DOX à 4 ° C dans l’obscurité.
  5. Préparer un 2 mg/mL solution PLGA dissoudre 20 mg de PLGA dans 10 mL d’acétonitrile. Stocker la solution mère de PLGA à 4 ° C.
    ATTENTION : L’acétonitrile est inflammable et toxique. Fonctionnent avec soin dans une hotte de laboratoire et porter un vêtement approprié, tels que sarraus de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants en latex.
  6. Préparer une solution 0,1 M 2-(morpholino) ethanesulfonic acide (MES, pH 6,0) mère en dissolvant 2,17 g de MES dans 100 mL d’eau ultrapure. Stocker la solution-mère à 4 ° C.

2. synthèse du DNPs

Remarque : Pour éviter une dégradation photochimique DOX, toutes les opérations ont été effectuées dans l’obscurité.
NANOPARTICULES ont été synthétisés par une seule étape a déjà été indiqué la sonication méthode11,13,14.

  1. Ajouter 3 mL de la solution aqueuse d’éthanol de 4 % dans un tube à centrifuger stérile de 10 mL. Puis, ajoutez 90 µg de la solution mère de lécithine de soja, 210 µg de la solution mère DSPE-PEG-COOH et 750 µg de la solution mère de DOX à 3 mL de la solution aqueuse d’éthanol de 4 %.
  2. Placer le tube à centrifuger dans un bain de glace et placez le bain de glace sur un processeur à ultrasons.
  3. Avec une seringue de 1 mL, pipette 2 mg de la solution mère de PLGA goutte à goutte (1 goutte/4-6 s) dans le tube à centrifuger. Pendant ce temps, laisser agir le tube à l’aide d’un processeur à ultrasons à une fréquence de 20 kHz et une amplitude de sortie de 30 % pendant 5 min pour synthétiser le DNPs.
    Remarque : Pour faire la synthèse des particules uniformes avec petites tailles, la vitesse à laquelle la solution PLGA est coulait dans le tube doit être lent et bulle génération devrait être évitée.
  4. Purifier le DNPs en lavant la solution ci-dessus dans un tampon MES 0,1 M (pH 6.0) 3 fois en utilisant un filtre de la centrifugeuse (MWCO, 10 kDa). Centrifuger à 4 ° C et 1000 × g pendant 3 minutes chaque fois. Enfin, environ 1 mL de nanoparticules-résolu MES doit rester.
    NOTE : Ceci est un point d’arrêt acceptable dans la procédure. Dans le cas contraire permettant de conjuguer les peptides, les nanoparticules peuvent être épurées par tampon PBS (pH 7,4), et le DNPs purifié peuvent être stocké à 4° C dans l’obscurité.

3. conjugaison des Peptides à DNPs

  1. Activation de l’ester
    1. Ajouter 0,4 mg d’EDC (concentration finale de 2 mM) à 1 mL de DNPs.
    2. Ajouter 0,24 mg de NHS à la réaction (concentration finale de 2 mM).
      Remarque : Pour ajouter facilement de la quantité correcte d’EDC et le NHS, une solution peut être préparée si les réactifs sont dissous et utilisés immédiatement.
    3. Bien mélanger les composants de la réaction et placer la réaction sur un agitateur ; laisser la réaction pour 30 min - 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
  2. Réaction amine
    1. Augmenter le tampon pH de 7,2 à 7,5 en utilisant PBS (20 ×, pH 7,4).
    2. Ajouter 0,5 mg du peptide ciblage plCSA (plCSA-BP, EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC) à la solution de la réaction.
      Remarque : Avant d’ajouter, dissoudre les peptides dans 20 % d’acétonitrile. Si les peptides ne sont pas solubles, sonication dans un sonicateur bain peut utile.
    3. Bien mélanger la solution et puis placer sur un agitateur ; permettre la réaction de procéder à 4 ° C durant la nuit dans l’obscurité.
    4. Placer la solution de conjugué dans des sacs de dialyse (MWCO, 3 500 Da) pour dialyser et purifier le plCSA-DNPs à l’aide de la solution tampon PBS (pH 7,4) à température ambiante pendant 24 h dans l’obscurité.
      Remarque : Vous pouvez également purification peut être effectuée qu’à l’étape 2.4 pour obtenir plCSA-DNPs.
    5. Pour les applications de culture cellulaire, filtrer la solution reconstituée à travers un filtre de seringue stérile de 0,22 µm pour éliminer les éventuelles précipités.

4. caractérisation des lipides plCSA ciblées-nanoparticules polymériques

  1. Mesure de la taille de la NANOPARTICULE hydrodynamique à l’aide de diffusion dynamique de la lumière (DLS)
    1. NANOPARTICULES diluées avec de l’eau ultrapure (dilution 50 fois). Charger 500 µL de l’échantillon dans une cuvette conformément aux instructions de l’instrument potentiel DLS ou zeta.
      NOTE : Potentiel zêta et cuvettes de listes de distribution peuvent différer selon les spécifications de l’instrument.
    2. Une fois la mesure terminée, enregistrez le diamètre des particules, l’indice de polydispersité (PDI) et la potentiel zêta. Moyenne des résultats obtenus à partir de 4 répètent lectures et calculent l’écart.
  2. Microscopie électronique à transmission (TEM)
    Remarque : La morphologie des nanoparticules a été observée par TEM avec la méthode de coloration négative. 24
    1. NANOPARTICULES diluées avec de l’eau ultrapure (400-fold dilution). Ajouter 20 µL de l’échantillon sur une grille TEM et laisser pour reposer pendant 5 min.
    2. Ajouter 100 µL de 2 % (p/v) d’acide phosphotungstique et laisser pour reposer pendant 2 min. mèche à la goutte.
    3. Sécher la grille TEM à température ambiante.
    4. Régler la tension d’accélération de TEM à 80 kV et agrandir l’image à 100 000 × pour visualiser les nanoparticules.
  3. Détermination de l’efficacité de l’encapsulation (EE) et LE
    1. Génération de la courbe d’étalonnage. Dissoudre DOX dans eau ultrapure pour préparer une DOX cinq concentrations différentes : 1 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL, 50 µg/mL et 100 µg/mL. Mesurer l’absorption des solutions DOX à 480 nm avec un spectromètre UV-visible. Générer une courbe standard basée sur les concentrations de DOX.
    2. Diluer 25 µL de nanoparticules avec 500 µL d’eau ultrapure. Mesurer l’absorption à 480 nm avec un spectromètre UV-visible. Calculer les concentrations du médicament par la courbe d’étalonnage.
    3. Calculer le lé à l’aide de l’équation suivante :
      LE = ((quantité de drogues dans les nanoparticules) / (poids total des matériaux)) × 100 %.
    4. Calculer la EE selon l’équation suivante :
      EE = ((quantité de drogues dans les nanoparticules) / (quantité de drogue a ajouté)) × 100 %.
  4. Mesure de l’efficacité de conjugaison bicinchoninic acide (BCA) essai sur 25 , 26 , 27
    1. Pipetter 25 µL des solutions de peptide standard (tableau 1) ou plCSA-DNPs dans les puits en double exemplaire. Ajouter 200 µL de réactif au travail à chaque puits et mélanger la plaque bien sur un agitateur de plaque pendant 30 s.
    2. La plaque de recouvrement et incuber à 37 ° C pendant 30 min.
    3. Mesurer l’absorbance à 562 nm sur un lecteur de plaque. Utiliser la courbe d’étalonnage générée pour calculer les concentrations de plCSA de plCSA-DNPs.
    4. Calculer l’efficacité de la conjugaison à l’aide de l’équation suivante :
      Efficacité de conjugaison = ((quantité de peptide à nanoparticules) / (quantité d’ajouté peptide)) × 100 %.
FlaconVolume de diluant (μL)Volume et source de peptide (μL)Concentration finale de peptide (μg/mL)
A0300 sur Stock1000
B250250 du flacon une dilution500
C250250 de dilution du flacon B250
D250250 de dilution flacon C125
E300200 de dilution flacon D50
F250250 de dilution flacon E25
G400100 de dilution flacon F5
H50000

Le tableau 1. Préparation de peptides Standard

5. fluorescence Microscopy évaluation d’absorption de nanoparticules plCSA ciblées dans les cellules de choriocarcinome (JEG3)

  1. Graines de cellules sur des plaques de 12 puits stériles à 1,0 × 104 cellules/puits avec DMEM complet/F12 (cDMEM/F12, contenant de le 1 % pénicilline/streptomycine et 10 % de sérum foetal de bovin (FBS)). Laissez les cellules à confluence de 60 % à 37 ° C et 5 % de CO2 dans des conditions humides.
  2. Retirez le support et ajouter 1 mL de froids supports neufs avec une teneur sérique (5 % FBS) et DNPs ou plCSA-DNPs (5 µg d’équivalent-DOX).
  3. Incuber le mélange des cellules et des nanoparticules à 4 ° C pendant 1 h.
  4. Après incubation, retirez le support et laver les cellules trois fois avec du PBS. Ensuite, ajouter 1 mL de frais cDMEM/F12 et incuber les cellules à 37 ° C pendant 30 min.
  5. Enlever le cDMEM/F12 et laver les cellules trois fois avec du PBS.
  6. Ajouter 2 mL de paraformaldéhyde froide de 4 % (PFA) et incuber à température ambiante pendant 15 min fixer les cellules.
  7. Retirez la PFA. Laver les cellules avec 2 mL de PBS une fois. Ajouter 1 mL de PBS contenant DAPI (1 µg/mL) pour la coloration, les noyaux et incuber à température ambiante pendant 10 min.
  8. Aspirer le PBS et laver les cellules trois fois avec du PBS.
  9. Ajouter le milieu de montage et l’image de la fluorescence avec une microscopie de fluorescence, utilisant des canaux vert et bleu pour visualiser les DOX et les noyaux, respectivement.

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Résultats

Dans ce protocole, PLGA, DSPE-PEG-COOH et soja lécithine sont un polymère représentatif, conjugué de lipide-PEG-COOH et de lipides, respectivement. La synthèse de nanoparticules par une seule étape méthode sonication de polymère lipidique plCSA ciblées et une technique d’EDC/NHS est illustrée à la Figure 1. Tout d’abord, dans des conditions de la sonication, lécithine de soya, PLGA et DSPE-PEG-COOH s’auto-assembler à forme coeur-écorce structuré DNPs...

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Discussion

Ce protocole fournit une méthode efficace et reproductible pour la synthèse de nanoparticules de polymère lipidique plCSA-BP-conjugués. La méthode de sonication seule étape pour préparer les nanoparticules lipidiques-polymère est rapide, reproductible et différente des méthodes nanoprécipitation typique qui impliquent chauffage, Vortex ou évaporation. Par conséquent, la méthode développée réduit considérablement le temps de la synthèse. En outre, l’EDC/NHS bioconjugate utilisé dans le présent protocole est une technique ...

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Déclarations de divulgation

X.F. et B.Z. sont les inventeurs sur le brevet PCT/CN2017/108646 et 201710906587.6 présenté par SIAT qui couvre une méthode de synthèse de nanoparticules plCSA ciblée et de la demande. Aucun conflit d’intérêts potentiel ont été divulgués par les autres auteurs.

Remerciements

Ce travail a été soutenu grâce à des subventions de la clé National de recherche et programme de développement de Chine (2016YFC1000402), la Fondation nationale des Sciences naturelles (81571445 et 81771617) et la Fondation sciences naturelles de la Province de Guangdong (2016A030313178) à X.F. et le Fonds de recherche de Shenzhen Basic (JCYJ20170413165233512) à X.F.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
plCSA peptideShanghai GL Biochem573518pour la synthèse de peptides
Absolu d’éthanolSinopharm 10009218 chimiquepour la synthèse de nanoparticules
Lécithine de sojaAvanti Polar Lipids441601pour la synthèse de nanoparticules
DSPE-PEG-COOHAvanti Polar Lipids880125pour la synthèse
de nanoparticulesDoxorubicineJKChemical113424pour la synthèse de nanoparticules
AcétonitrileShanghai Lingfeng1008621pour la synthèse de nanoparticules
PLGASigma-Aldrich719897pour la synthèse de nanoparticules
Processeur à ultrasonsSonicsVCX130pour la synthèse de nanoparticules
Filtre centrifuge (MWCO 10 kDa)MilliporeUFC801024pour la centrifugeuse de purification de nanoparticules
Sigma3-18KSpour la purification de nanoparticules
Acide 2-[morpholino]éthanesulfonique (MES)Sigma-AldrichM3671pour la conjugaison peptidique
1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) chlorhydrate de carbodiimide (EDC)Sigma-Aldrich3450pour la conjugaison peptidique
N-hydroxysuccinimide (NHS)Sigma-Aldrich56480pour la conjugaison peptidique Sacs
dialyseSpectrum132592Tpour la purification des nanoparticules
PBSHycloneSH30028.01pour la culture cellulaire
Tubes à centrifuger de 10 mL, polypropylèneAladdinS-025pour la synthèse de nanoparticules
Tubes à centrifuger de 15 mL, polypropylèneCorning430791pour diverses applications
0,22 &mu ; Filtre à seringue stérileMilliporeSLGV033RBpour la purification des nanoparticules
Seringue de 1 ml, polypropylèneBD328421pour la synthèse des nanoparticules
Malvern ZetasizerMalvernNano ZSpour l’analyseur granulométrique
phosphotungstiquepour
TEM Grille TEMEMCNBZ10024apour TEM
Spectromètre UV-VISLeageneDZ0035TEM
Transmission
JEOLJEM-100CXIIpour analyseur de taille
de particules BCA réactif AThermo Fisher Scientific23228pour dosage
BCA réactif BThermo Fisher Scientific23224pour dosage BCA
96-PlaquesCorning3599pour BCA
doseur de plaquesThermo Fisher ScientificMultiskan&trade ; GOpour le dosage des BCA
Plaques à 12 puitsCorning3513pour la culture cellulaire
Banque de cellules JEG3de l’Académie chinoise des sciencesTCHu195Placenta humain
DMEM/F12HycloneSH30272.01sans rouge de phénol
Sérum de veau fœtal (FBS)GIBCO10100pour la culture cellulaire
Pénicilline/streptomycineGIBCO15070063pour la culture cellulaire
Microscope à fluorescenceOLYMPUSCKK53pour l’absorption cellulaire
ParaformaldéhydeShanghai Lingfeng1372021pour l’absorption cellulaire
DAPISangon BiotechA606584pour l’absorption cellulaire
Support de montageLifeP36961pour l’absorption cellulaire
de Acide pour microscope électronique

Références

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