Article de méthode

Dosage d’adhérence dynamiques pour l’analyse fonctionnelle des thérapies contre les adhérences dans la maladie intestinale inflammatoire

DOI :

10.3791/58210

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20 septembre 2018

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1Department of Medicine 1, University of Erlangen-Nuremberg

Dans cet article

Résumé

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Dynamique adhérence de cellules immunitaires vers la paroi du vaisseau est une condition préalable pour la domiciliation de l’intestin. Nous présentons ici un protocole pour une analyse fonctionnelle in vitro pour l’analyse de l’impact des anticorps anti-intégrine, chimiokines ou d’autres facteurs sur l’adhérence cellulaire dynamique de cellules humaines à l’aide d’enduit de loopbackDans capillaires.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tube digestif homing des cellules immunitaires est important pour la pathogenèse des maladies inflammatoires de l’intestin (MII). Adhérence cellulaire intégrine dépendant d’addressins est une étape cruciale dans ce processus et stratégies thérapeutiques interférant avec l’adhérence ont été établis avec succès. L’anticorps de l’intégrine anti-α4β7, vedolizumab, est utilisé pour le traitement clinique de la maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (Cu) et autres composés sont susceptibles de suivre.

Les détails de la procédure d’adhésion et les mécanismes d’action des anticorps anti-intégrine sont encore peu clairs à bien des égards en raison des techniques limitées disponibles pour la recherche fonctionnelle dans ce domaine.

Nous présentons ici un essai d’adhérence dynamiques pour l’analyse fonctionnelle de l’adhérence de cellules humaines dans des conditions de circulation et de l’impact des thérapies anti-intégrine dans le contexte des MICI. Il repose sur la perfusion des cellules humaines primaires par l’intermédiaire de capillaires en verre ultrafin rence-enduit avec analyse microscopique en temps réel. Le test offre une variété de possibilités d’améliorations et modifications et détient le potentiel de découvertes mécanistes et applications translationnelles.

Introduction

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Motion de la cellule est un processus fortement réglementé indispensable pour le développement et le fonctionnement des organismes multicellulaires, mais est également impliquée dans la pathogénie d’une multitude de maladies1. Récemment, le processus de retour des cellules immunitaires dans la circulation sanguine vers les tissus périphériques a gagné une attention croissante, car il contribue à la reconstitution et l’expansion des cellules pathogènes dans les tissus enflammés dans les maladies à médiation immunologique par2 ,3. En particulier, homing s’est avéré ont intérêt translationnelle dans les maladies inflammatoires de l’intestin (MICI). La thérapeutique anti-α4β7 intégrine anticorps vedolizumab interférant avec homing gut a montré une efficacité dans des essais cliniques à grande échelle4,5 et a été utilisé avec succès dans la pratique clinique réelle6,7 , 8. autres composés sont susceptibles de suivre9,10. De même, l’anticorps de l’intégrine thérapeutique anti-α4, natalizumab, est utilisé pour le traitement de la sclérose en plaques (MS)11.

Toutefois, notre compréhension fonctionnelle du processus contrechamp en général et le mécanisme d’action de ces anticorps thérapeutiques en particulier est encore limitée. Il est bien établi que homing consiste en plusieurs étapes, y compris la cellule attachant et roulant avec adhérence de cellules suivantes conduisant à l’arrestation ferme suivie de trans migration endothéliales12,13. Les anticorps susmentionnés neutralisent des intégrines à la surface cellulaire empêchant l’interaction avec les addressins sur l’endothélium de la paroi des vaisseaux. Ceci est pensé pour empêcher la cellule ferme adhésion14,15. Pourtant, nous commençons seulement à comprendre la pertinence différentielle des intégrines spécifiques pour la domiciliation de cellule de sous-ensembles distincts de cellules. En outre, les effets des anticorps anti-intégrine sur différents sous-ensembles de cellules et les associations de dose-réponse sont largement méconnues, menant à beaucoup de questions en suspens dans le domaine des thérapies de radioralliement et contre les adhérences intestinale dans les MICI.

Par conséquent, des outils pratiques pour répondre à ces questions sont absolument nécessaires. L’effet des anticorps anti-intégrine sur l’interaction de l’intégrine-rence a jusqu’ici surtout été évalué en évaluant l’inhibition de l’efficacité/liaison liaison avec écoulement cytometry ou par adhérence statique dosages16,17 ,19,18,20, donc avec la simplification apparente et l’écart par rapport à la situation physiologique. Nous avons récemment mis en place un test d’adhérence dynamiques pour étudier l’adhésion intégrine-dépendante des cellules humaines à addressins et les effets des anticorps anti-intégrine sous la contrainte de cisaillement2. Le principe de la technique a été montré plus haut avec la souris les cellules21,22. Ici, il a été adapté et développé pour répondre aux questions mentionnées ci-dessus translationnelles, ouverture nouvelles avenues afin de mieux comprennent les mécanismes du traitement avec des anticorps anti-intégrine in vivo.

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Protocole

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Les études décrites dans les sections suivantes ont été réalisées d’après approbation du Comité d’éthique de l’Université Friedrich-Alexander Erlangen-Nuremberg.

1. préparation des capillaires

  1. Connecter les capillaires rectangulaires au tuyau en caoutchouc en étirant le tube sur un côté avec des petits ciseaux et en insérant doucement le tube capillaire (environ 0,5 cm) dans le tube. Rendre étanche la liaison entre le tube avec le film plastique paraffine et des capillaires.
  2. Enduire le capillaire avec 20 µL de loopbackDans (recombinant Fc chimère ; 5 µg/mL, loopbackDans, p. ex. MAdCAM-1, dans un tampon enduit (NaCl 150 mM + 1 mM HEPES)) ou la solution de contrôle d’isotype approprié à l’aide d’une pipette p20 (fluide va se tremper dans le capillaire). Puis, scellez le côté non connecté au tuyau avec le film plastique paraffine et incuber pendant au moins 1 heure à 37 ° C. Utilisez un capillaire rempli uniquement avec le tampon de revêtement ou avec le contrôle de l’isotype approprié comme contrôle négatif.
  3. Retirer le film plastique paraffine de l’extrémité du capillaire, vider le revêtement en laissant le liquide de trempage hors du capillaire sur un capillaires de serviette et bloc de papier pendant au moins 1 h 20 µl de bloquant la solution (solution de 1 PBS x avec 5 % de BSA) à 37 ° C. Sceller le côté ouvert du capillaire avec film plastique paraffine. Ne pas enlever la solution de blocage avant de procéder à la microscopie.

2. cellule d’isolement, de traitement et de préparation pour la microscopie

Remarque : Ces étapes peuvent être effectuées au cours de l’incubation périodes nécessaires à la préparation capillaire.

  1. Recueillir les 18 mL de sang anticoagulé complet avec une collection de sang aseptique de la veine cubitale du bénévolat des personnes (p. ex., IBD patients et/ou témoins sains) après consentement éclairé conformément aux règlements de la section locale Comité d’éthique.
    Remarque : Cette étape doit être effectuée uniquement par le personnel médical qualifié et expérimenté selon les règlements nationaux et/ou régionaux.
  2. Verser le sang dans un tube de 50 mL et diluer jusqu'à un volume de 35 mL avec du PBS 1 x. Puis sous-couche le mélange de sang-PBS avec 10 mL de milieu de gradient de densité.
  3. Effectuer centrifugation en gradient de densité à 15 min à 800 x g et 24 ° C sans frein pour séparer les cellules.
  4. Recueillir les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) en aspirant la couche leucocytaire juste au-dessus de la couche de moyen gradient de densité (couche claire intermédiaire). Transfert de PBMC en un tube frais 50 mL, compléter à 50 mL avec 1 x PBS et centrifuger pendant 10 min à 300 x g et 10 ° C.
  5. Jeter le surnageant, resuspendre le culot dans 10 mL de solution 1 PBS x et ensuite compter le nombre de cellules, par exemple, en utilisant une cellule Neubauer chambre de comptage.
  6. Facultatif : Pour étudier l’adhérence des granulocytes effectuez la procédure suivante. Sinon, passez à l’étape 2.7 ou 2.8.
    1. Recueillir la couche de granulocytes (calque inférieur après centrifugation en gradient de densité contenant également les érythrocytes). Remettre en suspension les cellules dans 40 mL de PBS 1 x. Puis ajoutez 8 mL de 6 % Dextran dans du PBS 1 x, mélanger doucement et laisser les sédiments de cellules pendant 30 min à température ambiante.
      Remarque : Les érythrocytes vont couler au fond du tube, alors que les granulocytes restera en suspension.
    2. Après 30 min, recueillir le surnageant, transvaser dans un tube frais 50 mL et centrifuger pendant 6 min à 300 x g et 4 ° C. Jeter le surnageant et lyse des érythrocytes restants en ajoutant 5 mL de 0,2 % NaCl dans ddH2O. Incuber pendant 1 min.
    3. Ajouter 5 mL de 1,4 % NaCl dans ddH2O et incuber pendant encore une minute. Arrêtez la lyse hypotonique en ajoutant 20 mL de solution 1 PBS x et centrifuger pendant 6 min à 300 x g et 4 ° C.
    4. Resuspendre le culot dans 10 mL de solution 1 PBS x. Ensuite, compter nombre de cellules à l’aide d’une cellule Neubauer chambre de comptage.
  7. Facultatif : Pour étudier l’adhérence des sous-ensembles PBMC, purifier les différents types de cellules ou des sous-ensembles (p. ex., CD4+ et CD8+ T cellules ou CD19+ B cellules) à l’aide de microbilles selon le protocole du fabricant ou par fluorescence-activé cellule triant (FACS). Sinon, passez à l’étape 2.8.
  8. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 10 min à 300 x g et 10 ° C. Jeter le surnageant et tacher les cellules avec cellule de suivi des colorants (p. ex., CFSE) selon les instructions du fabricant.
  9. Par la suite, centrifuger les cellules pendant 10 min à 300 x get jeter le surnageant. Remettre en suspension dans 1 x PBS, déterminer le nombre de cellules et centrifuger à nouveau pendant 10 min à 300 x g.
  10. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot de cellules colorées dans la quantité appropriée de tampon d’adhérence (NaCl 150 mM + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) pour obtenir une suspension de 1. 5 x 106 cellules/mL. Ensuite, ajouter la quantité appropriée de 100 mM MnCl2 pour obtenir une concentration finale de 1 mM.
    NOTE : Ces cellules sont maintenant prêts pour la microscopie.
  11. Facultatif : Traiter les cellules avec des cytokines, neutraliser les anticorps ou autres composés. Sinon, passez à l’étape 3.
    1. Omettez l’étape 2.10 et Resuspendre le culot de cellules colorées de l’étape 2,9 dans un milieu RPMI (avec 10 % de SVF et 1 % la pénicilline/streptomycine) pour obtenir une concentration de 1. 5 x 106 cellules/mL.
    2. Pipette 1 mL de cette suspension cellulaire en plus grand nombre de puits d’une plaque de 48 puits qu’il sont a des conditions pour être analysés. Préparez toujours un puits avec des cellules non traitées pour être perfusée par un capillaire non couché comme contrôle négatif et un puits avec des cellules non traitées pour être perfusée par un enduit de loopbackDans capillaire comme contrôle positif.
    3. Pour le traitement avec des anticorps anti-intégrine, ajouter la quantité appropriée d’anticorps (par exemple, 10 µg/mL vedolizumab) à la suspension cellulaire. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C. Pour un traitement par les cytokines, ajouter la quantité appropriée de cytokines recombinantes (p. ex., 10 ng/mL CXCL10) à la suspension cellulaire. Incuber 5 min à 37 ° C.
    4. Après incubation, récolter les cellules de resuspendant cellules plusieurs fois en utilisant une pipette p1000. Transfert de cellules dans un tube de 2 mL, rincer bien à nouveau à 1 mL de PBS 1 x et ajouter dans le tube 2 mL. Déterminer le nombre de cellules.
      Remarque : L’Incubation des populations de cellules adhérentes (p. ex., monocytes) peut nécessiter des mesures supplémentaires (p. ex.., traitement par la trypsine) pour détacher les cellules de la plaque.
  12. Cellules de centrifugation pendant 10 min à 300 x g à 10 ° C. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans la quantité appropriée de tampon d’adhérence pour obtenir une suspension de 1. 5 x 106 cellules/mL. Ensuite, ajouter la quantité appropriée de 100 mM MnCl2 pour obtenir une concentration finale de 1 mM. Quand un pré-traitement avec chimiokines n’ajoutez pas de MnCl2 à la suspension cellulaire. Ces cellules sont maintenant prêts pour la microscopie.
    Remarque : Le volume minimal utilisé pour le dosage est tributaire de la pompe et le tuyau utilisé. Dans cette étude, à l’aide de la pompe péristaltique et le tube spécifié dans la Table des matières, il fallait un volume minimal de 400 µL. Si souhaité et il y a lieu (selon le type de cellule et rendement), la concentration de cellules dans la suspension peut être augmentée pour mesurer l’adhérence supérieure dans une courte période de temps.
  13. Modification potentielle : essai d’adhérence dynamique concurrentielle
    1. Effectuez les étapes mentionnées ci-dessus avec différentes populations cellulaires à comparer les uns aux autres (p. ex., réglementation et cellules effectrices T isolés par l’isolement de billes magnétiques suivant les instructions du fabricant comme par l’Etape 2.7).
    2. Tache de chaque population avec un colorant différent (par exemple, CFSE et Ousmane) comme décrit aux étapes 2,8 à 2,9 pour pouvoir différencier les populations cellulaires au cours de la microscopie.
    3. Jeter le surnageant et remettre en suspension les granules cellulaires colorées dans la quantité appropriée de tampon d’adhérence (NaCl 150 mM + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) pour obtenir une suspension de 1. 5 x 106 cellules/mL.
    4. Mélanger des quantités égales des suspensions de cellules (par exemple, 500 µL de cellules T régulatrices) et 500 µL de cellules effectrices T pour obtenir une finale mélangé la concentration cellulaire de 1,5 x 106 cellules/mL. Ensuite, ajouter la quantité appropriée de 100 mM MnCl2 pour obtenir une concentration finale de 1 mM. Ces suspensions utilisable par la suite pour l’analyse de la concurrence du processus d’adhésion en perfusant les différentes populations cellulaires à travers le capillaire même.

3. vivre d’imagerie cellulaire de l’adhérence dynamique

  1. Allumez le microscope et sélectionnez le filtre approprié ou laser pour exciter la cellule dye(s) (p. ex., 488 nm laser CFSE), un objectif approprié (par exemple, 40 X) et une imagerie déchéance en temps propice acquisition mode de suivi.
  2. Retirer le film plastique paraffine de l’extrémité du capillaire et connecter le tube capillaire avec un morceau de tube (environ 5 cm de longueur) en étirant le tube sur un côté avec des petits ciseaux et en insérant doucement le tube capillaire (environ 0,5 cm) dans le tube. Rendre étanche la liaison entre le capillaire et le tube avec le film plastique paraffine.
  3. Monter le capillaire sur une plaque de fixation (par exemple, le couvercle d’une plaque de 6 puits avec une découpe rectangulaire légèrement plus courte que la longueur du capillaire) et placer le capillaire fixe sur le support du microscope, de sorte que le tube capillaire est en discussion et prêt pour la microscopie.
  4. Insérez le tube de caoutchouc dans l’encoche correspondante de la pompe péristaltique et placer l’extrémité ne pas attachée au capillaire dans le tube d’échantillon selon contenant la suspension cellulaire. Insérez le tube court de l’autre côté du capillaire dans un tube de 15 mL pour recueillir des intermédiaires.
  5. Laissez le remplissage de tubes avec un débit de 500 µL / min jusqu'à ce que la suspension cellulaire atteint presque le capillaire. Alors laissez le remplissage capillaire avec un débit de 100 µL/min.
    Remarque : Un remplissage rapide du capillaire assure une répartition régulière de la suspension cellulaire à l’intérieur du capillaire.
  6. Quand le tube capillaire est rempli de la suspension cellulaire, régler le débit à 10 µL/min.
    Remarque : Ces débits peuvent varier, lorsqu’on utilise des capillaires de dimensions différentes ou des différentes pompes péristaltiques. Dans cette étude, le taux d’écoulement de 10 µL/min a été optimisé pour la pompe et les capillaires pour reproduire in vivo la circulation sanguine.
  7. Capturer des images de Time-lapse des cellules se déplaçant lentement à travers le capillaire le long de la rence revêtu à l’intérieur du mur toutes les 2 s pour un total de 3 min.
    NOTE : Intervalles et temps total peuvent varier selon le type de cellule et question à aborder.
  8. Avant de jeter le tube capillaire, l’écran entier capillaire à travers l’oculaire du microscope pour s’assurer que la section montrée sur la vidéo est représentatif. Si nécessaire, faire un deuxième enregistrement.
  9. Sans le tuyau de la pompe et laisser le liquide restant courir vers dans le tube 2 mL, puis débranchez le capillaire et le tube de la barre de fixation et continuer avec le prochain capillaire.

4. l’évaluation et le comptage des cellules

  1. Ouvrez la séquence Time-lapse avec logiciel approprié et exporter les trois premières images (« début ») et les trois dernières images (« End ») sous forme de fichiers Tiff.
  2. Ouvert les trois images « Commence » à ImageJ, convertir en 32 bits («Image | Type | 32 bit') et fusionner des images (' Image | Couleur | Fusionner des canaux; assigner les couleurs rouges, verts et bleus pour les différentes images). Convertir image composite RVB (' Image | Type-RGB') et l’enregistrer en tant que fichier Tiff. Répéter l’opération avec les images de « Fin ».
    Remarque : Dans les essais d’adhérence dynamique concurrentielle avec cellules colorées avec des couleurs différentes, tout d’abord diviser les canaux des images pour analyser l’adhésion des populations cellulaires différentes séparément.
  3. Compter les cellules blanches visibles dans le « Début » et « End » composite et soustraire le nombre de globules blancs dans le « début » de globules blancs dans la « fin ».
    Remarque : La différence représente le nombre de nouveaux adhérant cellules dans l’intervalle de temps de 3 min. Dans l’image composite, les cellules qui se déplaçait sont visibles dans la couleur spécifique qui a été attribuée à l’armature respectif puisqu’ils localiser dans un autre endroit dans l’image précédente et la suivante. Pour les cellules qui sont adhérentes, les signaux rouges, verts et bleus dans le chevauchement même spot au blanc.
  4. Pour mieux visualiser les résultats, compilez une vidéo des séquences Time-lapse, par exemple, à l’aide de ImageJ.

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Résultats

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La méthode présentée dans ce manuscrit a pour but de simuler le processus in vivo de l’adhérence de cellules humaines à la paroi endothéliale aussi étroitement que possible à fonctionnellement évaluer adhésion cellulaire et le rôle des anticorps interférentes. Par conséquent, ultraminces capillaires sont recouverts d’addressins et perfusés avec des cellules humaines fluorescent étiquetés d’intérêt à l’aide d’une pompe à perfusion. L’adhérence des cellules humaines à l’addressins ...

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Discussion

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Le protocole ci-dessus décrit une technique utile pour étudier la dynamique adhérence de cellules immunitaires humaines aux ligands endothéliales. Par variation de ligands enduits types cellulaires perfusé ou sous-ensembles, incubation avec des stimuli additionnels ou différents anticorps neutralisants, il a presque illimité d’applications potentielles. Par conséquent, ces tests d’adhérence dynamique peuvent être utiles de répondre à deux questions fondamentales de recherche fondamentale et translationnelles requêtes qui...

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Déclarations de divulgation

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Toutefois a été un conseiller pour Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda et Boehringer. Toutefois et S.Z. a reçu le soutien à la recherche de Takeda et Roche.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La recherche du CN, IA, traitement NPF et SZ a été appuyée par le Centre interdisciplinaire de recherche clinique (IZKF) et le programme ELAN de l’université Erlangen-Nuremberg, l’autre Kröner-Fresenius-Stiftung, la Fritz-Bender-Stiftung, la maladie de Crohn allemand et Colitis Foundation (DCCV), la clinique recherche groupe CEDER du Conseil allemand de la recherche (DFG), le programme de rubrique DFG microbiote, l’Initiative de champ émergeant et le DFG Collaborative Research Centers 643, 796 et 1181.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque 48 puitsSarstedt833,923
Tampon d’adhérence : 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2
Solution bloquante : 1x PBS dans ddH2O + 5 % BSA
Albumine sérique bovine (BSA)ApplichemA1391,0100
CaCl2Merck2382
Capillaires : Tube Boro Rectangle 0,20 mm x 2,00 mm ID, longueur 50 mmCM Scientific3520-050
CCL-2,immuno-outils11343384
microbilles CD4, humainMiltenyi Biotec130-045-101
CellTrace&trade ; Kit de prolifération cellulaire CFSEThermoFischer ScientificC34554
Centrifugeuse (Rotixa 50 RS)Hettrich
Tampon de revêtement : 150 mM NaCl + 1 mM Microscope confocal HEPES
(TCS SP8)Leica
CXCL-10, humanImmunotools11343884
Dextran 500Roth9219.3
EDTA KE/9 mL MonovetteSarstedt
Falcons (50 mL)Sarstedt62,547,004
Fc chimère contrôle d’isotypeR& D Systems110-HG
Débits Pompe péristaltique (LabV1)Baoding Shenchen Precision Pump Company
HEPESVWRJ848-100ML
Contrôle de l’isotype IgG humainThermoFischer Scientific31154
Molécule d’adhésion intercellulaire 1 (ICAM-1) Fc chimèreR& D Systems720-IC-050
LS-ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401
MgCl2Roth
MnCl2Roth
contrôle de l’isotype IgGMiltenyi Biotec130-106-545
Adresse vasculaire muqueuse Molécule d’adhésion cellulaire 1 (MAdCAM-1) Fc chimèreR& D Systems6056-MC
NaClRoth3957.3
NatalizumabBiogen
Neubauer Chambre de comptageRothT729.1
Pancoll, humainPAN BiotechP04-601000
Saline tamponnée au phosphate (PBS)  ;BiochromL 182-10sans Mg et Ca
Film de paraffine plastique : Parafilm (PM-996)VWR52858-000
purifié anti-humain CD18Biolegend302102
RPMI Medium 1640Gibco Life Technologies61870-010
Tube en caoutchouc : SC0059T Tube LMT-55 à 3 arrêts, diamètre intérieur de 1,02 mm, longueur de 406,4 mmIsmatecSC0059
Pipettes sérologiquesSarstedt861,254,025
Trypan blueRothCN76.1
Molécule d’adhésion des cellules vasculaires 1 (VCAM-1) Fc chimeraBiolegend553706
Vedolizumab (Entyvio)Takeda
humains

Références

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Adh sion cellulaire sous fluxth rapie anti int grinecellules mononucl es du sang p riph riquecapillaires rev tus d adressinesanalyse microscopique en temps r elcentrifugation sur gradient de densitimagerie en acc l rinteraction int grine adressine

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