Visualisation de la croissance axonale cône effondrement et effets précoces de β-amyloïde dans des neurones cultivés de souris

Résumé

Un protocole d’enquêter sur les premiers effets de β amyloïde (Aß) dans le cerveau est présenté ici. Cela montre que le bêta-amyloïdes induit endocytose clathrine et effondrement des cônes de croissance axonale. Le protocole est utile dans l’étude des effets précoces de bêta-amyloïdes sur les cônes de croissance axonale et peut-être faciliter la prévention de la maladie d’Alzheimer.

Résumé

Β amyloïde (Aß) provoque des troubles de la mémoire dans la maladie d’Alzheimer (ma). Bien que thérapeutique ont été montré pour réduire les concentrations de bêta-amyloïdes dans le cerveau des patients atteints de ma, ceux-ci ne s’améliorent pas les fonctions de mémoire. Regroupe les bêta-amyloïdes dans le cerveau avant l’apparition de troubles de la mémoire, ciblage Aβ peut être inefficace pour le traitement des patients atteints de ma qui présentent déjà des déficits de mémoire. Par conséquent, signalisation en aval en raison des dépôts de Aβ doit être bloquée avant le développement de l’AD. Aβ induit une dégénérescence axonale, conduisant à la perturbation des réseaux de neurones et de troubles de la mémoire. Bien qu’il existe beaucoup d’études sur les mécanismes de toxicité Aβ, la source de bêta-amyloïdes toxicité reste inconnue. Pour aider à identifier la source, nous proposons un protocole novateur qui utilise la microscopie, transfection du gène et imagerie afin d’étudier les changements précoces causées par les bêta-amyloïdes dans les cônes de croissance axonale des neurones en culture de cellules vivantes. Ce protocole a révélé que Aβ induite par endocytose clathrine dans les cônes de croissance axonale suivie d’effondrement de la croissance de cône, ce qui démontre que l’inhibition de l’endocytose empêche toxicité Aβ. Ce protocole sera utile pour étudier les premiers effets de la bêta-amyloïdes et peut conduire à un traitement plus efficace et préventif AD.

Introduction

Dépôts d’amyloïde-β (Aβ) sont trouvent dans le cerveau des patients atteints de la maladie d’Alzheimer (ma) et sont considérés comme une cause essentielle de AD¹ qui perturbent les réseaux neuronaux, conduisant à une déficience de mémoire pour^2,3,4. De nombreux candidats-médicaments cliniques montrent à prévenir efficacement la production de β amyloïde (Aß) ou éliminer les dépôts de bêta-amyloïdes. Toutefois, aucun ont réussi à améliorer la fonction de mémoire dans AD patients⁵. Aβ est déjà déposé dans le cerveau avant l’apparit....

Protocole

Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire au Campus de l’Université de Toyama Sugitani et ont été approuvés par le Comité pour animalier et Use of Laboratory Animals au Sugitani Campus de la Université de Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).

1. effondrement Assay

1. Revêtement poly-D-lysine
   1. Enrober les lames de 8 puits de culture avec 400 ml de 5 μg/mL poly-D-lysine (PDL) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et les incuber à 37 ° C pendant la nuit.
   2. Enlever la solution de la PDL et laver les puits 3 fois avec de l’eau disti....

Résultats

Dans ce protocole, Aβ1-42 est incubé à 37 ° C pendant 7 jours avant de l’utiliser, parce que l’incubation de Aβ1-42 était nécessaire pour produire des formes toxiques^27,28,30,35. Après l’incubation, formes globales d’Aβ ont été observés (Figure 1 a). Il a été signalé que l’incubation similaire de Aβ1-42 produit la forme de fibrilles.......

Discussion

Le protocole décrit dans la présente étude a permis l’observation de phénomènes précoces dans les cônes de croissance axonale après traitement Aβ1-42. Aβ1-42 induite par endocytose dans les cônes de croissance axonale dans les 20 min et effondrement de cône de croissance a été observée dans 1 h de traitement. Cette endocytose a été probablement véhiculée par la clathrine. En utilisant ce protocole, l’inhibition de l’endocytose clathrine a été confirmée pour empêcher l’effondrement de cône de croissance induite par l’Aβ1-.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
souris ddY	SLC
Lame de culture à huit puits	Falcon	354108
poly D lysine	Wako	168-19041
Milieu de culture, milieu neurobasal	Gibco	21103-049
sérum domestique	Gibco	26050-088
glucose	Wako	049-31165
L-glutamine	Wako	074-00522
0,05 % trypsine	Gibco	25300-054
DNase I	Worthington	DP
inhibiteur de la trypsine de soja	Gibco	17075-029
Filtre avec 70 µ ; m taille de maille, filtre cellulaire	Falcon	352350
B-27 supplément	Gibco	17504-044
CO2 incubateur	Astec	SCA-165DS
Amyloïde &beta ; 1-42	Sigma-Aldrich	A9810
paraformaldéhyde	Wako	162-16065
saccharose  ;	Wako	196-00015
Milieu d’enrobage aqueux, Aqua-Poly/Mount	polysciences	18606-20
Microscope inversé A	Carl Zeiss	Axio Observer Z1  ;	Connecté avec AxioCam MRm, l’unité de chauffage XL S, le module CO2 S1 et le module Temp S1
Objectif Plan-Apochromat 20x	Carl Zeiss	420650-9901
Objectif Plan-Apochromat 63x	Carl Zeiss	440762-9904
Objectif, CFI Plan Apo Lambda 40X	Nikon
anti-MAP2 IgG	Abcam	ab32454
anti-tau-1 IgG	Chemicon	MAB3420
anticorps anti-amyloïde &bêta ;	IBL	10379	clone 11A1
sérum de chèvre normal	Wako	143-06561
sérum de bovin albumine	Wako	010-25783
t-octylphénoxypolyéthoxyéthanol	Wako	169-21105
IgG anti-souris de chèvre conjugué à AlexaFluor 594	Invitrogen	A11032
IgG anti-lapin de chèvre conjugué à AlexaFluor 488	Invitrogen	A11029
plaque chauffante	NISSIN	NHP-M30N
verre de couverture	Fisher Scientific	12-545-85
Antenne parabolique 35 mm	IWAKI	1000-035
Silicone RTV	Shin-Etsu	KE42T
poinçon à main	Roper Whitney	No.
Sonde à membrane de fluorescence, FM1-43FX	Invitrogen	F35355
Ca2+- et Mg2+-free Solution saline équilibrée de Hanks	Gibco	14175-095
Solution de transfection, solution nucléofectrice	Lonza	VPG-1001
Électroporateur, Nucleofector I	Amaxa
Microscope inversé B	Keyence	BZ-X710
Logiciel d’image, ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/

XX