Article de méthode

Visualisation de la croissance axonale cône effondrement et effets précoces de β-amyloïde dans des neurones cultivés de souris

DOI :

10.3791/58229

⸱

30 octobre 2018

1Division of Neuromedical Science, Institute of Natural Medicine, University of Toyama

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un protocole d’enquêter sur les premiers effets de β amyloïde (Aß) dans le cerveau est présenté ici. Cela montre que le bêta-amyloïdes induit endocytose clathrine et effondrement des cônes de croissance axonale. Le protocole est utile dans l’étude des effets précoces de bêta-amyloïdes sur les cônes de croissance axonale et peut-être faciliter la prévention de la maladie d’Alzheimer.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Β amyloïde (Aß) provoque des troubles de la mémoire dans la maladie d’Alzheimer (ma). Bien que thérapeutique ont été montré pour réduire les concentrations de bêta-amyloïdes dans le cerveau des patients atteints de ma, ceux-ci ne s’améliorent pas les fonctions de mémoire. Regroupe les bêta-amyloïdes dans le cerveau avant l’apparition de troubles de la mémoire, ciblage Aβ peut être inefficace pour le traitement des patients atteints de ma qui présentent déjà des déficits de mémoire. Par conséquent, signalisation en aval en raison des dépôts de Aβ doit être bloquée avant le développement de l’AD. Aβ induit une dégénérescence axonale, conduisant à la perturbation des réseaux de neurones et de troubles de la mémoire. Bien qu’il existe beaucoup d’études sur les mécanismes de toxicité Aβ, la source de bêta-amyloïdes toxicité reste inconnue. Pour aider à identifier la source, nous proposons un protocole novateur qui utilise la microscopie, transfection du gène et imagerie afin d’étudier les changements précoces causées par les bêta-amyloïdes dans les cônes de croissance axonale des neurones en culture de cellules vivantes. Ce protocole a révélé que Aβ induite par endocytose clathrine dans les cônes de croissance axonale suivie d’effondrement de la croissance de cône, ce qui démontre que l’inhibition de l’endocytose empêche toxicité Aβ. Ce protocole sera utile pour étudier les premiers effets de la bêta-amyloïdes et peut conduire à un traitement plus efficace et préventif AD.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dépôts d’amyloïde-β (Aβ) sont trouvent dans le cerveau des patients atteints de la maladie d’Alzheimer (ma) et sont considérés comme une cause essentielle de AD1 qui perturbent les réseaux neuronaux, conduisant à une déficience de mémoire pour2,3,4. De nombreux candidats-médicaments cliniques montrent à prévenir efficacement la production de β amyloïde (Aß) ou éliminer les dépôts de bêta-amyloïdes. Toutefois, aucun ont réussi à améliorer la fonction de mémoire dans AD patients5. Aβ est déjà déposé dans le cerveau avant l’apparition de déficiences de mémoire6; par conséquent, baisse des niveaux de bêta-amyloïdes dans le cerveau des patients présentant troubles de la mémoire peuvent être inefficaces. Dépôts d’Aβ sont présent dans Alzheimer préclinique ; Toutefois, ces patients présentent rarement neuronale dégénérescence et la mémoire déficits6. Il y a un décalage entre les dépôts de bêta-amyloïdes et troubles de la mémoire. Par conséquent, une stratégie essentielle pour la prévention des AD bloque toxicité Aβ signalisation durant les premiers stades de l’AD, avant l’apparition de déficits de mémoire. Dépôts d’Aβ induit axon dégénérescence7,8,9,10,11,12,13, qui peut conduire à une perturbation du réseaux de neurones et une déficience permanente d’une fonction mémoire. De nombreuses études ont étudié les mécanismes de la toxicité de l’Aß ; par exemple, les axones dégénérées de cerveaux de souris ont démontré avoir augmenté autophagie14. Activation de la calcineurine a été signalée comme un éventuel mécanisme de la dégénérescence axonale induite par l’Aß15; Cependant, la détente directe d’une dégénérescence axonale reste inconnue.

Cette étude se concentre sur l’effondrement des terminaisons axonales appelé cônes de croissance. L’effondrement des cônes de croissance axonale peut être causée par les répulsifs croissance axonale, type sémaphorine-3 a et éphrine-A516,17,18,19,20. Terminaisons axonales dystrophiques effondrement semblable ont été observées dans le cerveau des AD patients21,22. En outre, une défaillance du fonctionnement de cône de croissance peut provoquer une dégénérescence axonale23. Cependant, on ne sait pas si Aβ induit effondrement de cône de croissance. Par conséquent, cette étude présente un nouveau protocole pour observer les premiers effets de la bêta-amyloïdes dans les neurones en culture et enquêter sur effondrement de cône de croissance induite par l’Aß.

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Protocole

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Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire au Campus de l’Université de Toyama Sugitani et ont été approuvés par le Comité pour animalier et Use of Laboratory Animals au Sugitani Campus de la Université de Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).

1. effondrement Assay

  1. Revêtement poly-D-lysine
    1. Enrober les lames de 8 puits de culture avec 400 ml de 5 μg/mL poly-D-lysine (PDL) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et les incuber à 37 ° C pendant la nuit.
    2. Enlever la solution de la PDL et laver les puits 3 fois avec de l’eau distillée.
  2. Neurone culture24
    1. Émincer fraîchement isolées des cortex cérébraux de souris de ddY (E14) 14 de jour embryonnaire avec microciseaux dans le milieu de culture de neurones contenant 12 % de sérum de cheval, 0,6 % de glucose et 2 mM de L-glutamine (A moyen). N’ajoutez pas d’antibiotiques.
      Remarque : Dans le présent protocole, la souris ddY est utilisée. Il s’agit d’une souche non consanguine couramment utilisée au Japon. Ce protocole de culture de neurones peut être également appliqué pour rat neurones corticaux7,25.
    2. Centrifuger les tissus à 87 g pendant 3 min.
    3. Retirez le surnageant. Puis au culot, ajouter 2 mL de trypsine de 0,05 % et incuber pendant 15 min à 37° C. Mélanger en tapant toutes les 5 min.
    4. Ajouter 4 mL de milieu A et mélanger en tapotant.
    5. Centrifuger les tissus à 178 x g pendant 3 min.
    6. Retirez le surnageant et incuber les tissus avec 600 U/mL DNase I et inhibiteur trypsique du soja 0,3 mg/mL dissous dans du PBS pendant 15 min à 37 ° C. Mélanger en tapant toutes les 5 min.
    7. Après incubation, ajouter 4 mL de milieu A et mélanger en tapotant.
    8. Centrifuger les tissus à 178 x g pendant 3 min.
    9. Après avoir retiré le surnageant, ajouter 4 mL de milieu A et triturer les tissus avec une pipette Pasteur polie.
    10. Filtrer les tissus triturés avec une maille de pores de 70 µm. Après filtration, calcul de la densité des cellules avec un hémocytomètre.
    11. Culture les cellules dans la culture de 8 puits glissant à 0,8 x 104 cellules/puits avec support A et leur maintiennent dans un incubateur à CO2 avec une atmosphère humidifiée de 10 % de CO2 à 37 ° C.
    12. Après 4 h de culture, remplacer le milieu de culture pour un supplément de 2 % contenant de culture neuronale, 0,6 % de glucose et 2 mM de L-glutamine (moyen B).
      NOTE : La pureté des neurones était d’environ 75 %, comme décrit plus haut26.
  3. Effondrement de dosage27
    1. Dissoudre commercialement obtenu pleine longueur amyloïde β1-42 (Aβ1-42) dans l’eau distillée à une concentration de 0,5 mM et incuber à 37 ° C pendant 7 jours. Après l’incubation, stocker la solution Aβ1-42 agrégée dans un congélateur à-30 ° C jusqu'à l’utilisation.
      Remarque : Cette incubation est nécessaire pour l’agrégation et la toxicité de l’Aß27,28,29,30.
    2. Après 4 jours de culture neuronale, traiter les puits avec 100 μL de nouveau moyen B, contenant 0,5 μM agrégées Aβ1-42 ou véhicule solution (eau distillée) pendant 1 h.
      NOTE : Effets de Aβ1-42 ont été manière dose-dépendante a augmenté de 0,1 à 5 μM et a atteint 0,5 μM comme décrit plus haut27. Des résultats similaires peuvent être observés lorsque par traitement Aβ1-42 pendant 1 h après 3 jours de culture neuronale31.
    3. Enlever le milieu de culture et immédiatement fixer les neurones avec 4 % de paraformaldéhyde contenant 4 % de sucrose dans du PBS pendant 1 h à 37 ° C sur une plaque chauffante.
    4. Après fixation, laver les neurones 3 fois avec du PBS et fixez-les avec un milieu de montage aqueux. Sécher le milieu de montage à 4 ° C pendant 2 à 4 jours.
    5. Capturez toute la zone (7,8 x 9 mm2) de chaque puits avec un 20 X objectif sec sur un microscope inversé.
    6. Classer les neurites plus longues de chaque neurone dans étape 3 ou 4 selon les axones, comme décrit précédemment32,33.
    7. Classer les cônes de croissance selon les critères suivants : les cônes de croissance 1) axonale manque lamellipodia ou 2) possédant moins de trois filopodes sont considérés comme s’est effondré de cônes de croissance, comme décrit plus haut17.
      Remarque : Les cônes de croissance saine sont marqués comme point 0 ; cônes de croissance réduite sont marqués comme 1 point. Veux dire effondrement scores sont calculés pour chaque traitement.

2. amyloïdes β Immunostaining

  1. La culture de neurones corticaux de souris pendant 3 jours, tel que décrit à l’étape 1.2.
  2. Traiter avec agrégées Aβ1-42 (5 μM) ou d’un véhicule pendant 4 h à 37 ° C dans un incubateur à CO2 .
  3. Sans enlever le support, ajouter un volume égal de 4 % de paraformaldéhyde contenant 4 % de sucrose dans du PBS à chaque puits et maintenir la culture à 37 ° C sur une plaque chauffante pendant 5 min.
  4. Remplacer la solution avec 400 ml de paraformaldéhyde à 4 % contenant 4 % de sucrose dans du PBS et maintenir à 37 ° C sur la plaque chauffante pendant 1 h. Ce protocole de fixation a été modifié d’un précédent rapport34.
  5. Laver les neurones 3 fois avec du PBS.
  6. Bloc avec 5 % de sérum de chèvre normal dans du PBS.
  7. Incuber les neurones avec l’immunoglobuline anti-amyloide β souris G (IgG) (01:50) et 1 % d’albumine sérique bovine dans du PBS à 4 ° C jusqu’au lendemain.
  8. Laver les neurones 3 fois avec du PBS.
  9. Incuber les neurones avec un anticorps secondaire conjugué fluorescence (1 : 400) et 1 % d’albumine sérique bovine dans du PBS à température ambiante pendant 2 h.
  10. Laver les neurones 3 fois avec du PBS et fixez-les avec un milieu de montage aqueux.
  11. Capturer des images de fluorescence et des images de champ lumineux avec éclairage oblique en utilisant une lentille d’objectif sec 40 X microscope inversé B.

3. axones Immunostaining27

  1. Laver les neurones 3 fois avec du PBS après fixation des neurones cultivés, comme indiqué au point 1.3.3.
  2. Incuber les neurones avec souris anti-tau-1 IgG (1/500), protéine associée de anti-microtubules lapin 2 (MAP2) IgG (1/500) à 5 % de sérum de chèvre normal et 0,3 % t- octylphenoxypoly-éthoxyéthanol dans du PBS à 4 ° C durant la nuit.
  3. Laver les neurones 3 fois avec du PBS.
  4. Incuber les neurones avec l’anticorps secondaires conjugué à fluorescence (1 : 400) et 0,3 % t- octylphenoxypolyethoxyethanol dans du PBS à température ambiante pendant 2 h.
  5. Laver les neurones 3 fois avec du PBS et monter à l’aide d’un support de montage aqueux.
  6. Capturer des images de contraste (DIC) interférences fluorescence et différentiel en utilisant un objectif de 20 × sec a microscope inversé.

4. vivre la cellule imagerie27

  1. Enrober les plats à base de verre avec 500 μL de PDL (5 μg/mL), comme indiqué au point 1.1.1.
    Remarque : Dans le présent protocole, des plats à base de verre ont été utilisés. Plats à base de verre disponibles dans le commerce utilisable aussi pour l’imagerie live. Des plats à base de verre ont été établis comme suit : 1) faire un trou environ 1,4 mm de diamètre dans le centre d’un plat de 35 mm avec un coup de main et 2) Fixez une lamelle de verre (diamètre de 22 mm) à l’arrière du plat avec du silicone.
  2. Laver les plaques avec de l’eau distillée, comme indiqué au point 1.1.2 et la culture des neurones corticaux dans le plat à base de verre à 3 x 104 cellules/plat avec A moyen, tel que décrit à l’étape 1.2.
  3. Après 4 jours de culture cellulaire, remplacer le support avec 2 mL de milieu nouveau B et le transfert le plat au microscope Maintain a inversé la culture dans une atmosphère humidifiée de 10 % de CO2 à 37 ° C.

5. l’endocytose Experiment

  1. La culture des neurones corticaux de souris comme indiqué au point 1.2.
  2. Quatre jours plus tard, remplacez le support par 100 μL de nouveau média B contenant 20 sonde de membrane de fluorescence μM pendant 1 min.
  3. Ajouter 1 μL de 0,05 mM agrégées Aβ1-42 (final 0,5 μM) ou solution de véhicule (eau distillée) et mélanger en pipettant également. Incuber pendant 20 min.
  4. Retirez le support et laver les puits deux fois avec support B qui a été préchauffé à 37 ° C.
  5. Difficulté, laver et monter les neurones comme décrit aux points 1.3.3 et 1.3.4.
  6. Capturer des fluorescentes et images DIC avec un 63 X huile objectif microscope inversé a.
  7. Quantifier la densité de la zone de sonde séropositifs fluorescence membranaire dans chaque cône de croissance saine à l’aide d’un logiciel d’image.

6. Transfection du gène

  1. Préparer les neurones corticaux tel que décrit à l’étape 1.2. Après avoir complété les étapes 1.2.1 à 1.2.10, centrifuger les neurones à 178 x g pendant 3 min.
  2. Retirer le surnageant, ajouter 4 mL de Ca2 +-libre et Mg2 +-gratuit solution saline équilibrée de Hanks (FMC-HBSS) et la composition de pipetage.
  3. Centrifuger les cellules à 178 x g pendant 3 min.
  4. Retirez le surnageant et ajouter 4 mL de FMC-HBSS mélanger par pipetage. Puis, calculez la densité cellulaire, comme indiqué au point 1.2.10.
  5. Transférer 5 x 106 cellules dans un tube de 1,5 mL et centrifuger à 1 677 x g pendant 1 min.
  6. Retirez le surnageant, ajouter 100 μL de solution de transfection avec supplément et 3 μg de plasmides d’ADN codant EGFP ou EGFP-AP180 C-terminale et la composition de pipetage.
  7. Transférer la solution ci-dessus (point 6.6) dans une cuvette certifiée et transfecter avec un électroporateur, selon le protocole du fabricant.
  8. Immédiatement après la transfection, ajouter 500 μl de milieu A dans la cupule et transvaser la solution dans un tube de 1,5 mL avec une pipette certifié. Puis, calculez la densité cellulaire, comme indiqué au point 1.2.10.
  9. Culture de cellules d’une lame de 8 puits de culture à 0,8 x 104 cellules/puits, comme indiqué aux paragraphes 1.2.11 et 1.2.12.
  10. Après 4 jours de culture cellulaire, effectuer un dosage de l’effondrement comme indiqué au point 1.3.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans ce protocole, Aβ1-42 est incubé à 37 ° C pendant 7 jours avant de l’utiliser, parce que l’incubation de Aβ1-42 était nécessaire pour produire des formes toxiques27,28,30,35. Après l’incubation, formes globales d’Aβ ont été observés (Figure 1 a). Il a été signalé que l’incubation similaire de Aβ1-42 produit la forme de fibrilles...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole décrit dans la présente étude a permis l’observation de phénomènes précoces dans les cônes de croissance axonale après traitement Aβ1-42. Aβ1-42 induite par endocytose dans les cônes de croissance axonale dans les 20 min et effondrement de cône de croissance a été observée dans 1 h de traitement. Cette endocytose a été probablement véhiculée par la clathrine. En utilisant ce protocole, l’inhibition de l’endocytose clathrine a été confirmée pour empêcher l’effondrement de cône de croissance induite par l’Aβ1-...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’auteur n’a rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été partiellement pris en charge par des subventions de recherche du JSPS (KAKENHI 18K 07389), Japon, Takeda (FNS), le Japon et Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd., Japon.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
souris ddYSLC
Lame de culture à huit puitsFalcon354108
poly D lysineWako168-19041
Milieu de culture, milieu neurobasalGibco21103-049
sérum domestiqueGibco26050-088
glucoseWako049-31165
L-glutamineWako074-00522
0,05 % trypsineGibco25300-054
DNase IWorthingtonDP
inhibiteur de la trypsine de sojaGibco17075-029
Filtre avec 70 µ ; m taille de maille, filtre cellulaireFalcon352350
B-27 supplémentGibco17504-044
CO2 incubateurAstecSCA-165DS
Amyloïde &beta ; 1-42Sigma-AldrichA9810
paraformaldéhydeWako162-16065
saccharose  ;Wako196-00015
Milieu d’enrobage aqueux, Aqua-Poly/Mountpolysciences18606-20
Microscope inversé ACarl ZeissAxio Observer Z1  ;Connecté avec AxioCam MRm, l’unité de chauffage XL S, le module CO2 S1 et le module Temp S1
Objectif Plan-Apochromat 20xCarl Zeiss420650-9901
Objectif Plan-Apochromat 63xCarl Zeiss440762-9904
Objectif, CFI Plan Apo Lambda 40XNikon
anti-MAP2 IgGAbcamab32454
anti-tau-1 IgGChemiconMAB3420
anticorps anti-amyloïde &bêta ;IBL10379clone 11A1
sérum de chèvre normalWako143-06561
sérum de bovin albumineWako010-25783
t-octylphénoxypolyéthoxyéthanolWako169-21105
IgG anti-souris de chèvre conjugué à AlexaFluor 594InvitrogenA11032
IgG anti-lapin de chèvre conjugué à AlexaFluor 488InvitrogenA11029
plaque chauffanteNISSINNHP-M30N
verre de couvertureFisher Scientific12-545-85
Antenne parabolique 35 mmIWAKI1000-035
Silicone RTVShin-EtsuKE42T
poinçon à mainRoper WhitneyNo.
Sonde à membrane de fluorescence, FM1-43FXInvitrogenF35355
Ca2+- et Mg2+-free Solution saline équilibrée de HanksGibco14175-095
Solution de transfection, solution nucléofectriceLonzaVPG-1001
Électroporateur, Nucleofector IAmaxa
Microscope inversé BKeyenceBZ-X710
Logiciel d’image, ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
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Références

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