Reconstitution du cycle cellulaire Oscillations Microemulsions des extraits d’oeufs acellulaire Xenopus

Résumé

Nous présentons une méthode pour la production d’in vitro auto-entretenue oscillations mitotique au niveau unicellulaire en encapsulant les extraits d’oeufs de Xenopus laevis dans eau-dans-huile microémulsions.

Résumé

Mesure en temps réel des oscillations au niveau unicellulaire est important afin de découvrir les mécanismes de l’horloge biologique. Bien que les extraits en vrac préparés à partir d’oeufs de Xenopus laevis ont été puissantes en disséquant les réseaux biochimiques sous-jacentes de la progression du cycle cellulaire, leur mesure moyenne de l’ensemble mène habituellement à une oscillation amortie, en dépit de chacun chaque oscillateur étant maintenue. C’est en raison de la difficulté d’une synchronisation parfaite entre les oscillateurs individuels dans les systèmes biologiques bruyants. Pour récupérer la dynamique de cellules individuelles de l’oscillateur, nous avons développé un système de cellule artificielle axée sur les gouttelettes qui peut reconstituer les cycles mitotiques dans les compartiments alvéolaire encapsulant cyclisme extraits cytoplasmiques des oeufs de Xenopus laevis . Ces cellules cytoplasmiques seule simples pièce oscillations soutenues pendant plus de 30 cycles. Pour construire des cellules plus complexes avec des noyaux, nous avons ajouté la chromatine de sperme demembranated pour déclencher des noyaux auto-assemblage dans le système. Nous avons observé une évolution périodique du chromosome condensation/décondensation et noyaux enveloppent ventilation/reformation, comme de véritables cellules. Cela indique que l’oscillateur mitotique fonctionne fidèlement pour piloter plusieurs événements mitotiques en aval. En même temps, nous avons suivi la dynamique de l’oscillateur mitotique et des processus en aval dans les gouttelettes individuels à l’aide de la microscopie en fluorescence Time-lapse multicanaux. Le système cell-cycle artificiel fournit un cadre de haut-débit pour manipulation quantitative et l’analyse des oscillations mitotiques résolution unicellulaire, qui probablement fournit des renseignements importants sur les mécanismes réglementaires et les fonctions de l’horloge.

Introduction

Extraits cytoplasmiques, préparés à partir d’oeufs de Xenopus laevis représentent un des modèles plus prédominants pour l’étude biochimique des cycles cellulaires, étant donné le volume important d’ovocytes, la progression du cycle cellulaire rapide et la capacité de reconstitution événements mitotique in vitro^1,2. Ce système a permis la découverte initiale et la caractérisation mécaniste des régulateurs de cycle cellulaire essentiel comme facteur favorisant la maturation (MPF) ainsi que des processus mitotiques en aval, y compris la broche Assemblée et chromosome ségrégation

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université du Michigan.

1. préparation des matériaux de Reconstitution du Cycle cellulaire et de détection

1. Assemblée de Gibson clonage pour la construction de l’ADN de plasmide et purification d’ADN messagère de securin-mCherry
   1. Préparer trois fragments d’ADN dont une pMTB2 vecteur colonne vertébrale, securin et mCherry par l’intermédiaire de réaction en chaîne par polymérase (PCR) et gel purification^21,22.
   2. Mesurer les c....

Résultats

Dans la Figure 2, nous montrent que ce protocole produit des oscillations mitotiques dans les cellules simples, dénucléarisé ainsi que compliqué des cellules avec des noyaux, où l’oscillateur pousse l’alternance cyclique de déformation et de la formation des noyaux. Les gouttelettes de noyaux libres génèrent mitotiques oscillations jusqu'à 30 cycles non amortie pendant la période de 92 heures, comme en témoigne la synthèse périodique et la dégradation d’une f.......

Discussion

Nous avons présenté une nouvelle méthode pour développer un système de cellule artificielle haut débit cette reconstitution in vitro permet et le suivi à long terme des oscillations auto-entretenue cycle cellulaire au niveau de single-cell. Il y a plusieurs étapes critiques qui font de cette méthode avec succès. Oeufs de Xenopus tout d’abord, fraîchement pressés avec une bonne qualité, comparativement aux œufs, ont tendance à produire des extraits avec activité d’oscillation de plus longue durée. Deuxiè.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Xenopus laevis grenouilles	Xenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep	kit QIAGEN	27104
QIAquick PCR Purification Kit (250)	QIAGEN	28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit	Ambion	AM1340
BL21 (DE3)-T-1 cellule compétente	Sigma-Aldrich	B2935
Ionophore de calcium	Sigma-Aldrich	A23187
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261	Trichloro
	toxique Sigma-Aldrich	448931	Toxique
(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyle) silane
PFPE-PEG tensioactif	Ran Biotechnologies	008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
GE Healthcare Glutathion Sepharose 4B billes	Sigma-Aldrich	GE17-0756-01
Colonne-10	Sigma-Aldrich	GE17-0851-01
Tube miniature en verre creux VitroCom	VitroCom	5012
Stéréomicroscope Olympus SZ61	Microscope Olympus
Olympus IX83 Microscope
Olympus FV1200	Spectrophotomètre NanoDrop
	Thermofisher	ND-2000
0,4 mL Microtubes à capuchon pression	E& K Scientific	485050-B
Mini Kit d’ARN PureLink	ThermoFisher (Ambion)	12183018A
Fisherbrand Mélangeur Vortex Analogique	Fisher Scientific	2215365
Imaris		Bitplane Version 7.3	Logiciel d’analyse d’images

confocal Olympus