Method Article

Caractérisation physique à haute résolution des nanoparticules métalliques uniques

DOI:

10.3791/58257

⸱

June 28th, 2019

 ,  ,  , 
1Physical Measurement Laboratory, National Institute of Standards and Technology, 2Department of Chemical Engineering, Columbia University, 3Department of Applied Physics and Applied Math, Columbia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons un protocole pour détecter les grappes d'oxygène métalliques discrets, les polyoxométalates (POM), à la limite de molécule unique utilisant une plate-forme électronique nanopore biologique. La méthode fournit une approche complémentaire aux outils traditionnels de chimie analytique utilisés dans l'étude de ces molécules.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les molécules individuelles peuvent être détectées et caractérisées en mesurant le degré par lequel elles réduisent le courant ionique qui circule à travers un seul porre à l'échelle nanométrique. Le signal est caractéristique des propriétés physicochimiques de la molécule et de ses interactions avec le pore. Nous démontrons que le nanopore formé par la protéine bactérienne exotoxine Staphylococcus aureus alpha hémolysine (HL) peut détecter des polyoxométalates (POM, amas d'oxygène métallique anionique), à la limite de la molécule unique. En outre, les produits multiples de dégradation de l'acide 12-phosphotungstic POM (PTA, H3PW12O40) dans la solution sont simultanément mesurés. La sensibilité à une seule molécule de la méthode des nanopores permet de caractériser les POM à des concentrations significativement inférieures à celles requises pour la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN). Cette technique pourrait servir de nouvel outil pour les chimistes pour étudier les propriétés moléculaires des polyoxométals ou d'autres amas métalliques, pour mieux comprendre les processus synthétiques POM, et peut-être améliorer leur rendement. Hypothétiquement, l'emplacement d'un atome donné, ou la rotation d'un fragment dans la molécule, et l'état d'oxydation du métal pourraient être étudiés avec cette méthode. En outre, cette nouvelle technique a l'avantage de permettre la surveillance en temps réel des molécules en solution.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La détection des analytes biomoléculaires au niveau d'une seule molécule peut être effectuée en utilisant des nanopores et en mesurant les modulations de courant ionique. Typiquement, les nanopores sont divisées en deux catégories en fonction de leur fabrication : biologique (auto-assemblé à partir de protéines ou d'origami d'ADN)1,2,3, ou à l'état solide (parexemple,fabriqué avec outils de traitement des semi-conducteurs)4,5. Alors que les nanopores à l'état solide ont été suggérées comme potentiellement plus robustes physiquement et peuvent être utilisées sur un large éventail de conditions de solution, les nanopores protéiques offrent jusqu'à présent une plus grande sensibilité, une plus grande résistance à l'encrassement, une plus grande bande passante, une meilleure sélectivité, et un rapport signal/bruit plus élevé.

Une variété de canaux ioniques protéiques, tels que celui formé par Staphylococcus aureus -hémolysine , peut être utilisé pour détecter des molécules uniques, y compris les ions (parexemple, Het D)2,3, polynucléotides (ADN et ARN)6,7,8, ADN endommagé9, polypeptides10, protéines (pliées et dépliées)11, polymères (polyéthylène glycol et autres)12,13 , 14, nanoparticules d'or15,16,17,18,19, et d'autres molécules synthétiques20.

Nous avons récemment démontré que le nanopore de la LH peut également facilement détecter et caractériser les amas métalliques, les polyoxométalates (POM), au niveau d'une seule molécule. Les POM sont des grappes d'oxygène métalliques anioniques discrètes qui ont été découvertes en 182621,et depuis lors, beaucoup plus de types ont été synthétisés. Les différentes tailles, structures et compositions élémentaires des polyoxométals qui sont maintenant disponibles ont conduit à un large éventail de propriétés et d'applications, y compris la chimie22,23, catalyse24, science des matériaux25 ,26, et la recherche biomédicale27,28,29.

La synthèse de POM est un processus d'auto-assemblage typiquement effectué dans l'eau en mélangeant les quantités stoichiométriques exigées des sels de métal monomeric. Une fois formés, les POM présentent une grande diversité de tailles et de formes. Par exemple, la structure de polyanion de Keggin, XM12O40q- est composée d'un hétéroatom (X) entouré de quatre oxygènes pour former un tétraèdre (q est la charge). L'hétéroatome est situé au centre d'une cage formée par 12 unités octaèdres MO6 (où les métaux de transition M dans leur état d'oxydation élevé), qui sont liés les uns aux autres par les atomes d'oxygène partagés voisins. Tandis que la structure de polyoxometalates de tungstène est stable dans des conditions acides, les ions hydroxydes mènent au clivage hydrolytique des liaisons métal-oxygène (M-O)30. Ce processus complexe entraîne la perte d'une ou de plusieurs sous-unités octaèdres MO 6, entraînant la formation d'espèces monovacants et trivacantes et, éventuellement, la décomposition complète des MA. Notre discussion ici se limitera aux produits de décomposition partielle de l'acide 12-phosphotungstic au pH 5.5 et 7.5.

L'objectif de ce protocole est de détecter des grappes d'oxygène métalliques discrètes à la limite d'une seule molécule à l'aide d'une plate-forme électronique biologique à base de nanopore. Cette méthode permet la détection des amas métalliques en solution. Plusieurs espèces en solution peuvent être discriminées avec une plus grande sensibilité que les méthodes analytiques conventionnelles33. Avec elle, les différences subtiles dans la structure de POM peuvent être élucidées, et à des concentrations nettement inférieures à celles exigées pour la spectroscopie de RMN. Fait important, cette approche permet même la discrimination des formes iomériques de Na8HPW9O341.

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Protocol

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Note: Le protocole ci-dessous est spécifique au système Nanopatch DC electronic BioSciences (EBS). Cependant, il peut être facilement adapté à d'autres appareils d'électrophysiologie utilisés pour mesurer le courant à travers les membranes bicouches lipidiques planaires (chambre standard de membrane bicouche lipidique, géométrie u-tube, microcapillés tirés, etc.). L'identification des matériaux commerciaux et de leurs sources est donnée pour décrire les résultats expérimentaux. En aucun cas cette identification n'implique une recommandation du National Institute of Standards and Technology, ni qu'elle n'implique que les matériaux sont les meilleurs disponibles.

1. Préparation de solution et d'analyte

  1. Préparer toutes les solutions d'électrolytes avec de l'eau de 18 cm d'eau provenant d'un système de purification de l'eau de type 1 pour éliminer les traces d'espèces organiques, puis filtrer toutes les solutions d'électrolytes à l'intérieur d'un filtre à vide de 0,22 m immédiatement avant les enregistrements des canaux ioniques.
    Note: La qualité de l'eau est un facteur essentiel pour la stabilité et la longévité du système de nanopore membranaire.
  2. Type sauvage 'HL'.
    1. Suivez les précautions du SMDlors lors de la manipulation de la protéine toxine de la LSH.
    2. Mélanger la poudre monomérique monomérisée de type sauvage S. aureus etla poudre d'hémolyse avec 18 cm d'eau à 1 mg/mL. Distribuer de 10 à 30 aliquots l'échantillon dans des trompes de centrifugeuse cryo-sécuritaires, rapidement clignoter dans de l'azote liquide et ensuite stocker à -80 oC. Alternativement, utilisez l'heptameric préformé purifié HL31.
  3. Dissoudre le lipide 1,2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DPhyPC) à 0.2 mg/mL dans n-decane dans un flacon de scintillation en verre de 4 ml avec un capuchon polytetrafluoroethyleneeflon-enduit. Conserver la solution à 4 oC pour une utilisation répétée jusqu'à un mois.
  4. Préparer des solutions d'acide phosphotungstique.
    1. Suivez les précautions MSDS lors de la manipulation de la poudre d'acide phosphotungstic et préparer une solution de stock d'acide phosphotungstic 2 mM en dissolvant 57,6 mg de H3PW12O40 en 10 ml d'un NaCl 1 M et 10 mM NaH2PO4 solution, qui constitue la solution de stock.
    2. Prenez 5 ml de cette solution et ajustez le pH à 5,5 avec 3 M NaOH. Ajuster le pH des 5 ml de la solution de stock à 7,5 avec 3 M NaOH.
      Note: Au pH 5.5, l'acide 12-phosphotungstic (PTA, H3PW12O40) se décompose principalement dans l'anion monovacant [PW11O39]7-.

2. Assemblage de cellules d'essai

  1. Assembler la cellule d'essai selon les instructions du fabricant.
  2. Faire tremper un fil Ag/AgCl dans de l'eau de Javel (hypochlorite de sodium) pendant 10 minutes après l'avoir abrasé avec du papier de verre de 600 grains. Placez l'électrode à l'intérieur de la membrane de quartz nanopore (QNM).
  3. Placez une électrode cylindrique de granule AgCl encastrée dans un fil d'argent à l'extérieur du QNM.
  4. Une fois la cellule d'essai mise en place, activez le programme d'alimentation et d'acquisition de données. Assurez-vous que la lecture actuelle DC est 0 pA en l'absence de solution dans la cellule d'essai.
  5. Utilisez une seringue reliée à la cellule d'essai via une ligne fluide pour ajouter une solution d'électrolyte tamponnée au-dessus de la face du QNM et pour s'assurer que le courant ionique sature l'amplificateur. Si ce n'est pas le cas, le QNM peut être obstrué. Appliquer une tension pop (no 1 V) et/ou une pression supérieure à 300 mm Hg pour l'effacer. Si cela fonctionne, réduire la tension et la pression.

3. Formation de bicouches lipidiques

  1. Remplissez la solution dans la cellule de test afin que le niveau de solution soit bien au-dessus de la face du QNM. Ensuite, abaissez le niveau de la solution par seringue au-dessous de la face, de sorte que le courant diminue à zéro.
  2. Trempez une pointe de pipette de 10 l dans le flacon lipidique. Poussez sur l'extrémité arrière de la pointe de la pipette et appuyez sur le côté de la fiole pour enlever tous les lipides visibles.
  3. Touchez la pointe de la pipette sur l'interface air-eau de la solution dans la cellule d'essai lorsque le niveau de la solution est au-dessus du visage du QNM et attendez de deux à cinq minutes que le lipide se propage uniformément.
  4. Abaissez lentement le niveau de solution sous la face du QNM jusqu'à ce que le courant sature, puis augmentez lentement le niveau de la solution au-delà de la face du QNM pour former une membrane bicouche lipidique.
    1. Une fois qu'un bicouche semble se former(c.-à-d. quand le courant va à zéro), essayez de le faire éclater plusieurs fois en augmentant la pression et assurez-vous que le QNM n'est pas obstrué. Pour réformer la membrane bicouche lipidique, abaissez le niveau de solution sous la face du QNM et augmentez-le lentement.
  5. Si la membrane bicouche lipidique ne s'est pas formé la première fois, abaissez la solution sous le visage et soulevez-la à nouveau. S'il ne se forme pas après 3 essais, ajoutez plus de lipides comme décrit dans 3.2 et 3.3.
  6. Après avoir formé une membrane, définir le décalage actuel à zéro lorsque le potentiel appliqué est nul.

4. Formationde pore de HL

  1. Ajouter 2,5 ng d'échantillon de protéines heptamériques préformés purifiés (ou 250 ng de monomérique) à la cellule d'essai (volume de 200 oL) pour permettre la formation du canal.
  2. Augmenter la pression sur la bicouche avec une seringue étanche au gaz (Figure 1) après la formation d'une couche bicouche, pour élargir la membrane du QNM et faciliter l'insertion de nanopores. Augmenter la pression arrière appliquée généralement entre 40 et 200 mmHg, selon chaque QNM.
    Note: Le logiciel EBS a une fonction d'insertion automatisée qui applique un biais plus élevé (généralement 200 à 400 mV) pour induire la formation de pores, puis réduit automatiquement la tension désirée au biais de mesure une fois qu'un seul canal se forme.
  3. Après la formation d'un nanopore, réduire la pression arrière à environ la moitié de la pression d'insertion. Si plusieurs canaux sont observés, retirez-les en réduisant considérablement la pression.

5. Partitionnement de cluster métallique dans le Nanopore

  1. Pour tenir compte des déséquilibres des électrodes, définir la tension de compensation DC de telle sorte que lorsque le potentiel appliqué est réglé à zéro, il n'y a pas de courant mesuré.
  2. Avant d'ajouter l'échantillon de POM, effectuez une expérience de contrôle pour vous assurer qu'il n'y a pas de contaminants(p. ex.,trace zappons provenant d'une expérience précédente) dans le réservoir. Plus précisément, acquérir une trace de courant ionique sous un potentiel appliqué de 120 mV à -120 mV en l'absence de POM s'il n'y a pas de POM pour vérifier qu'il n'y a pas de blocus spontané actuel.
    Note: En raison de la structure asymétrique du canal de la LH (Figure 1), le magnitute du courant ionique variera pour les potentiels appliqués positifs et négatifs. Le rapport du courant mesuré au-dessus de cette tension appliquée est indicatif de l'orientation du nanopore HL dans la membrane.
  3. Ajouter l'échantillon de POM en rinçant le réservoir avec une solution métallique à grappes métalliques à une concentration de 1 à 5 mm. Vous pouvez également charger l'échantillon dans le capillaire avant l'assemblage cellulaire afin d'étudier le cloisonnement des POM à l'autre extrémité du canal de la LH.
  4. Enregistrez le courant ionique à l'aide du logiciel du fabricant pour détecter les blocages actuels transitoires causés par le cloisonnement des POM individuels dans le nanopore. Estimer les propriétés physiques et chimiques de la molécule à partir de la profondeur de blocus du courant ionique, de la fréquence des événements et de la répartition du temps de résidence des blocus.

6. Enregistrements et analyse de données ionchannel

  1. Acquérir les mesures ioniques de la série temporelle actuelle à l'aide d'un amplificateur à haut bruit et d'un système d'acquisition de données. Effectuer les mesures à une tension appliquée de -120 mV (par rapport au côté cis canal) pour chaque pH.
  2. Appliquer un filtre Bessel à faible passage de 100 kHz 8 pôles au signal, qui est ensuite numérisé à 500 kHz (soit 2 ms/point). Extraire les événements de la série chronologique et analyser les événements à l'aide de l'algorithme ADEPT dans le logiciel MOSAIC 32,33.

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Results

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Au cours des deux dernières décennies, des pores à l'échelle nanométrique de protéines membranaires ont été démontrés comme des capteurs polyvalents à une seule molécule. Les mesures basées sur les nanopors sont relativement simples à exécuter.  Deux chambres remplies de solution d'électrolyte sont séparées par un nanopore intégré dans une membrane lipidique isolante électrique. Un amplificateur de patch-clamp ou une alimentation externe offre un potentiel électrostatique à travers le nan...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En raison de leur charge anionique, les POM s'associent probablement aux contre-cations organiques par des interactions électrostatiques. Par conséquent, il est important d'identifier les conditions de solution appropriées et les bons environnements électrolytes (en particulier les cations en solution) pour éviter la formation complexe avec les POM. Une attention particulière est requise dans le choix de la mémoire tampon. Par exemple, le taux de capture des POM avec tris (hydroxyméthyl)aminométhane et les solutions tamp...

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous sommes reconnaissants pour le soutien financier de l'Organisation européenne de biologie moléculaire pour une bourse postdoctorale (à J.E.) et une subvention du NHGRI des NIH (à J.J.K.). Nous apprécions l'aide des professeurs Jingyue Ju et Sergey Kalachikov (Université Columbia) pour avoir fourni l'heptameric HL, et pour des discussions inspirantes avec le professeur Joseph Reiner (Virginia Commonwealth University).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nanopatch DC SystemElectronic Biosciences, Inc., EBS
Millipore LC-PAKvide Millipore
1,2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DPhPC)Avanti Polar Lipids, Albâtre, AL850356P
Décane, ReagentPlus, &ge ; 99 %,Sigma-AldrichD901
&alpha ; HLList Biological Laboratories, Campbell, CA
Fil AgAlfa Aesar
2 mm Ag/AgCl électrode disqueIn Vivo MetricE202
d’amplification à haute impédanceElectronic Biosciences, San Diego, CA
Cellules
d’essai en polycarbonate à quartz personnalisées
Traitement et analyse des données MOSAIChttps://pages.nist.gov/mosaic/
Acide phosphotungstique hydratéSigma-Aldrich455970
Chlorure de sodiumSigma-AldrichS3014
phosphate de sodium monobasique monohydratéSigma-Aldrich71507
Filtre à Système

References

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