Article de méthode

Un haut débit de luciferase pour évaluer la protéolyse de la PCSK9 protéase de simple-chiffre d’affaires

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DOI :

10.3791/58265

⸱

28 août 2018

 ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, Zuckerberg San Francisco General and University of California San Francisco, 2Department of Cellular and Molecular Pharmacology and Howard Hughes Medical Institute, University of California San Francisco

Dans cet article

Résumé

Ce protocole présente une méthode pour évaluer l’activité protéolytique d’une protéase intrinsèquement peu fréquentés, seul chiffre d’affaires dans un contexte cellulaire. Plus précisément, cette méthode est appliquée pour évaluer l’activité protéolytique de PCSK9, un facteur clé du métabolisme lipidique, dont l’activité protéolytique est requise pour sa fonction ultime hypercholestérolémique.

Résumé

Proprotéine convertase subtilisine/kexin type 9 (PCSK9) est une protéase de simple-chiffre d’affaires qui régule le taux de lipoprotéines de basse densité (LDL) de sérum et, par conséquent, les maladies cardiovasculaires. Bien que PCSK9 protéolyse est nécessaire pour son effet hypercholestérolémique complet, l’évaluation de sa fonction protéolytique est difficile : PCSK9 est connue uniquement en conjonction avec elle-même, subit une seul un chiffre d’affaires unique et après protéolyse, conserve son substrat dans son site actif comme auto-inhibiteur. Les méthodes présentées ici décrivent un test qui permet de surmonter ces défis. Le test se concentre sur la protéolyse intermoléculaire dans un contexte de base de cellules et clivage réussie de liens à l’activité de la luciférase sécrétées, qui peut être lues facilement dans le milieu conditionné. Via les étapes séquentielles de la mutagenèse, transfection transitoire et une lecture de la luciférase, le dosage peut sonder PCSK9 protéolyse dans des conditions d’une perturbation soit génétique ou moléculaire de manière haut débit. Ce système est bien adapté pour les deux l’évaluation biochimique des faux-sens cliniquement découverte single-nucléotides simples (SNP), ainsi que pour le dépistage des inhibiteurs de petites molécules de PCSK9 protéolyse.

Introduction

PCSK9 cible le récepteur des LDL (LDL-R) pour la dégradation, élever le taux de cholestérol LDL (LDL-C) et la conduite de maladie cardiaque athéroscléreuse1,2. PCSK9 ciblage thérapeutique solidement abaisser le LDL-C et améliorer les effets cardiovasculaires des patients, même quand on ajoute un traitement hypolipidémiant agressif avec statines3,4. Cependant, thérapies actuellement approuvées se limitent aux approches axées sur les anticorps et souffrent d’un manque de rentabilité de5,6. Pour résoudre ce problème, les alternatives thérapeutiques moins coûteux, un moyen d’identifier les patients susceptibles de gagner le plus d’avantages, ou les deux, sont nécessaires.

Approches de petit-molécule pourraient cibler PCSK9 intracellulaire, fournir une meilleure voie d’administration et réduire les coûts, rendant le « Saint Graal » dans cette zone7. Cependant, PCSK9 s’avère difficile à drogue de petites molécules. Comme une protéase, ciblant la fonction protéolytique de PCSK9 est une stratégie séduisante, comme self-protéolyse est l’étape cinétiquement limitante de PCSK9 maturation8 et est requise pour son effet maximal sur le LDL-R9. A ce jour, cependant, cette stratégie n’a pas été couronnée de succès, probablement en raison de la biochimie unique de PCSK9 : PCSK9 seulement se fend10, effectuant une réaction de simple-chiffre d’affaires, et après soi-clivage, la PCSK9 prodomain demeure lié au site actif comme une auto-inhibiteur11, empêchant l’affichage de toute autre activité de la protéase.

Cet article présente une méthode pour évaluer la fonction protéolytique PCSK9 en mode haut débit8. Par le biais de mutagenèse dirigée, enquêteurs peuvent utiliser ce test pour sonder les effets du codage SNP dans la clinique afin d’évaluer les effets sur la protéolyse, l’étape cinétiquement limitante de PCSK9 maturation. En outre, cette méthode sera utile dans la conception d’écrans de haut débit afin d’identifier des modulateurs de la protéolyse de PCSK9, qui devraient finalement perturbent la présentation de PCSK9 du LDL-r (et moduler l’effet hypercholestérolémiant de PCSK9) . Enfin, ce protocole peut être adapté aux autres protéases avec intrinsèquement faible activité, pourvu que i) une paire de substrat-protéase spécifique se retrouve, et ii) un point d’ancrage intracellulaire approprié peut être établi pour le substrat.

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Protocole

1. mutagenèse du vecteur de la protéase

  1. Conception et commande personnalisée-synthétisés oligonucléotides d’installer une mutation d’intérêt à l’aide d’une modification des protocoles de mutagenèse standard12. Des amorces de morue dessalées standards (sans purification supplémentaire) sont parfaitement acceptables.
    Remarque : Une approche générale aux conceptions de l’apprêt consiste à créer des amorces partiellement superposés comme indiqué au tableau 1, à l’aide d’une calculatrice de température (Tm) fusion spécifique à la polymérase d’intérêt.
  2. Mettre en place des réactions en chaîne par polymérase (PCR) pour la mutagénèse dirigée sur la glace, comme il est indiqué dans le tableau 2.
  3. Comme il est indiqué dans le tableau 3du cycle des RFT.
  4. Exécuter 2 à 5 µL de chaque PCR sur un gel d’agarose à 1 % et de visualiser les produits pour confirmer une amplification réussie.
    Remarque : Un ACP réussi indique une bande d’ADN unique, éminente dans le marqueur de taille approximative du gabarit (~7.8 Ko).
  5. Ajouter 0,5 µL (par réaction de 25 µL) du DpnI et incuber les échantillons à 37 ° C pendant 1 h.
  6. Transformer 2 µL de la réaction en chimiquement compétent Escherichia coli.
    Remarque : Une souche d’e. coli en pleine croissance réduira les temps d’incubation, mais toute souche clonage sera acceptable.
  7. Plaque des transformations sur une gélose Luria-Bertani (LB) contenant la carbénicilline de 50 à 100 µg/mL. Incuber les boîtes pendant une nuit à 37 ° C.
  8. Sélectionnez 2-4 colonies à grandir dans une culture à petite échelle (2 à 5 mL de milieu LB avec carbénicilline de 50 à 100 µg/mL). Incuber la culture à 37 ° C à 220 tr/mn jusqu'à ce qu’il est trouble.
  9. Isoler l’ADN des cellules à l’aide d’un kit de purification (c.-à-d., « miniprep ») ADN de plasmide selon les instructions du fabricant de plasmide. Quantifier la concentration d’ADN éluée à l’aide d’un spectrophotomètre microvolume.
  10. Séquencer l’ADN intensivement à l’aide d’un service de séquençage Sanger (par exemple un core ou l’installation commerciale) de plasmide. Préparer les échantillons d’ADN selon les spécifications du service. Amorces utilisées avec succès dans les réactions de séquençage préalable sont indiqués dans le tableau 4.
    Remarque : En raison de l’amplification par PCR du plasmide entier, le séquençage de toute la région codante de PCSK9 est recommandé pour chaque mutant.

2. high-throughput axée sur la luciférase protéolyse Assay

  1. Placage de cellules (jour 0)
    1. Utiliser des cellules HEK293T basse-passage pour des expériences et une culture de Dulbecco modifiés milieu Eagle (DMEM) avec 10 % sérum fœtal (SVF). Effectuer tous travail dans des conditions stériles sous une hotte de vitroplants de cellules jusqu’au moment d’analyser l’activité de la luciférase. Estimer le nombre de puits et de plaques nécessaires pour l’expérience, anticipant que transfections seront dérouleront en trois exemplaires pour chaque condition testée.
    2. Dissocier les cellules HEK293T d’une fiole de parent en les traitant avec un volume minimal de 0,05 % acide de trypsine-tétraacétique (EDTA) pour couvrir les cellules. Inactiver la trypsine-EDTA et 2 volumes de DMEM additionné de 10 % FBS et transfert les cellules dans un tube stérile. Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées (et coloration au trypan blue). Centrifuger le tube à 500 g pendant 5 min récupérer des cellules.
    3. Aspirer le milieu contenant la trypsine et reconstituer les cellules dans le milieu de culture à une concentration de 2 x 105 cellules/mL. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférer 100 µL de cellules dans chaque puits d’une plaque de 96 puits blanc (opaque bas), qui donne une concentration finale de semis de 2 x 104 cellules/puits.
      Remarque : Pour les premières expériences, il peut être utile amorcer en outre une soeur, clear-plaque 96 puits, afin de surveiller la croissance des cellules et l’adhérence au cours du protocole et le guide des pannes futures.
    4. Incuber les cellules à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 24 h.
    5. Préparer un plat principal des plasmides dans un format de 96 puits. Diluer chaque plasmide dans la mémoire tampon d’élution (Tris-HCl, pH 8,5) à 50 ng/µL dans un puits individuel d’une plaque de 96 puits.
      1. Préparer 4 puits de chaque pour le contrôle positif (WT) plasmide8, contrôle négatif (S386A) plasmide8et tampon sans plasmide (pour transfections simulées). Si les médicaments ou autres traitements cellulaires sont prévus, puis préparent le plat principal avec le plasmide contrôle positif (WT) dans chaque puits, ainsi que de 4 puits chacune le plasmide contrôle négatif (S386A) et le tampon sans plasmide.
  2. Transfection (jour 1)
    1. Préparer le mélange de transfection dans un format de plaque 96 puits à l’aide de plaques de 96 puits profonds puits. Effectuer les transfections en triple exemplaire, en veillant à préparer suffisamment réactifs pour tenir compte des pertes de pipetage et de transfert.
      Remarque : Les calculs suivants préparent suffisamment réactif pour exécuter une plaque à 96 puits en triple exemplaire (estimé prudemment pour 420 puits).
      1. Faire un mélange maître d’un réactif de transfection de lipides dilué, ajoutant 50,4 µL de réactif à 2050 µL de sérum réduit moyen. Faire un mélange maître d’un réactif de precomplexation d’ADN, ajoutant 33,6 µL de réactif en 1730 µL de sérum réduit moyen.
      2. À l’aide d’une pipette multicanaux, aliquote 16,8 µL du mélange réactif de precomplexation d’ADN dilué dans chaque puits de la plaque de fond de puits.
      3. À l’aide d’une pipette multicanaux, aliquote µL de 3,2 (160 ng) de chaque plasmide de la plaque maître dans chaque puits de la plaque de fond de puits.
      4. À l’aide d’une pipette multicanaux, aliquote 20 µL du mélange réactif dilué lipides transfection à chaque puits de la plaque et mélanger le contenu de chaque bien à l’aide de la pipette multicanaux. Recouvrir les plaques et les laisser reposer à température ambiante (RT) pendant 10-15 min pour former des complexes lipides : ADN.
        Remarque : Après la transfection, les derniers éléments / puits auront lieu comme suit : 40 ng d’ADN, 0,12 µL de réactif de transfection et 0,08 µL de réactif de pre-complexation de l’ADN et le contenu de chaque bien sera 10 µL volume total (moyenne réduite et le sérum).
    2. L’échange doucement le support sur les cellules 293 t dans les plaques de 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux, prenant soin de ne pas pour perturber les cellules. Remplacer le milieu atmosphérique avec 95 µL de DMEM supplémenté de 10 % FBS.
      Remarque : Ce serait une date appropriée pour traiter les cellules avec n’importe quel médicament d’intérêt.
    3. Ajouter 10 µL du mélange transfection dans chaque cas bien via une pipette multicanaux. Agiter doucement de la plaque pour mélanger le contenu dans les puits. Incuber les plaques à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 24 h.
      Remarque : Le volume final des puits vient à µL 105, pour tenir compte de l’évaporation sur 24 heures.
  3. Dosage (jour 2)
    1. Préparer une solution de coelenterazine réactifs : ascorbate de sodium 3M [dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), préparée frais] 5 M NaCl, 10 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA, dissous en PBS, préparés frais) et 2 mM coelenterazine (dissous dans méthanol acidifié contenant 200 µL de 3 HCl N / 10 mL).
      Remarque : La coelenterazine 2 mM peut être stocké pendant 2 semaines quand il est conservé à-80 ° C et en l’absence de lumière.
    2. Préparer 2 x coelenterazine réactifs pour la lecture de la luciférase, avec un réactif séparé chacun pour les cellules et le milieu, conformément au tableau 5. Mélanger tous les réactifs enregistrer la coelenterazine tout d’abord, filtrer le mélange à travers un filtre de seringue de 0,22 µm et puis ajoutez la coelenterazine. Protéger les réactifs de la lumière, jusqu'à ce qu’ils sont prêts à être ajoutés aux plaques.
      Remarque : En raison de la perte de la solution de filtration, faire assez réactif pour tenir compte de la perte de deux de filtration, ainsi que de transferts. Le tableau 5 montre la concentration finale de réactifs 2 x (ainsi que la quantité de solution mère à ajouter pour lire sur une plaque à 96 puits avec un réactif).
    3. Éliminer les cellules de l’incubateur 24h après la transfection. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférer 50 µL de milieu conditionné de chaque puits d’une plaque à 96 puits (opaque) fraîche, à fond blanc.
      1. Étiqueter les plaques que s’ils contiennent des moyennes ou des cellules. Si plus d’une plaque à 96 puits a été transfectée, étiqueter les plaques afin de garantir que chaque plaque contenant du milieu est jumelée avec sa plaque de parent de cellules.
    4. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 50 µL de 2 x non-lytique coelenterazine réactif dans la plaque contenant uniquement le milieu conditionné. Doucement, rock ou secouer la plaque en l’absence de la lumière pendant 5-10 min à température ambiante.
    5. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 50 µL de réactif de coelenterazine lytique 2 x la plaque contenant les cellules. Doucement, rock ou secouer la plaque en l’absence de la lumière pendant 5-10 min à température ambiante.
    6. Après l’incubation, lecture de la luminescence de la plaque support uniquement à l’aide d’un lecteur. Ensuite, lecture de la luminescence de la plaque contenant des cellules dans le même lecteur.
    7. Jeter les plaques et enregistrez les fichiers d’analyse des données.

3. analyse des données

  1. Effectuer une analyse de données initiale à l’aide du tableur. Créer une feuille de calcul contenant les résultats de la cellule et les plaques moyennes.
  2. Inspecter manuellement les données sur les plaques de la cellule pour identifier des puits mal transfectées. Puits qui montrent < 5 % - 10 % de la lecture du plasmide contrôle négatif (S386A) devrait être considérés comme aussi mal transfectées, rendant l’interprétation de ces données suspect.
  3. Calculer la luminescence de fond moyenne de chaque plaque provenant des puits transfectées mock. Soustraire le fond de chaque plaque à partir des valeurs de cette plaque.
    Remarque : Cette valeur peut être négligeable selon le lecteur utilisé.
  4. Traiter les données en calculant la proportion de l’activité de la luciférase dans le milieu par rapport à l’activité de la luciférase globale pour chaque puits. Parce que la plaque cellulaire contient les deux milieu conditionné en plus de cellules, et la plaque de support seule contienne la même quantité de milieu conditionné comme la plaque cellulaire, il convient d’utiliser l’équation suivante :
    figure-protocol-1
    Ici, RLU = unités de luminescence relative, l’affichage de la soustrait au fond du lecteur de plaque.
  5. Calculer la moyenne luciférase sécrété du contrôle positif (WT) et les puits de contrôle négatif (S386A).
  6. Évaluer la qualité globale de l’expérience en calculant un facteur Z13:
    figure-protocol-2
    Remarque : Les valeurs actives proviennent du contrôle positif (WT) et les valeurs inactives proviennent des puits témoin négatif (S386A). Valeurs plus proches à 1 indiquent une qualité supérieure expérimentale. Envisager la répétition de l’expérience ou en optimisant le flux de travail si la valeur est inférieure à 0.
  7. Transférer les données du programme de feuille de calcul dans le logiciel d’analyse de données scientifiques.
  8. Normaliser l’activité de la luciférase sécrétée pour les valeurs moyennes du contrôle positif (WT) et le contrôle négatif (S386A), définissant le contrôle positif comme le 1 et le contrôle négatif comme 0.
  9. Nettoyer les données pour les valeurs aberrantes en utilisant la méthode de régression et aberrantes enlèvement (déroute), fixant le taux de découverte de faux maximum à 1 %.
  10. Évaluer les différences statistiquement significatives en comparant les données pour chaque condition de mutant (ou mutant) à la moyenne de l’activité WT (normalisée à une valeur de 1). Effectuer plusieurs non-appariés t-tests, correction des comparaisons multiples à l’aide de la méthode Holm-Sidak et α = 0,05.

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Résultats

Le dosage de la protéolyse du haut débit dépend de surmonter trois défis majeurs. Tout d’abord, pour pallier la sortie intrinsèquement faible d’une protéase de PCSK9 single-chiffre d’affaires, une protéase de PCSK9 manque l’inhibiteur prodomain sert, avec la séquence de clivage à la queue de le prodomain liée à une luciférase qui peut être sécrétées14. Deuxièmement, pour répondre au besoin de la protéase à plier complexe avec ses inhibiteurs prodomain, que sont les...

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Discussion

Les procédures expérimentales décrites ci-dessus présentent une méthode pour surmonter l’intrinsèquement faible activité de la protéase de simple-chiffre d’affaires PCSK9 et évaluer sa fonction protéolytique de manière robuste. Le concept clé de l’analyse repose sur la conversion d’un événement unique-chiffre d’affaires en un affichage amplifié enzymatiquement. Les points forts de l’analyse sont relativement court délai et facilité d’utilisation de la luciférase journaliste, ainsi que son évolutivité à haut débit des app...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient le généreux soutien financier du NHLBI/NIH (K08 HL124068 et LRP HMOT1243), NCATS/NIH par le biais de l’UCSF clinique et translationnelle Science Institute programme catalyseur (UL1 TR000004), le Sénat académique UCSF, la Fondation de Hellman, un Gilead Sciences Research Scholar Award, un prix cardiovasculaire de Pfizer ASPIRE (tout John S. Chorba) et le Howard Hughes Medical Institute (à Adri M. Galvan et Kevan M. Shokat).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes PCRUSA Scientific1402-2900Pour PCR
Q5 Démarrage à chaudNew England BiolabsM0493Ld’ADN polymérase haute fidélité
New England BiolabsN0447LdNTPs (pour PCR)
pPCSK9-NLucProteaseAssay-WTAuteursn/aDisponible auprès des auteurs
pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386AAuteur(s) n/aDisponible auprès des auteur(e
)s Agarose LEGold BiotechnologyA-201-100Pour les gels d’ADN
E-Gel Imager System with Blue Light BaseThermoFisher Scientific4466612Pour l’imagerie des gels d’ADN
SYBR Safe DNA Gel StainThermoFisher ScientificS33102Pour les gels d’ADN
Tris BaseThermoFisher ScientificBP152-1Pour le tampon de fonctionnement de gel d’ADN
Acide acétique glacialThermoFisher ScientificA38-500Pour le tampon de fonctionnement de gel d’ADN
Solution d’acide éthylènediaminetétraacétiqueMillipore Sigma3690EDTA, pour le tampon de fonctionnement de gel d’ADN
1 kb Échelle d’ADNGold BiotechnologyD010
DpnINew England BiolabsR0176SEnzyme de restriction
Plaques d’agar LB avec 100 & micro ; g/mL de carbénicillineTeknovaL1010LB-Carb plaques
One Shot Mach1 T Résistant aux phages Chimiquement compétent E. coliThermoFisher ScientificC862003Cellules chimiquement compétentes
LB Broth, MillerThermoFisher ScientificBP1426-2LB
CarbenicillineGold BiotechnologyC-103-5Antibiotique
E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit IOmega BioTekD6942-02Purification de l’ADN Miniprep Kit
NanoDrop 2000 SpectrophotomètreThermoFisher ScientificND-2000CCellules
293TAmerican Tissue Culture Collection (ATCC)CRL-3216HEK 293T cellules
DMEM, glucose élevé, pyruvateThermoFisher Scientific11995065DMEM, cellule de mammifère Sérum
fœtal bovin AxeniaBiologixF001FBS
Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénolThermoFisher Scientific25300062Trypsine, pour la dissociation cellulaire
Saline tamponnée au phosphate (PBS)ThermoFisher Scientific10010023PBS
Compteur de cellules automatisé CountessThermoFisher ScientificC10227Comptage automatisé des cellules
Lames de chambre de comptage de cellules CountessThermoFisher ScientificC10228Lames pour le comptage de cellules
CELLSTAR Plaques de culture de tissus, blanches, à fond blanc, avec couvercleGrenier Bio-One655083blanche, à fond blanc Plaque de PCR 96
puits sans jupe TempPlate non jupe 96 puits, naturelleUSA Scientific1402-9596Plaque à 96 puits pour plaque plasmidique maîtresse
Nunc 2.0mL DeepWell PlaquesThermoFisher Scientific278743Plaque à puits profond de 96 puits
Lipofectamine 3000ThermoFisher ScientificL3000008Réactif de transfection lipidique, réactif Lf3K
P3000Réactif de pré-complexationde l’ADNThermoFisher Scientific
milieu sérique réduit Lf3K OptiMEM I ThermoFisherScientific31985062milieu sérique réduit pour transfection
(+)-L-ascorbate de sodiumMillipore SigmaA4034Ascorbate de sodium
Chlorure de sodiumMillipore SigmaS9888NaCl
Albumine, sérum bovin, fraction V, faible teneur en métaux lourdsMillipore Sigma12659BSA
Méthanol (HPLC)ThermoFisher ScientificA4524MeOH
Acide chlorhydriqueVWRJT9535-2Concentré HCl
CoelenterazineGold BiotechnologyCZ2.5Substrat de luciférase
Filtre à seringue, stérileThermoFisher Scientific09-720-3Filtre stérile, PVDF, 0.22 & micro ; m pore
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+Rainin17013810Pipette multicanaux
Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+Rainin17013808Pipette multicanaux
Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+Rainin17013807Pipette multicanaux
Réservoir de réactifsCorning4870Auge pour réactifs
Tubes à centrifuger, 15 mLThermoFisher Scientific05-539-12Tubes de 15 mL
Tubes à centrifuger, 50 mLCorning430829tubes de 50 mL
Spark Microplate ReaderTecanN/ALecteur de plaques
ExcelMicrosoft2016 pour MacLogiciel de tableur
PrismGraphPad Softwarev7Logiciel d’analyse de données scientifiques
Mélange de solution de désoxynucléotide sélectif L3000008, fourni avec

Références

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Mots-clés

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