Un haut débit de luciferase pour évaluer la protéolyse de la PCSK9 protéase de simple-chiffre d’affaires

Résumé

Ce protocole présente une méthode pour évaluer l’activité protéolytique d’une protéase intrinsèquement peu fréquentés, seul chiffre d’affaires dans un contexte cellulaire. Plus précisément, cette méthode est appliquée pour évaluer l’activité protéolytique de PCSK9, un facteur clé du métabolisme lipidique, dont l’activité protéolytique est requise pour sa fonction ultime hypercholestérolémique.

Résumé

Proprotéine convertase subtilisine/kexin type 9 (PCSK9) est une protéase de simple-chiffre d’affaires qui régule le taux de lipoprotéines de basse densité (LDL) de sérum et, par conséquent, les maladies cardiovasculaires. Bien que PCSK9 protéolyse est nécessaire pour son effet hypercholestérolémique complet, l’évaluation de sa fonction protéolytique est difficile : PCSK9 est connue uniquement en conjonction avec elle-même, subit une seul un chiffre d’affaires unique et après protéolyse, conserve son substrat dans son site actif comme auto-inhibiteur. Les méthodes présentées ici décrivent un test qui permet de surmonter ces défis. Le test se concentre sur la protéolyse intermoléculaire dans un contexte de base de cellules et clivage réussie de liens à l’activité de la luciférase sécrétées, qui peut être lues facilement dans le milieu conditionné. Via les étapes séquentielles de la mutagenèse, transfection transitoire et une lecture de la luciférase, le dosage peut sonder PCSK9 protéolyse dans des conditions d’une perturbation soit génétique ou moléculaire de manière haut débit. Ce système est bien adapté pour les deux l’évaluation biochimique des faux-sens cliniquement découverte single-nucléotides simples (SNP), ainsi que pour le dépistage des inhibiteurs de petites molécules de PCSK9 protéolyse.

Introduction

PCSK9 cible le récepteur des LDL (LDL-R) pour la dégradation, élever le taux de cholestérol LDL (LDL-C) et la conduite de maladie cardiaque athéroscléreuse^1,2. PCSK9 ciblage thérapeutique solidement abaisser le LDL-C et améliorer les effets cardiovasculaires des patients, même quand on ajoute un traitement hypolipidémiant agressif avec statines^3,4. Cependant, thérapies actuellement approuvées se limitent aux approches axées sur les anticorps et souffrent d’un manque de rentabilité de^5,6. Pour r....

Protocole

1. mutagenèse du vecteur de la protéase

1. Conception et commande personnalisée-synthétisés oligonucléotides d’installer une mutation d’intérêt à l’aide d’une modification des protocoles de mutagenèse standard¹². Des amorces de morue dessalées standards (sans purification supplémentaire) sont parfaitement acceptables.
   Remarque : Une approche générale aux conceptions de l’apprêt consiste à créer des amorces partiellement superposés comme indiqué au tableau 1, à l’aide d’une calculatrice de température (T_m) fusion spécifique à la polymérase d’intérêt.
2. Mettre en place des réactions en chaîne par poly....

Résultats

Le dosage de la protéolyse du haut débit dépend de surmonter trois défis majeurs. Tout d’abord, pour pallier la sortie intrinsèquement faible d’une protéase de PCSK9 single-chiffre d’affaires, une protéase de PCSK9 manque l’inhibiteur prodomain sert, avec la séquence de clivage à la queue de le prodomain liée à une luciférase qui peut être sécrétées¹⁴. Deuxièmement, pour répondre au besoin de la protéase à plier complexe avec ses inhibiteurs prodomain, que sont les.......

Discussion

Les procédures expérimentales décrites ci-dessus présentent une méthode pour surmonter l’intrinsèquement faible activité de la protéase de simple-chiffre d’affaires PCSK9 et évaluer sa fonction protéolytique de manière robuste. Le concept clé de l’analyse repose sur la conversion d’un événement unique-chiffre d’affaires en un affichage amplifié enzymatiquement. Les points forts de l’analyse sont relativement court délai et facilité d’utilisation de la luciférase journaliste, ainsi que son évolutivité à haut débit des app.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes PCR	USA Scientific	1402-2900	Pour PCR
Q5 Démarrage à chaud	New England Biolabs	M0493L	d’ADN polymérase haute fidélité
	New England Biolabs	N0447L	dNTPs (pour PCR)
pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT	Auteurs	n/a	Disponible auprès des auteurs
pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A	Auteur(	s) n/a	Disponible auprès des auteur(e
)s Agarose LE	Gold Biotechnology	A-201-100	Pour les gels d’ADN
E-Gel Imager System with Blue Light Base	ThermoFisher Scientific	4466612	Pour l’imagerie des gels d’ADN
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher Scientific	S33102	Pour les gels d’ADN
Tris Base	ThermoFisher Scientific	BP152-1	Pour le tampon de fonctionnement de gel d’ADN
Acide acétique glacial	ThermoFisher Scientific	A38-500	Pour le tampon de fonctionnement de gel d’ADN
Solution d’acide éthylènediaminetétraacétique	Millipore Sigma	3690	EDTA, pour le tampon de fonctionnement de gel d’ADN
1 kb Échelle d’ADN	Gold Biotechnology	D010
DpnI	New England Biolabs	R0176S	Enzyme de restriction
Plaques d’agar LB avec 100 & micro ; g/mL de carbénicilline	Teknova	L1010	LB-Carb plaques
One Shot Mach1 T Résistant aux phages Chimiquement compétent E. coli	ThermoFisher Scientific	C862003	Cellules chimiquement compétentes
LB Broth, Miller	ThermoFisher Scientific	BP1426-2	LB
Carbenicilline	Gold Biotechnology	C-103-5	Antibiotique
E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I	Omega BioTek	D6942-02	Purification de l’ADN Miniprep Kit
NanoDrop 2000 Spectrophotomètre	ThermoFisher Scientific	ND-2000C	Cellules
293T	American Tissue Culture Collection (ATCC)	CRL-3216	HEK 293T cellules
DMEM, glucose élevé, pyruvate	ThermoFisher Scientific	11995065	DMEM, cellule de mammifère Sérum
fœtal bovin Axenia	Biologix	F001	FBS
Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénol	ThermoFisher Scientific	25300062	Trypsine, pour la dissociation cellulaire
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023	PBS
Compteur de cellules automatisé Countess	ThermoFisher Scientific	C10227	Comptage automatisé des cellules
Lames de chambre de comptage de cellules Countess	ThermoFisher Scientific	C10228	Lames pour le comptage de cellules
CELLSTAR Plaques de culture de tissus, blanches, à fond blanc, avec couvercle	Grenier Bio-One	655083	blanche, à fond blanc Plaque de PCR 96
puits sans jupe TempPlate non jupe 96 puits, naturelle	USA Scientific	1402-9596	Plaque à 96 puits pour plaque plasmidique maîtresse
Nunc 2.0mL DeepWell Plaques	ThermoFisher Scientific	278743	Plaque à puits profond de 96 puits
Lipofectamine 3000	ThermoFisher Scientific	L3000008	Réactif de transfection lipidique, réactif Lf3K
P3000	Réactif de pré-complexation	de l’ADN	ThermoFisher Scientific
milieu sérique réduit Lf3K OptiMEM I ThermoFisher	Scientific	31985062	milieu sérique réduit pour transfection
(+)-L-ascorbate de sodium	Millipore Sigma	A4034	Ascorbate de sodium
Chlorure de sodium	Millipore Sigma	S9888	NaCl
Albumine, sérum bovin, fraction V, faible teneur en métaux lourds	Millipore Sigma	12659	BSA
Méthanol (HPLC)	ThermoFisher Scientific	A4524	MeOH
Acide chlorhydrique	VWR	JT9535-2	Concentré HCl
Coelenterazine	Gold Biotechnology	CZ2.5	Substrat de luciférase
Filtre à seringue, stérile	ThermoFisher Scientific	09-720-3	Filtre stérile, PVDF, 0.22 & micro ; m pore
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+	Rainin	17013810	Pipette multicanaux
Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+	Rainin	17013808	Pipette multicanaux
Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+	Rainin	17013807	Pipette multicanaux
Réservoir de réactifs	Corning	4870	Auge pour réactifs
Tubes à centrifuger, 15 mL	ThermoFisher Scientific	05-539-12	Tubes de 15 mL
Tubes à centrifuger, 50 mL	Corning	430829	tubes de 50 mL
Spark Microplate Reader	Tecan	N/A	Lecteur de plaques
Excel	Microsoft	2016 pour Mac	Logiciel de tableur
Prism	GraphPad Software	v7	Logiciel d’analyse de données scientifiques

Mélange de solution de désoxynucléotide sélectif L3000008, fourni avec