Une stratégie efficace pour générer des systèmes de Transcription binaire spécifique des tissus chez la drosophile par modification du génome

Summary

Nous présentons ici une méthode pour générer des systèmes de transcription binaire spécifique des tissus chez la drosophile en remplaçant le premier exon codante des gènes avec les pilotes de la transcription. La méthode CRISPR/Cas9 met une séquence transactivateur en vertu du règlement endogène d’un gène remplacé et par conséquent facilite transctivator expression exclusivement dans des modèles spatio-temporels de gène-spécifique.

Abstract

Systèmes de transcription binaires sont de puissants outils génétiques, largement utilisés pour visualiser et manipuler des cellules sort et l’expression génétique dans des groupes spécifiques de cellules ou tissus chez les organismes modèles. Ces systèmes contiennent deux composantes dans des lignes distinctes de transgéniques. Une ligne pilote exprime un activateur de la transcription sous le contrôle des promoteurs/exhausteurs de tissu-spécifiques et un ports de ligne journaliste/effecteur un gène cible placé en aval du site de liaison de l’activateur de transcription. Animaux hébergeant les deux composants induire la transactivation de tissu-spécifique d’une expression du gène cible. Expression spatio-temporelle précise du gène dans les tissus ciblés est critique pour l’interprétation impartiale de l’activité cellulaire/génétique. Par conséquent, l’élaboration d’une méthode pour générer les lignes exclusives spécifiques des cellules/tissus conducteur est essentiel. Nous présentons une méthode pour générer le système hautement spécifique aux tissus expression ciblée en employant un « groupés régulièrement Interspaced Short palindromique Repeat/CRISPR-associés » (CRISPR/AR)-base de génome édition technique. Dans cette méthode, l’endonucléase Cas9 est ciblé par deux chimérique guide RNAs (gRNA) à des sites spécifiques dans le premier exon codante d’un gène dans le génome de la drosophile pour créer des cassures double-brin (DSB). Par la suite, les mécanismes de réparation cellulaire autonome à l’aide d’un plasmide de donneurs exogènes qui contient la séquence de transactivateur, permet réparation axés sur l’homologie (HDR) de l’ORD, ayant pour résultat précise suppression et le remplacement de l’exon avec le transactivateur séquence. Le transactivateur frappé composant logiciel enfichable est exprimée exclusivement dans les cellules où le cis-éléments de régulation du gène remplacé sont fonctionnels. Le protocole étape par étape détaillé présenté ici pour générer un pilote binaire de transcriptional exprimé dans drosophile fgf/sans branches-produisant des cellules épithéliales/neuronales peut être adoptée pour n’importe quelle expression de gène - ou tissu-spécifique.

Introduction

La boîte à outils génétique pour l’expression des gènes ciblés a été bien développé chez la drosophile, ce qui en fait l’un des meilleurs systèmes de modèle pour étudier la fonction des gènes impliqués dans une grande variété de processus cellulaires. Systèmes d’expression binaire, telles que la levure Gal4/UAS (séquence activatrice en amont), a été adopté pour les études de piégeage et gène exhausteur de tissu-spécifiques dans la drosophile modèle génétique¹ (Figure 1). Ce système a facilité l’élaboration d’un grand nombre de techniques telles que le règlement spatio-temporelle de la sur....

Protocol

1. concevoir et construire le gRNA vecteur d’Expression

1. Pour justement remplacer une région bien définie d’un exon, utilisez un gRNA double approche⁶, dans lequel chaque gRNA peut cibler spécifiquement les deux extrémités de la région sélectionnée d’intérêt. Pour obtenir une expression spatio-temporelle précise de gène-spécifique du pilote, sélectionnez deux sites de cibles gRNA dans le premier exon codante du gène.
2. Pour Drosophila melanogaster, sélectionnez les sites cibles gRNA à l’aide de l’outil de recherche de cible optimale de le flyCRISPR (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/). Autres....

Results

Ce protocole a été utilisé avec succès pour générer une expression binaire ciblées journaliste système spécifique pour bnl exprimant les cellules⁵. Le cis-éléments de régulation (CREs) qui contrôlent l’expression spatio-temporelle complexe bnl ne sont pas caractérisés. Par conséquent, pour atteindre l’expression spatio-temporelle sous le contrôle de la séquence de réglementation endogène bnl , seulement le premier exon codage de .......

Discussion

Traditionnellement, pièges de renforceur de drosophile ont été générés par deux méthodes différentes. Une des façons comprend insertion aléatoire d’un conducteur (eg., Gal4) séquence du génome par transposition (e.g., transposition de l’élément P)¹ . Par ailleurs, les séquences de conducteur peuvent être placés sous le contrôle transcriptionnel d’une région d’enhancer/promoteur présumé dans une construction de plasmide, qui serait ensuite intégrée dans un site ectopique .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
X-Gal/IPTG	Gentrox (Genesee Scientific)	18-218	clonage
LB-Agar	BD Difco	BD  ; 244520	clonage
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Biologie moléculaire
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Biologie moléculaire
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Biologie moléculaire
UltraPure DNase/RNase-Free	Water ThermoFisher Scientific	10977-023	Biologie moléculaire
10 % SDS	Sigma Aldrich	71736	Biologie moléculaire
KOAc	Fisher-Scientific	P1190	Biologie moléculaire
EtOH	Fisher-Scientific	04-355-451	Biologie moléculaire
GeneJET Miniprep	ThermoFisher Scientific	K0503	Miniprep
PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits	ThermoFisher Scientific	K210006	Maxiprep
BbsI	NEB	R0539S	Enzyme de restriction
Amorces	IDT-DNA		PCR
pCFD4	Kornberg Lab		Modèle d’ADN et vecteur pour ARNg
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)	Kapa biosystems	KK2601	PCR
Q5-high fidelity Taq	NEB	NEB #M0491	PCR
Gibson Assembly Master Mix	NEB	NEB #E2611	Assemblage de l’ADN
pBPnlsLexA :p65Uw	Modèle d’ADN Addgene		pour l’amplification LexA
Protéinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Biologie moléculaire
2x PCR PreMix, avec colorant (rouge)	Sydlab	MB067-EQ2R	Biologie moléculaire
Kit d’élution de gel	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-300	Biologie moléculaire
Réactif	TRISigma-Aldrich		Biologie moléculaire
Kits de purification d’ARN Direct-zol	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-330	Biologie moléculaire
OneTaq One-Step RT-PCR Kit	NEB	E5315S	Biologie moléculaire
lexO-CherryCAAX	Kornberg Lab		Fly line
UAS-CD8 :GFP	Kornberg lab		Ligne de mouche
btl-Gal4	Kornberg lab		Mouche
Mouche MKRS/TB6B	Kornberg		lab.
Mouche Microscope confocal SP5X	Leica		Imagerie motif d’expression
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU
Microscope Olympus		SZ-61	pushing
Pilons homogénéisants à microtubes	Fisher-Scientific	03-421-217	isolement de l’ADN génomique
Spectrophotomètre NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-1000	quantification de l’ADN