Method Article

Efficace et évolutive différenciation dirigée de cliniquement compatibles cornéenne limbique épithéliales cellules souches à partir des cellules souches pluripotentes humaines

DOI:

10.3791/58279

⸱

October 24th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1BioMediTech Institute, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Department of Ophthalmology, SILK, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole présente une méthode simple en deux étapes afin de différencier les cellules souches épithéliales cornéennes limbique de cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de culture acellulaire xeno - et chargeur. Les méthodes de culture cellulaire présentés ici permettent une production rentable, à grande échelle des cellules qualité clinique applicables à l’utilisation de la thérapie des cellules cornéenne.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellules souches épithéliales limbique cornée (LESCs) sont responsables de la renouveler en permanence l’épithélium cornéen et maintenant ainsi l’homéostasie cornéenne et une clarté visuelle. Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC)-LESCs dérivées fournissent une source prometteuse de la cellule pour la thérapie de remplacement de cellules cornéennes. Conditions de culture et de la différenciation indéfinies, xénogéniques provoquent des variations dans les résultats de la recherche et entravent la traduction clinique de produits thérapeutiques dérivés de hPSC. Ce protocole prévoit une méthode reproductible et efficace pour la différenciation hPSC-LESC conditions xeno - et chargeur acellulaire. Tout d’abord, culture monocouche de hPSC indifférenciée sur recombinant laminin-521 (LN-521) et moyen défini hPSC sert de base pour une production robuste de haute qualité de matière première pour des différenciations. Deuxièmement, une méthode de différenciation rapide et simple hPSC-LESC donne des populations LESC en seulement 24 jours. Cette méthode comprend une induction surface ectodermique de quatre jours en suspension avec des petites molécules, suivie par phase de culture adhérent sur matrice de combinaison de LN-521/collagène IV dans un milieu défini différenciation épithéliale cornéenne. Cryostoring prolongée différenciation purifie la population cellulaire et permet aux banques de cellules de grandes quantités de produits de thérapie cellulaire. Les qualité qui en résulte hPSC-LESCs fournissent une stratégie de nouveau traitement potentiel pour la reconstruction de surface cornéenne traiter l’insuffisance limbique des cellules souches (LSCD).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cornée transparente à la surface oculaire permet à la lumière d’entrer dans la rétine et fournit la majorité du pouvoir de réfraction de le œil. La couche la plus externe, l’épithélium cornéen stratifié, est continuellement régénérée par les cellules souches épithéliales limbique (LESCs). Les LESCs se trouvent dans la couche basale des niches limbique à la jonction de corneoscleral1,2. LESCs n’ont pas des marqueurs spécifiques et uniques, donc leur identification nécessite une analyse plus approfondie d’un ensemble de marqueurs putatifs. Épithéliales transcription factor p63 et surtout en position N-terminale tronquée transcription de l’isoforme alpha de p63 (ΔNp63α), a été proposé comme une pertinente positive LESC marqueur3,4. Une répartition asymétrique des LESCs permet à se renouveler, mais également produire la progéniture qui migrent de façon centripète et vers l’avant. Comme les cellules des progrès vers la surface de la cornée ils progressivement perdre leurs stemness et enfin faire la différence en phase terminale à des cellules malpighiennes superficielles qui sont constamment perdus de la surface de la cornée.

Dommages à l’une des couches cornéens peuvent mener à la déficience visuelle grave, et défauts cornéens sont donc une des principales causes de cécité dans le monde entier. Dans insuffisance limbique des cellules souches (LSCD), le limbe est détruite par une maladie ou un traumatisme qui mène à conjunctivalization et opacification de la surface de la cornée et la perte de vision5,6. Thérapie de remplacement de cellules à l’aide de greffes limbique autologues ou allogéniques propose une stratégie thérapeutique pour les patients atteints LSCD4,7,8,9. Toutefois, récolte des greffes autologues porte un risque de complications à le œil sain et tissu du donneur est en bref l’approvisionnement. Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs), spécifiquement les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs), peut servir comme une source illimitée de types de cellules cliniquement pertinents, y compris les cellules épithéliales cornéennes. Par conséquent, LESCs dérivé de hPSC (hPSC-LESCs) représentent une source de cellule nouveau attrayant pour la thérapie de remplacement de cellules oculaires.

Traditionnellement, des méthodes de culture hPSC indifférencié et leurs protocoles de différenciation à LESCs sont sont appuyés sur l’utilisation de cellules nourricières indéfini, sérums animaux, milieux conditionnés ou membranes amniotiques10,11, 12 , 13 , 14 , 15. récemment, les efforts vers des produits de thérapie cellulaire plus sûrs ont incité la recherche de plusieurs protocoles standardisés et xeno sans la culture et de la différenciation. Par conséquent, plusieurs méthodes définies et xeno-gratuit pour les cultures à long terme des hPSCs indifférencié sont maintenant disponibles dans le commerce16,17,18. Comme un continuum, différenciation dirigée en s’appuyant sur de hPSCs sort épithéliale cornéenne, les repères moléculaires des protocoles ont été récemment introduits19,20,21,22, 23. Encore bon nombre de ces protocoles utilisés soit hPSCs chargeur basé indéfini, comme matériau, ou des cocktails complexes, xénogéniques facteur de croissance pour la différentiation de départ.

Le but du présent protocole est de fournir un robuste et optimisé, xeno- et méthode de culture exempte d’alimentation hPSC et différenciation ultérieure à LESCs cornéens. Culture monocouche de pluripotentes hPSCs sur laminin-521 (LN-521) matrice dans un milieu défini, sans albumine hPSC (notamment essentiels 8 Flex) permet la production rapide de matière homogène de différenciations. Par la suite, un simple, stratégie de différenciation en deux étapes Guide hPSCs vers la surface ectodermique sort en suspension, suivie de différenciation adhérente à LESCs. Une population de cellules où > 65 % express ΔNp63α est obtenue dans les 24 jours. La xéno - et chargeur-un protocole d’entente a été testé avec plusieurs lignes de hPSC (CSEh et hiPSCs), sans aucune obligation pour l’optimisation spécifique de la cellule ligne. Les protocoles pour le week-end-gratuit maintenance, passage, cryostoring et hPSC-LESC phénotypage décrits ici permettent la production d’importants lots de qualité LESCs pour clinique ou des fins de recherche.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Université de Tampere a l’approbation de l’autorité nationale pour les affaires médico-légales Finlande (Dnro 1426/32/300/05) de mener des recherches sur les embryons humains. L’Institut a également des déclarations de soutien du Comité éthique du District hospitalier de Pirkanmaa dérivent, culture, et de différentier les lignées de CSEh (Skottman/R05116) et d’utiliser les lignes de hiPSC dans la recherche ophtalmique (Skottman/R14023). Aucune nouvelles lignées de cellules ont été calculées pour cette étude.

Remarque : Le protocole décrit est issu des hPSC spécifique, disponible dans le commerce et les médias de différenciation de l’épithélium cornéen. Veuillez vous référer à la Table des matières pour les numéros de catalogue et les informations de fabricant/fournisseur.

1. établir hPSC Xeno - et Feeder-free Culture

  1. Préparations
    1. Enduire plaques 24 puits avec humaine recombinante laminin-521 (LN-521). Pour le premier passage (FF) exempte d’engraissement, utilisez LN-521 à une concentration de 1,09 µg/cm2et à 0.55 µg/cm2 pour les passages suivants. Les concentrations de LN-521 suggérées servent comme point de départ pour la culture réussie de FF mais peuvent être abaissées.
      1. Décongeler le flacon de LN-521 lentement à 4 ° C selon les instructions du fabricant.
        NOTE : Solution de LN-521 convenablement manipulée peut-être être conservée à 4 ° C jusqu'à 3 mois après décongélation.
      2. Pour préparer la solution de revêtement, diluer la quantité appropriée de la solution mère de LN-521 avec de 1 x Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (SPD) contenant Ca2 + et Mg2 + pour un volume total de 300 µL / puits.
      3. Pipette de la solution de revêtement dans les puits, sceller la plaque bien avec du parafilm et incuber une nuit à 4 ° C. Plaques de revêtement peuvent être conservés à 4 ° C pendant 2 semaines.
        (Facultatif) : par ailleurs, un protocole de couche rapide, incuber les boîtes bien avec solution de revêtement pendant 2 h à 37 ° C, 5 % de CO2.
    2. Préparer les hPSC milieu de culture (notamment essentiels 8 Flex) en complétant le milieu basal avec supplément fourni, comme indiqué par le fabricant. Ajouter 50 U/mL de pénicilline-streptomycine. Notez que la formulation est sensible à la lumière qu’à haute température. Décongeler le supplément et réchauffer les médias à température ambiante (RT), abri de la lumière. Utiliser le milieu supplémenté hPSC dans les deux semaines suivant la date de la supplémentation.
  2. Transfert de la hPSC à la culture FF sur LN-521
    1. Réchauffez tous les matériaux nécessaires et les réactifs de RT dans la hotte à flux laminaire.
    2. HPSCs passage du système de culture standard sur des calques de conducteur (p. ex. inactivé prépuce humain (hFF) ou fibroblastes embryonnaires de souris) ou d’autres systèmes de culture de FF à l’aide de la méthode standard. Par exemple, colonies hPSC cultivés sur des cellules nourricières hFF peuvent être disséqués en petits morceaux avec un scalpel et les pièces détachées puis avec une pointe d’aiguille. PSC humaines cultivées à l’aide de systèmes de culture FF peut être transférées à l’aide de cluster passage méthode avec ou sans traitement préalable enzymatique.
    3. Enlever la solution de revêtement de LN-521 des 24-puits et ajouter 1 mL de milieu de hPSC pré chauffé par puits.
      Remarque : Ne pas laisser les puits à sec comme LN-521 inactive après séchage.
    4. Transférer les grappes de morceaux/cellule de colonie à LN-521 enduit 24-puits dans le milieu de hPSC avec une pipette. Transférer des morceaux de colonie de 20 – 30 / puits, éviter la surpopulation des puits.
    5. Remplacer le support par 1 mL de milieu hPSC le jour après transfert et tous les deux jours par la suite. Les cultures sont prêts pour le passage 3 à 4 jours plus tard comme hPSCs sont devenus des colonies à la morphologie bien lisse et non différenciée. Pour référence, voir Figure 1 b (première image). Pour le premier passage de FF, les colonies ne puissent pas passer à une monocouche confluente entièrement, mais les cultures doivent être repiquées quand colonies atteignent une taille approximative de 1 mm.
  3. Passant et maintien de la culture hPSC FF
    1. Réchauffez tous les matériaux nécessaires et les réactifs de RT dans la hotte à flux laminaire.
    2. Le deuxième passage de FF partir, passage le hPSCs FF lorsque la culture atteint confluence de 80 à 100 %. HPSCs FF passage à nouveau LN-521 enduit plaques 24 puits à l’aide de cellule unique passage deux fois par semaine (les lundis et jeudis) pour maintenir des cultures de haute qualité avec une morphologie indifférenciée et d’atteindre le régime alimentaire exempt de week-end. Pour plus de détails, veuillez vous référer à18,24,25.
      1. Rincer la hPSCs FF deux fois avec 1 mL de 1 x DPBS sans Ca2 + et Mg2 +.
      2. Détacher, FF hPSCs exempt de xeno trypsine-EDTA (spécifiquement TrypLE sélectionnez Enzyme) en incubation 500 µL / puits à 37 ° C, 5 % de CO2. Pour les temps d’incubation optimale, permettent les cellules pour arrondir vers le haut, mais ne pas à se détacher. Cela prend généralement 3 min à 37 ° C, 5 % de CO2 (ne pas dépasser les 5 min).
      3. Supprimer la trypsine-EDTA xeno-gratuit et immédiatement ajouter 500 µL / puits d’inhibiteur de la trypsine définis.
      4. Détacher FF hPSCs en pipettant également, prudent, mais approfondie afin d’obtenir une suspension monocellulaire. Transférer la suspension de hPSC FF à travers un tamis de cellule de 40 µm dans un tube à centrifuger coniques 15 mL contenant le support hPSC préchauffé.
      5. Laver les puits avec 1 mL de milieu hPSC et ajouter le support de lavage dans le tube à centrifuger conique 15 mL.
      6. Centrifuger la suspension monocellulaire pendant 5 min à 300 x g, aspirer le culot cellulaire et remettre en suspension dans 1 mL de milieu de hPSC préchauffé.
      7. Compter les cellules avec hémocytomètre ou compteur de cellules automatisées.
      8. Enlever la solution de revêtement de LN-521 (0.55 µg/cm2) 24-puits et ajoutez hPSC moyen comme 1.2.3.
      9. HPSCs FF plaque sur 0,55 µg/cm2 LN-521 enduit 24-puits à une densité de 40 000 à 50 000 cellules/cm2.
      10. Remplacez moyen moyen hPSC fraîches au lendemain du passage et tous les deux jours par la suite, à l’exclusion des dimanches.
    3. Les cellules sont prêtes à être utilisées pour différencier 3-4 jours après le passage, lorsque la culture a atteint > confluence de 85 %. Pour assurer la qualité de l’hPSCs, reportez-vous aux méthodes de caractérisation décrits en détail dans précédents travaux18,24,25. Il est recommandé de seulement la culture hPSCs jusqu’au niveau de passage 15 dans le système de FF à l’aide de la cellule unique passage afin d’éviter des changements caryotypiques. Utilisez uniquement des hPSCs de haute qualité, indifférencié comme matériau pour les différenciations de départ.

2. différenciation et cryoconservation des dérivés hPSC LESCs

  1. Préparations
    1. Préparer le milieu d’induction xeno-free basal (milieu d’induction basale) : supplément Dulbecco aigle modifié (plus précisément KnockOut DMEM) avec 15 % de remplacement sérum exempt de xeno (spesifically CTS KnockOut SR XenoFree), 2 mM de L-glutamine, 0,1 mM 2 - mercaptoéthanol, 1 % des acides aminés non essentiels et 50 U/mL de pénicilline-streptomycine. Utiliser le milieu basal de l’induction dans les deux semaines.
    2. Préparer les médias pour l’induction de cornée en culture en suspension.
      1. Jour 1 : Compléter le milieu basal induction avec 5 μM blebbistatin.
      2. Jour 2 : Supplément milieu basal induction avec 10 µM SB-505124 et 50 ng/mL humaine fondamentale fibroblast growth factor (bFGF).
      3. Jour 3-4 : supplément milieu basal induction avec 25 protéine morphogénétique de l’OS ng/mL 4 (BMP-4).
    3. Préparer le moyen de différenciation de l’épithélium cornéen (moyen de différenciation, spécifiquement CnT-30) pour la culture adhérente : ajouter des suppléments au milieu de base selon les instructions du fabricant et 50 U/mL de pénicilline-streptomycine.
      NOTE : Formulation moyenne de différenciation est sensible à la lumière. Utiliser le milieu supplémenté de différenciation dans les 6 semaines suivant la date de la supplémentation.
    4. Enrober les plats de vitroplants de 100 mm pour différenciation adhérente (voir étape 2.3) avec un mélange de 5 µg/cm2 humain placentaire du collagène de type IV (col IV) et 0,5 µg/cm2 LN-521 dilué dans 1 x DPBS contenant Ca2 + et Mg2 +, dans un total volume de 5 mL par plat de revêtement. Préparer et stocker les revêtements avec col IV et LN-521 tel que décrit dans 1.1.1.3.
  2. Étape i : induction cornée en culture en suspension
    1. Réchauffez tous les matériaux nécessaires et les réactifs de RT dans la hotte à flux laminaire.
    2. Détacher le hPSCs FF à suspension monocellulaire xeno-free trypsine-EDTA comme indiqué dans les étapes 1.3.2.1–1.3.2.6. Compter les cellules non vides et distribuer les 2-3 x 106 cellules / faible fixation plaque 6 puits bien, dans un volume total de 3 mL de milieu d’induction basale additionné de 5 μM blebbistatin à induire la formation de EB nuit à 37 ° C, 5 % de CO2 (jour 1).
    3. Le lendemain (jour 2), enlever le support et remplacez avec 3 mL de milieu d’induction basale additionné de 10 µM bFGF de SB-505124 et 50 ng/mL.
    4. Ce qui suit deux jours (jours 3-4), enlever le support et remplacez avec 3 mL de milieu d’induction basale additionné de 25 ng/mL BMP-4.
  3. Etape II : Différenciation cornée en culture adhérente
    1. Réchauffez tous les matériaux nécessaires et les réactifs de RT dans la hotte à flux laminaire.
    2. Le jour 5, plaque l’EBs vers le bas sur des plats de vitroplants 100 mm recouverts de 5 µg/cm2 col IV et 0,5 µg/cm2 LN-521.
      1. Enlever la solution de revêtement de vaisselle de vitroplants de 100 mm et ajouter 10 mL de milieu de différenciation préchauffé par plat.
        Remarque : Ne pas laisser la vaisselle sécher comme LN-521 inactive après séchage.
      2. Transférer l’EBs d’une plaque de 6 puits bien de deux ou trois plats de vitroplants de 100 mm (environ 50 EBs par cm2) de pipetage. Répartir l’EBs en agitant doucement.
    3. Maintenir les cellules en culture adhérente à 37 ° C, 5 % CO2, remplaçant le milieu avec 10 mL de milieu de différenciation frais trois fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi) pour les prochaines semaines de 2,5 à 3. Vérifier les cellules régulièrement pour l’émergence de la morphologie épithéliale correcte à l’aide du microscope à contraste de phase.
  4. Étape III : Cryo-bancaire hPSC dérivés LESCs
    1. Réchauffez tous les matériaux nécessaires et les réactifs de RT dans la hotte à flux laminaire, sauf pour le support de cryoconservation qui devrait être préalablement refroidi.
    2. Détacher les dérivés hPSC LESCs avec la trypsine-EDTA xeno-free et compter les cellules, en suivant les instructions pour hPSCs FF 1.3.2.1–1.3.2.6 étapes mais en utilisant le moyen de différenciation.
      Remarque : Pour LESCs dérivé de hPSC, le temps d’incubation optimale avec la trypsine-EDTA xeno-free est plus longue (environ 5 min). Utiliser 3 mL de xeno-free trypsine-EDTA et inhibiteur de la trypsine définis par plat de 100 mm.
    3. Après avoir compté les cellules, répéter centrifugation pendant 5 min à 300 x g, aspirer moyen et Resuspendre le culot cellulaire dans un milieu de cryoconservation préalablement réfrigérées et xeno-libre hPSC. Pipette le single cell suspension en cryotubes afin que chaque cryotube contient 0,5 à 1 x 106 cellules dans 1 mL de milieu de cryoconservation.
    4. Placer les tubes dans un gel contenant et transfert immédiatement (à moins de 5 min) à-80 ° C durant la nuit.
    5. Le lendemain, transfert les tubes à l’azote liquide pour le stockage à long terme.
  5. Étape IV : Décongeler les cryoconservés hPSC-LESCs
    1. Avant le dégel, enduire les plaques de plats/puits à 5 µg/cm2 col IV et de 0,5 µg/cm2 LN-521.
    2. Réchauffez tous les matériaux nécessaires et les réactifs de RT dans la hotte à flux laminaire.
    3. Enlever la solution de revêtement des plats/puits et ajouter un volume approprié de moyen de différenciation préchauffé.
      Remarque : Ne pas laisser la vaisselle sécher comme LN-521 inactive après séchage.
    4. Décongeler les cellules rapidement à ta et transférer immédiatement la suspension de cellules dans un tube à centrifuger conique 15 mL contenant 5 mL de milieu de différenciation préchauffé.
    5. Centrifuger la suspension cellulaire pour 5 min à 300 x g, aspirer et Resuspendre le culot dans moyen de différenciation pour enlever n’importe quel support de cryoconservation.
    6. Plaque des cellules sur des plats/puits recouverts de 5 µg/cm2 col IV et 0,5 µg/cm2 LN-521, dans le milieu de la différenciation à une densité de 40 000 à 50 000 cellules/cm2. Maintenir les cellules à 37 ° C, 5 % CO2, remplaçant le moyen de différenciation trois fois par semaine.

3. phénotypage des dérivés hPSC LESCs

  1. Analyse qualitative par immunofluorescence
    1. Pour l’immunofluorescence, manteau 24 ou 12 puits puits de plaque à 5 µg/cm2 col IV et 0,5 µg/cm2 LN-521 et plaque/dégel hPSC-LESCs dans le milieu de la différenciation à une densité de 40 000 à 50 000 cellules/cm2.
    2. Lorsque les cultures ont atteint confluence, fixer les cellules avec du paraformaldéhyde 4 % (PFA) : laver les puits deux fois avec 1 x DPBS sans Ca2 + et Mg2 +et incuber pendant 15-20 min 4 % PFA à température ambiante. Par la suite, laver deux fois avec 1 x DPBS pour retirer tout résidu de la PFA. Utilisation de 0,5 à 1 mL de solutions / puits.
      Remarque : Les cellules fixes peuvent être conservés dans 1 x DPBS à 4 ° C jusqu'à une semaine avant la coloration.
      ATTENTION : PFA est toxique et corrosif. Gérez des PFA dans une hotte aspirante et porter des vêtements de protection, lunettes de protection et des gants.
    3. Aspirer les 1 x DPBS et permeabilize des membranes cellulaires en incubant pendant 10-15 min avec 0,1 % de Triton X-100 dans 1 x DPBS.
    4. Aspirez 0,1 % Triton X-100 et bloc anticorps non-spécifiques accepteurs en incubant pendant 1 h avec 3 % sérum d’albumine bovine (BSA) dans 1 x DPBS à des dilutions de l’anticorps primaire RT. Prepare à 0,5 % de BSA à 1 x DPBS.
      NOTE : Voir le tableau 1 pour des anticorps primaires recommandées.
    5. Aspirer 3 % de BSA et incuber avec anticorps primaires convenablement dilué pendant une nuit à 4 ° C.
    6. Laver les puits 3 x pendant 5 min avec 1 x DPBS. Préparer des dilutions d’anticorps secondaire à 0,5 % de BSA à 1 x DPBS.
      NOTE : Voir le tableau 1 pour les anticorps secondaires recommandées.
    7. Aspirer 1 x DPBS et incuber avec anticorps secondaire convenable, convenablement dilué pendant 1 h à RT, abri de la lumière.
      Remarque : Cette étape sur, conserver les échantillons à l’abri de la lumière afin d’éviter la décoloration des colorants fluorescents.
    8. Laver les puits 3 x pour 5 min avec 1 x DPBS et enfin contre-colorant noyaux avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et le Mont avec support de montage de fluorescence. DAPI peut être utilisé séparément selon les instructions du fabricant ou inclus dans le milieu de montage. Place ronde lamelles couvre-objet (plaques diamètre 19 mm et 13 mm pour 12 et 24-puits, respectivement) dans chaque puits. Suivez les instructions du fabricant concernant le séchage et le stockage des échantillons montés.
    9. Images de cellules colorées avec un microscope à fluorescence.
  2. Analyse quantitative par immunofluorescence
    1. Préparer les échantillons cytospin de dérivés hPSC LESCs objet lunettes.
      1. Détacher les dérivés hPSC LESCs avec la trypsine-EDTA xeno-free et compter les cellules, en suivant les instructions à l’étape 2.4.2.
      2. Après avoir compté, ajouter des 1 x DPBS préalablement réfrigérées et centrifuger pendant 5 min à 300 x g. Réglez le volume de l’échantillon et la concentration cellulaire selon les instructions du fabricant de la cytocentrifuge donnée, par exemple 50 000 – 100 000 cellules dans un volume d’échantillon de 150 µL.
      3. Tourner les cellules vers le bas pour objet verres avec un cytocentrifuge par exemple 5 min à 28 x g et fix immédiatement pendant 15-20 min 4 % PFA dans 1 x DPBS à température ambiante. Pour le temps de rotation recommandée et de la vitesse, reportez-vous à la notice de la cytocentrifuge donnée.
    2. Procéder à la coloration des échantillons cytospin tel que décrit dans les étapes 3.1.3–3.1.8 utilisation liquide bloqueur plume entourent les échantillons avec un cercle hydrophobe et procéder à la coloration dans une gouttelette pour la pratique économique. Lavages peuvent être effectués dans des récipients avec les détenteurs de la diapositive, afin d’assurer une élimination efficace des anticorps excédentaires et la coloration de fond minimal. Contre-coloration noyaux au DAPI et monter les échantillons colorés avec fluorescence médias, couvrant avec lamelles de montage. Suivez les instructions du fabricant concernant le séchage et le stockage des échantillons montés.
    3. Capturer des images de 5 à 10 par exemple à des endroits choisis au hasard en utilisant par exemple 10 X grossissement d’un microscope à fluorescence.
    4. Estimer le pourcentage de cellules colorées positivement en ce qui concerne les cellules (DAPI positif) totales, par exemple avec des outils logiciels (https://imagej.nih.gov/ij/) analyse et de traitement d’images ImageJ. Préférence analyser > 500 cellules par exemple.
      1. Ouvrez l’image à analyser dans les logiciels ImageJ. Dupliquer l’image et le filtre Flou gaussien par défaut pour supprimer le bruit.
      2. Créer un seuil. Ajustez les valeurs de seuil pour une sélection optimale de noyaux de cellules colorées positivement et s’appliquent. L’image dupliquée est maintenant convertie à un affichage binaire.
      3. Processus de l’image binaire avec traitement binaire outils « Trous de remplissage » et « Bassin versant », qui séparera automatiquement fusionnés zones représentant les noyaux unique.
      4. Utilisez l’outil de « Particules Analyze » pour automatiquement liste régions d’intérêts (ROIs) de la fenêtre Gestionnaire de ROI, qui ouvrira ses portes dès la mise de la commande. Fermez l’image binaire.
      5. Visualiser la ROIs de l’image originale en choisissant « Afficher tout » dans le gestionnaire de ROI. Confirmer la sélection correcte de noyaux de cellules colorées et le cas échéant, supprimer manuellement et ajouter des sélections individuelles.
  3. Analyse en cytométrie en flux
    1. Pour vérifier les niveaux d’expression p63α, tacher les cellules pour la cytométrie en flux.
      1. Détacher les dérivés hPSC LESCs avec la trypsine-EDTA xeno-free et compter les cellules, en suivant les instructions à l’étape 2.4.2.
      2. Laver les cellules deux fois avec 1 mL préalablement réfrigérée 1 x DPBS et centrifuger pendant 5 min à 300 x g. Fix et permeabilize avec une solution prête à l’emploi fixation/perméabilisation pendant 20 min à 4 ° C. Par la suite laver les cellules deux fois avec 1 mL réfrigérés avant 1 x perméabiliser le tampon de lavage.
        Remarque : Cette étape sur, garder les cellules à 4 ° C ou sur la glace, sauf indication contraire.
      3. ATTENTION : Solution de Fixation/perméabilisation contient du formaldéhyde de 4,2 %. Gérez la solution dangereuse sous une hotte et porter des vêtements de protection, lunettes de protection et des gants.
      4. Diviser les échantillons dans des tubes en polypropylène de 5 mL. Chaque échantillon doit contenir 100 000 – 200 000 cellules et le volume de l’échantillon doit être ajusté à environ 100 µL de 1 x tampon de lavage.
      5. Ajouter 2 µL de fluorochrome conjugué p63-α FACS anticorps (anticorps recommandés, voir tableau des équipements et matériels) dans les tubes à échantillon. Laisser un échantillon non souillées enregistré pour servir de témoin négatif. Vortex les échantillons et incuber pendant 1 heure à ta, abri de la lumière.
      6. Laver les cellules deux fois avec 1 mL d’avance réfrigérées 1 x tampon de lavage et enfin, remettre en suspension les pellets avec 300 µL de tampon. Stocker les tubes sur la glace, abri de la lumière.
    2. Analyse des échantillons avec un cytomètre en flux. Utilisez l’exemple de contrôle négatif non colorés pour blocage de la population cellulaire correcte et d’exclure le signal de fond fluorescent. Analyser un minimum de 10 000 p63-α-coloration des cellules. Pour la mise en œuvre technique détaillé, veuillez vous référer au manuel d’utilisation du cytomètre en flux donné.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hPSCs à hPSC-LESCs

L’ensemble du processus d’induire la différenciation de FF hPSCs à cryostoring hPSC-LESCs prend environ 3,5 semaines. Figure 1 aprésente un aperçu schématique de la méthode de différenciation mettant en évidence ses principales étapes. Figure 1 b montre une morphologie typique des populations de cellules dans les différentes phases du protocole. Les d...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le résultat escompté de ce protocole est la génération réussie et robuste de LESCs d’une suspension monocellulaire de hPSC FF environ 3,5 semaines. Comme l’épithélium cornéen se développe à partir de l’ectoderme de surface29, la première étape du protocole vise à hPSCs vers cette lignée de direction. Une induction courte 24h avec transformation antagoniste du facteur de croissance bêta (TGF-β) SB-505124 et bFGF sont utilisés pour induire la différenciation ectodermique, suivie par mésodermiques cu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’étude a été financée par l’Académie de Finlande (numéro de licence 297886), le programme des pièces de rechange humaine de Tekes, l’Agence finlandaise de financement pour la technologie et l’Innovation, le œil finlandais et Tissue Bank Foundation et la Fondation culturelle finlandaise. Les auteurs remercient les techniciens de laboratoire biomédical Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt et Outi Heikkilä excellente assistance technique et de la contribution à la culture cellulaire. Professeur Katriina Aalto-Setälä est reconnu pour prévoyant la fourniture d’équipements pour l’imagerie de fluorescence de la hiPSC ligne utilisée et BioMediTech Imaging Core facility.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Matériel/Réactif
1x DPBS contenant du Ca2+ et du Mg2+Gibco#14040-091
1x DPBS sans Ca2+ et Mg2+Lonza#17-512F/12
Boîte de culture cellulaire de 100 mmCorning CellBIND#3296Format de récipient de culture pour hPSC-LESC adhérent différenciation
Plaque à 12 puitsCorning CellBIND#3336Format du récipient de culture pour les échantillons IF
Plaque à 24 puitsCorning CellBIND#3337Format du récipient de culture pour les échantillons IF
2-mercaptoéthanolGibco#31350-010
Plaque à 6 puits, fixation ultra-faibleCorning Costar#3471Format du récipient de culture pour l’induction en suspension culture
Alexa Fluor 488 anti-souris IgThermoFisher Scientific#A-21202Anticorps secondaire pour IF
Alexa Fluor 488 anti-lapin IgThermoFisher Scientific#A-21206Anticorps secondaire pour IF
Alexa Fluor 568 Ig anti-chèvreThermoFisher Scientific#A-11057Anticorps secondaire pour IF
Alexa Fluor 568 anti-souris IgThermoFisher Scientific#A-10037Anticorps secondaire pour
facteur de croissance des fibroblastes de base IF (bFGF, humain)PeproTech Inc.#AF-100-18BFGF humain recombinant indemne d’origine animale (154 a.a.)
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/PerméabilisationSolution BD Biosciences#554722Solution de fixation et de perméabilisation pour cytométrie en flux
BD Perm/Wash BufferBD Biosciences#554723Tampon de lavage pour cytométrie en flux
BlebbistatinSigma-Aldrich#B0560
Protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP-4)PeproTech Inc.#120-05A
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma-Aldrich#A8022-100G
Anticorps anti-cytokératine 12Santa Cruz Biotechnology#SC-17099Anticorps primaire pour l’anticorps
anti-cytokératine 14IF R& D Systems#MAB3164Anticorps primaire pour l’anticorps IF
Cytokératine 15ThermoFisher Scientific#MS-1068-PAnticorps primaire pour IF
CnT-30CELLnTEC Advanced Cell Systems AG#Cnt-30Milieu de culture pour la différenciation hPSC-LESC adhérente
Collagène de type IV (humain)Sigma-Aldrich#C5533Collagène placentaire humain de type IV
CoolCell LX Conteneur de congélationSigma-Aldrich#BCS-405
Tubes CryoPureSarsted#72.380Cryotube de 1,6 mL pour cryoconservation hPSC-LESC
Inhibiteur de trypsine définiGibco#R-007-100
Essential 8 Flex Medium KitThermo Fisher Scientific#A2858501
GlutaMAXGibco#35050061
Laminine 521Biolamina#Ln521Laminine recombinante humaine 521
&Delta ; Np63&alpha ; anticorpsBioCare Medical#4892Anticorps primaire pour l’anticorps IF
OCT3/4R& D Systems#AF1759Anticorps primaire pour IF
p63-&alpha ;anticorps Technologie de signalisation cellulaire#ACI3066AAnticorps primaire pour IF
p63-&alpha ; (D2K8X) XP Rabbit mAb (conjugué PE)Technologie de signalisation cellulaire#56687p63-&alpha ; Anticorps conjugué PE pour cytométrie en flux
Anticorps PAX6Sigma-Aldrich#HPA030775Anticorps primaire pour IF
Pénicilline/StreptomycineLonza#17-602E
Paraformaldéhyde (PFA)Sigma-Aldrich#158127Fixateur cellulaire pour IF
ProLong Gold Fixant anti-décoloration avec DAPIThermo Fisher Scientific#P36931Fixateur DAPI pour dur montage pour
IF PSC CryopreservationKit Thermo Fisher Scientific#A2644601
TrypLE Select EnzymeGibco#12563-011
KnockOut Dulbecco' Eagle modifié' s mediumGibco#10829018
KnockOut SR XenoFree CTSGibco#10828028
MEM acides aminés non essentielsGibco#11140050
SB-505124Sigma-Aldrich#S4696
Triton X-100Sigma-Aldrich#T8787Agent de perméabilisation pour IF
VectaShieldVector Laboratories#H-1200Agent de montage DAPI pour montage liquide pour IF
strong>NomCompanyNuméro de catalogueComments
Equipment
Cytocentrifuge, e.g. CellSpin IITharmac
Cytomètre en flux, par ex. BD Accuri C6BD Biosciences
Microscope à fluorescence, par ex. Olympus IX 51Olympus
le <

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
  2. Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. Limbal and corneal epithelial homeostasis. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).
  3. Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).
  4. Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
  5. Notara, M., et al. In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy. Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).
  6. Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. The limbal epithelium of the eye--a review of limbal stem cell biology, disease and treatment. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).
  7. Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
  8. Sangwan, V. S., et al. Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study. The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).
  9. Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns. The British Journal of Ophthalmology. , (2018).
  10. Ahmad, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche. Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).
  11. Hanson, C., et al. Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro. Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).
  12. Hayashi, R., et al. Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium. PLoS ONE. 7 (9), e45435(2012).
  13. Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells. Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).
  14. Shalom-Feuerstein, R., et al. Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification. Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).
  15. Cieslar-Pobuda, A., et al. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells. Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).
  16. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
  17. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  18. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
  19. Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).
  20. Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells. Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).
  21. Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions. PLoS One. 12 (8), e0183303(2017).
  22. Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing. PLoS One. 12 (6), e0179913(2017).
  23. Kamarudin, T. A., et al. Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells. Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).
  24. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195(2014).
  25. Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4(2017).
  26. Skottman, H. Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).
  27. Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation. Biomedical Engineering Online. 13, 39(2014).
  28. Ojala, M., et al. Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy. Stem Cells International. 2016, 1684792(2016).
  29. Ali, R. R., Sowden, J. C. Regenerative medicine: DIY eye. Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).
  30. International Stem Cell Initiative,, et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
  31. Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7, 41286(2017).
  32. Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Corneal Limbal Epithelial Stem CellsHuman Pluripotent Stem CellsDirected DifferentiationXeno Free CultureFeeder Cell FreeLaminin 521 Collagen IVEmbryoid Body FormationSurface Ectodermal InductionAdherent DifferentiationCryopreservation

Related Articles