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Article de méthode

TChIP-Seq : Type-spécifiques des cellules épigénome profilage

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DOI :

10.3791/58298

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23 janvier 2019

 ,  ,  , 
1RNA Biology Laboratory, RIKEN, 2RNA Systems Biochemistry Laboratory, RIKEN Cluster for Pioneering Research, 3Laboratory for Phyloinformatics, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, 4RNA Biology Laboratory, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University, 5Department of Computational Biology and Medical Sciences, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo

Dans cet article

Résumé

Les auteurs décrivent un protocole étape par étape pour la chromatine tandem immunoprécipitation séquençage (tChIP-Seq) qui permet l’analyse de la modification d’histone génome cellule-spécifiques au type.

Résumé

Régulation épigénétique joue un rôle central dans l’expression des gènes. Étant donné que la modification d’histone a été découvert dans les années 1960, ses fonctions physiologiques et pathologiques ont été largement étudiées. En effet, l’avènement de la nouvelle génération séquençage en profondeur et immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) par l’intermédiaire des anticorps spécifiques d’histone modification a révolutionné notre vision de la régulation épigénétique au sein du génome. À l’inverse, les tissus sont généralement composent de types cellulaires différents, et leur mélange complexe pose des défis analytiques pour enquêter sur l’épigénome dans un type particulier de cellules. Afin d’examiner l’état de la chromatine spécifiques à un type de cellule dans une manière de tout le génome, nous avons développé récemment en tandem la chromatine immunoprécipitation le séquençage (tChIP-Seq), qui repose sur l’épuration sélective de la chromatine par des protéines histones tagged noyau de cellule types d’intérêt, suivie par ChIP-seq. L’objectif de ce protocole est l’introduction de meilleures pratiques de tChIP-suiv. Cette technique fournit un outil polyvalent pour enquête épigénome tissu-spécifique dans les modifications d’histone diverse et organismes modèles.

Introduction

Les tissus des animaux se composent de types cellulaires différents. La régulation des gènes dans chaque cellule définit le type de cellule. Modifications de la chromatine - modification histone et de méthylation de l’ADN - sous-tendent la spécificité cellulaire de type de l’expression génique. Ainsi, la mesure de régulation épigénétique dans chaque type de cellule a été désirée, mais il a été un défi technique.

Pour étudier l’épigénétique dans un type particulier de cellules, le séquençage de l’immunoprécipitation de la chromatine en tandem (tChIP-Seq) a été récemment mis au point ()Figure 1)1. TChIP, protéine de noyau épitope-tag histone H2B est exprimée d’un instigateur de cellule-spécifiques au type. Cette fonctionnalité permet l’isolement des chromatines des cellules d’intérêt, même si le matériel commence à partir d’un mélange de différents types de cellules. Suivant ChIP-Seq — purification de la chromatine via une marque modifiée-histone et séquençage en profondeur de prochaine génération isolé ADN — nous pouvons surveiller l’état épigénétique du type cellulaire ciblée de manière génome-large.

En utilisant cette technique, nous avons étudié récemment triméthylation neurone-spécifique de l’histone H3 protéine sur la lysine 4 (H3K4me3) marques. Dans cette étude, nous avons développé une souris knock-in dans lequel terminalement H2B indicateur-étiquetées protéine a été exprimée lors de la recombinaison Cre-mediated (Rosa26CAG floxed-pA H2B-drapeau). Par croisement avec une souris possédant le gène de Cre-réticulum endoplasmique (re) sous le contrôle du promoteur CamK2a, la lignée de souris obtenue induit H2B-drapeau en neurones actifs sur le tamoxifène injection (Camk2aH2B-drapeau)1. A partir de cerveau de la lignée de souris établie, nous avons effectué tChIP-Seq avec anticorps anti-H3K4me3. Étant donné que les marques de H3K4me3 correspondent souvent aux régions promotrices, nous pourrions découvrent des centaines de mRNA spécifiquement exprimé dans les neurones1.

Nous décrivons ici une méthode typique tChIP-Seq qui couvre les étapes de la dissection des tissus pour la construction de la bibliothèque ()Figure 1). L’objectif final de ce protocole est de partager nos meilleures pratiques pour l’exécution de tChIP-Seq et l’application future de cette méthode à d’autres types de cellules et des modifications d’histone.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites dans les présentes ont été approuvés par la division de la sécurité du RIKEN (H27-EP071) et réalisées avec les règlements et lignes directrices pertinentes.

1. dissection du tissu

  1. Disséquer les tissus d’intérêt en petits morceaux (environ < 3 mm2) à l’aide de ciseaux fine de printemps.
    Remarque : Plus grands fragments de tissu sont plus longs à geler, et petits morceaux porteront sur des volumes plus importants de la mémoire tampon, qui peuvent affecter les résultats.
  2. Ajouter les fragments de tissus disséqués à un récipient propre rempli d’azote liquide et les recueillir dans des tubes de 2 mL (1 morceau par tube) rempli d’azote liquide.
    Note : Les Tubes avec une surface hydrophile sont recommandées pour cette étape.
  3. Placer les tubes à-80 ° C pendant 5 min > avec le bouchon ouvert pour évaporer le reste de l’azote liquide.
    Remarque : Après la fermeture du bouchon, fragments tissulaires peuvent être stockés à-80 ° C pendant un mois avant utilisation.

2. fixation de la cellule

Remarque : Nous avons utilisé un broyeur cryogénique très pratique pour cette étape. Un appareil de rechange peut être utilisé.

  1. Tubes de liaison faible de place les 2 mL-protéine contenant les échantillons de tissus sur une grille métallique glace réfrigérée dans l’azote liquide.
  2. Placer une balle de métal dans un 1,5 mL-tube et refroidissement à l’azote liquide. Placez-le sur la grille métallique de glace.
  3. Ouvrir le tube 2 mL et placer la balle métal prechilled dans le tube. Fermez le bouchon, mettre les 2 mL-tubes dans le porte-tube d’un broyeur cryogénique maniable et tremper immédiatement le titulaire tube assemblé dans l’azote liquide pendant 1 min.
  4. Insérez le porte-tube congelé dans la cassette externe de la meuleuse maniable cryogénique et agiter vigoureusement 60 fois pendant 30 s.
  5. Démonter le porte-tube, enlever la balle métallique et place les 2 mL-tube sur un échantillon plus frais prérefroidies à-20 ° C.
  6. Placer l’échantillon refroidisseur à-20 ° C pendant 15 min éviter le gel du fixateur à l’étape suivante.
  7. Amener l’échantillon refroidisseur sur le banc, ouvrez le couvercle du tube et ne versez immédiatement 900 µL de 1 % de formaldéhyde dans elle. Après avoir effectué plusieurs fois, transférer la suspension dans nouveau 2 mL-tube contenant 900 µL du 1 % de formaldéhyde et le fixer pendant 10 min avec rotation douce dans un incubateur à 23 ° C.
    Attention : Le formaldéhyde est toxique et nocif.
  8. Pour arrêter la réaction de fixation, ajouter 100 µL de glycine de 2,5 M dans chaque tube et centrifuger pendant 5 min à 3 000 x g à 4 ° C. Jeter le surnageant.
  9. Ajouter 1 mL de glacee tampon phosphate salin (PBS), centrifuger pendant 5 min à 3 000 x g à 4 ° C et éliminer le surnageant. Répétez cette opération deux fois (3 lavages au total).
    Remarque : Échantillons fixes peuvent être congelés flash par azote liquide et stockées à-80 ° C.
  10. Ajouter 500 µL de tampon de lyse 1 (50 mM 4 d’acide-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES)-KOH (pH 7.5), 140 mM NaCl, 1 mM EDTA acide (EDTA) (pH 8,0), 10 % p/v de glycérol, 0,5 % p/v NP-40, inhibiteur de protéase 0,25 % w/v Triton x X-100 et 0,1 cocktail) au culot, pipette plusieurs fois et faites-la tourner pendant 10 min à 4 ° C.
    Remarque : Tampon de lyse 1 devrait être filtré et stocké à 4 ° C avant utilisation.
  11. Centrifuger pendant 5 min à 3 000 x g à 4 ° C et éliminer le surnageant.
  12. Ajouter 1 mL de tampon de lyse 2 (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 0,5 mM EGTA et 0,1 x inhibiteur de la protéase cocktail) au culot, vortex et faites-la tourner pendant 10 min à 4 ° C.
    Remarque : Tampon de lyse 2 devrait être filtré et stocké à 4 ° C avant utilisation.
  13. Centrifuger pendant 5 min à 3 000 x g à 4 ° C et éliminer le surnageant.
  14. Ajouter 800 µL de tampon immunoprécipitation (RIPA) avec inhibiteur de protéase 1 x cocktail au culot et resuspendre le culot de pipetage.
  15. Centrifuger pendant 5 min à 3 000 x g à 4 ° C et éliminer le surnageant.
  16. Ajouter 500 µL de tampon RIPA avec inhibiteur de protéase de 1 x cocktail.
  17. Centrifuger pendant 5 min à 3 000 x g à 4 ° C et éliminer le surnageant.
  18. Ajouter 1 mL de tampon RIPA avec inhibiteur de protéase de 1 x cocktail. Procéder immédiatement à l’étape suivante.

3. la chromatine de cisaillement

  1. Transférer le lysat dans un tube de sonicateur et ensuite placer le tube sur un ultrasonicator.
  2. La chromatine de cisaillement avec les paramètres suivants : température : 4 ° C ; les incidents puissance crête : 175 W ; facteur d’utilisation : 10 % ; cycles/rafale : 200 ; et l’heure : 2 400 s.
  3. Transférer l’échantillon dans un 1,5 mL-protéine faible liaison tube et centrifuger pendant 5 min à 20 000 x g à 4 ° C.
  4. Recueillir le liquide surnageant dans un nouveau tube de liaison faible de protéines.
    Remarque : L’échantillon peut être flash congelés dans l’azote liquide et conservé à-80 ° C.

4. contrôle de l’ADN (réticulation inverser)

  1. Mélanger 20 µL du lysat et 180 µL de tampon d’élution ChIP (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 300 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8,0) et 1 % w/v dodécylsulfate de sodium (SDS)) dans un tube de polymerase chain reaction (PCR). Incuber l’échantillon à 65 ° C dans un thermocycleur pendant 6 h avec le couvercle thermocycleur ouvert. Laisser le couvercle du thermocycleur ouvert afin d’éviter trop de dénaturation.
    Remarque : La mémoire tampon d’élution puce devrait être filtré et conservé à température ambiante avant utilisation. L’incubation peut être étendue pour la nuit.
  2. Ajouter 1 µL de 10 mg/mL RNase A, vortex et incuber à 37 ° C pendant 30 min.
  3. Ajouter 6,5 µL de 15 mg/mL protéinase K, vortex et incuber à 55 ° C pendant 60 min.
  4. La réaction d’un tube de liaison faible de l’ADN de transfert, ajouter 4 µL de glycogène de 5 mg/mL et vortex. Puis, ajouter 200 µL de phénol/chloroforme/isoamylique alcool (25:24:1) et centrifuger pendant 5 min à 18 000 x g à la température ambiante.
  5. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de liaison faible d’ADN. Ajouter 200 µL de tampon Tris-EDTA-NaCl (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0) et 200 mM NaCl) pour le reste de la solution phénol/chloroforme/isoamylique alcool et centrifuger pendant 5 min à 18 000 x g à la température ambiante. Recueillir le liquide surnageant et mélanger avec le surnageant première.
  6. Ajouter 900 µL d’éthanol glacé et incuber pendant 1 h à-20 ° C.
    Remarque : Cette incubation peut être prolongée à 4 - 6 h.
  7. Centrifuger pendant 30 min à 18 000 x g à 4 ° C.
  8. Jeter le surnageant. Ajouter 1 mL d’éthanol glacé de 75 % au culot et centrifuger pendant 30 min à 18 000 x g à 4 ° C. Répétez cette étape (deux lavages au total).
  9. Jeter le surnageant soigneusement et sécher à l’air pendant 1 min à température ambiante.
  10. Ajouter 50 µL de tampon Tris-EDTA (TE) et dissoudre l’ADN en incubation à température ambiante pendant 30 min ou à 4 ° C durant la nuit. Évitez de vortex ou pipetage. Gardez cet ADN comme « entrée » et l’utiliser pour la préparation de la bibliothèque si nécessaire.
  11. Mesurer la concentration d’ADN avec un fluorimètre selon les instructions du fabricant (voir Table des matières) et vérifier la distribution granulométrique avec une machine d’électrophorèse de microfluidique (voir données représentatives illustrées à la Figure de 2 a). utilisation 10 ng ou moins ADN avec ce test.
    Remarque : Les Fragments de 100 à 500 paires de bases (pb) devraient compenser 50 % ou plus de l’ADN.

5. purification d’affinité anticorps anti-drapeau

Remarque : Pour le neurone tChIP-Seq, les tissus du cerveau de 8 souris sont généralement utilisés pour un échantillon de tChIP-Seq pour préparer 2 ng d’ADN purifié par tandem immunitaire-purification (voir étape 7.1). Dans nos mains, 0,1 ng d’ADN encore fournie qualité des bibliothèques d’ADN pour ChIP-Seq (Kadota, inédit). Ainsi, en théorie, une souris peut être suffisante pour effectuer le neurone tChIP-suiv. Le montant demandé doit être optimisé pour le type de tissus et de cellules d’intérêt. Pour le contrôle négatif de l’expérience de la purification de l’imumuno, les tissus cérébraux lysat de souris sans n’importe quelle expression H2B-drapeau devraient être préparées et utilisées.

  1. Pipeter 200 µL de billes magnétiques conjugué à l’immunoglobuline mouton anti-souris G (IgG) dans un tube à faible liaison aux protéines.
  2. Placer le tube sur un support magnétique et attendre 1 min pour le surnageant à devenir clair. Jeter le surnageant, ajouter 1 mL de PBS glacee et vortex. Répétez cette étape (deux lavages au total).
  3. Ajouter 20 µL de 1 mg/mL d’anticorps anti-drapeau et tourner pendant 5 heures à 4 ° C.
    Remarque : Cette incubation peut être étendue pour la nuit.
  4. Laver les perles après étape 5.2. Placer les billes dans un tube de 15 mL.
  5. Remettre en suspension les perles en 1110 µL de tampon RIPA et puis ajouter 900 µL de 10 x blocage réactif, 180 µL de 50 x solution de Denhardt, 10 µL de 100 x inhibiteur de la protéase cocktail et 6,8 mL du lysat préparé à l’étape 3. Diviser ce mélange en 5 tubes de liaison faible de protéines. Tourner pendant 6 h à 4 ° C.
    Remarque : Cette incubation peut être étendue pour la nuit.
  6. Placer le tube sur le support magnétique et attendre 1 min pour le surnageant à devenir clair. Jeter le surnageant, ajouter 1 mL de tampon RIPA et mélanger doucement. Répétez cette étape 5 fois (6 lavages au total). Centraliser toutes les perles dans un tube de liaison basse seule protéine.
  7. Ajouter 200 µL de tampon d’élution ChIP et tourner pendant 15 minutes à température ambiante. Vérifier la qualité de l’ADN comme indiqué au point 4.11 (voir données représentatives illustrées à la Figure 2 b et C). Procéder immédiatement à l’étape suivante.

6. affinity Purification par l’anticorps Anti-H3K4me3 et réticulation inverse

Remarque : La suivante perle préparation que étapes (6.1 à 6.4) devraient être effectuées avant l’étape 5,7.

  1. Distribuer 40 µL de billes magnétiques conjugué à anti-souris mouton IgG dans un tube de liaison faible 2 mL-protéine.
  2. Placer le tube sur le support magnétique et attendre 1 min pour le surnageant à devenir clair. Jeter le surnageant, ajouter 1 mL de PBS glacée et mélanger doucement. Répétez cette étape (deux lavages au total).
  3. Ajouter 4 µL de 1 mg/mL d’anticorps anti-H3K4me3 et tourner pendant 6 h à 4 ° C.
  4. Laver les perles après étape 6.2. Placer les billes dans un tube de liaison faible de 2 mL-protéine.
  5. Remettre en suspension les perles en 1558 µL de tampon RIPA et puis ajouter 200 µL de 10 x blocage réactif, 40 µL de 50 x solution de Denhardt, 2 µL de 100 x inhibiteur de la protéase cocktail et 200 µL de l’éluat établi en étape de 5,7. Faire tourner toute la nuit à 4 ° C.
    Remarque : Le SDS dans le tampon d’élution ChIP a été dilué 10 fois plus dans cette incubation.
  6. Placer le tube sur le support magnétique et attendre 1 min pour le surnageant à devenir clair. Jeter le surnageant, ajouter 1 mL de tampon RIPA et mélanger doucement. Répétez cette opération 4 fois (5 lavages au total). Après le dernier lavage, transférer les billes dans un tube de liaison faible d’ADN et éliminer le surnageant.
  7. Ajouter 200 µL de tampon d’élution ChIP et tourner pendant 15 minutes à température ambiante. Transférer l’éluat dans une nouvelle bindingTube faible de l’ADN.
    Remarque : L’éluat peut être conservé à-80 ° C.
  8. Suivre l’étape 4 pour decrosslinking de l’ADN. Remettre en suspension l’ADN purifié dans 20 µL de tampon TE.
  9. Vérifier la qualité de l’ADN comme indiqué au point 4.11 (voir données représentatives illustrées à la Figure 2D). (facultatif) Effectuer des analyses par PCR quantitative enrichissement comme décrit plus haut2. Dix fois ou plus grand enrichissement doit être observé.

7. bibliothèque Construction

  1. Pour chaque entrée et chaque échantillon d’ADN de puce, calculer la proportion de l’ADN dans la région de 100 – 500 pb à l’aide de la fonction d’analyse frottis du logiciel pour l’appareil d’électrophorèse microfluidiques. Estimer le volume de l’échantillon nécessaire pour obtenir 2 ng de 100 – 500 bp ADN. Utiliser 20 ng ADN dans la gamme 100 – 500 PB comme l’exemple « d’entrée ».
  2. Pipetter des échantillons d’ADN dans les tubes PCR 8-bande et ajouter H2O pour porter le volume total de 10 µL. (facultatif) si le volume de l’ADN dépasse 10 µL, proportionnellement mesurent-vers le haut, la réaction suivante de fin-réparation et la sélection de la taille.
  3. Préparer le mélange maître fin-réparation (voir Table des matières). Ajouter 4 µL du mélange maître fin-réparation de l’ADN et incuber 30 min à 20 ° C.
  4. Ajouter 36 µL de 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 et 0,6 x volume (30 µL) de solid phase billes magnétiques réversible immobilisation (SPRI) et incuber pendant 5 min à température ambiante.
  5. Placer le tube sur un support magnétique et attendre jusqu'à ce que le liquide surnageant devient clair.
  6. Transférer le surnageant dans un nouveau tube, ajouter 1,2 x volumes (60 µL) de billes magnétiques SPRI et incuber 5 min à température ambiante.
  7. Placer le tube sur un support magnétique et attendre jusqu'à ce que le liquide surnageant devient clair.
  8. Laver les perles deux fois avec 200 µL de 80 % EtOH, tenant encore sur l’aimant.
  9. Brièvement, centrifuger le tube afin de recueillir l’EtOH résiduel en bas et placez-le sur l’aimant. Enlevez complètement l’EtOH résiduelle.
  10. Laissez le couvercle du tube ouvert pendant 1-2 min permettre l’EtOH à s’évaporer.
  11. Fermer le couvercle et gardez le tube sur la glace.
    Remarque : Vous avez maintenant obtenu ADN sélectionnée à la taille de 100 – 500 pb sur les perles. On trouvera des renseignements supplémentaires concernant la sélection de taille double sur le site du fabricant (www.beckman.com).
  12. Préparer A-tailing master mix (voir Table des matières).
  13. Remettre en suspension les perles (à partir de 7.10 étape) avec 10 µL du mélange maître A-tailing et incuber 30 min à 30 ° C.
  14. Ajouter 1,8 x volume (18 µL) de polyéthylène glycol (PEG) / solution de NaCl et incuber pendant 5 min à température ambiante.
  15. Suivez les étapes 7,7-7.11 pour purifier l’ADN.
  16. Préparer le mélange tampon ligature (voir Table des matières).
  17. Distribuer 8 µL du mélange tampon ligature sur les perles (à partir d’étape 7.14), ajouter 1 µL de 1 adaptateur µM et remettre en suspension les perles. Utilisez 1 µL de 5 adaptateur µM pour l’échantillon d’entrée. Envisagez d’utiliser des adaptateurs différents pour chaque échantillon pour le multiplexage.
  18. Ajouter 1 µL d’ADN Ligase et incuber pendant 15 min à 20 ° C.
  19. Ajouter 1,0 x volume (10 µL) de solution de PEG/NaCl, remettre en suspension les perles et incuber pendant 5 min à température ambiante.
  20. Suivez les étapes 7,7-7.10 pour purifier l’ADN.
  21. Pipetter 25 µL de 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 dans le tube et remettre en suspension les perles.
  22. Ajouter 1,0 x volume (25 µL) de solution de PEG/NaCl et incuber pendant 5 min à température ambiante.
  23. Suivez les étapes 7,7-7.10 pour purifier l’ADN.
  24. Pipetter : 11 l 10 mm Tris-Cl, pH 8,5 dans le tube et remettre en suspension les perles.
  25. Placer le tube sur un support magnétique et attendre jusqu'à ce que le liquide surnageant devient clair.
  26. Recueillir le liquide surnageant dans un nouveau tube de PCR 8-bande.
  27. Préparer le mélange maître en temps réel de PCR (voir la documentation pour plus de détails).
  28. Pipeter 8,5 µL du mélange maître PCR en temps réel une plaque 384 puits quantitative de la PCR (qPCR) et ajouter 1,5 µL de l’adaptateur ligaturé ADN (à partir de 7.26 étape).
  29. Déposer 10µl de chaque norme fluorescente dans les puits vides.
  30. Effectuer une PCR en temps réel avec le programme suivant : (98 ° C pour 45 s) x 1 cycle, (98 ° C pendant 15 s, 60 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 30 s) x 20 cycles, et (72 ° C pendant 60 s) x 1 cycle.
  31. Déterminer le nombre de cycles PCR nécessaires pour atteindre l’intensité de la fluorescence de la norme 2 fluorescents.
  32. Préparer le maître PCR mix (voir Table des matières).
  33. Pipetter 11,5 µL du mélange maître PCR dans l’ADN d’adaptateur-ligaturé restante (à partir de 7.26 étape) et effectuer des PCR comme indiqué dans l’étape 7 h 30 avec les cycles PCR déterminés dans l’étape 7.31.
  34. Ajouter 1,0 x volume (20 µL) de solution de PEG/NaCl et incuber pendant 5 min à température ambiante.
  35. Suivez les étapes 7,7-7.10 pour purifier l’ADN.
  36. Pipeter 20 µL de 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 dans le tube et remettre en suspension les perles.
  37. Placer le tube sur un support magnétique et attendre jusqu'à ce que le liquide surnageant devient clair.
  38. Recueillir le liquide surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL-ADN peu contraignantes.
  39. Vérifier la qualité de la bibliothèque comme indiqué au point 4.11 (voir données représentatives illustrées à la Figure 2E et F). Utilisez 1 µL de l’échantillon d’ADN de bibliothèque. (facultatif) Effectuer une analyse de l’enrichissement par qPCR comme décrit plus haut 2. Dix fois ou plus grand enrichissement doit être observé.

8. le séquençage

  1. Les bibliothèques dans un séquenceur de prochaine génération de séquence (voir données représentatives illustrées à la Figure 3).
    Note : La profondeur de séquence suffisante pour l’analyse des données varie selon la taille du génome de l' organisme3. Pour l’homme et la souris, il est recommandé d’obtenir au moins 20 millions de single-end se lit comme suit. Selon le rendement des lectures, il pourrait être rentable de multiplexage.

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Résultats

Nous décrivons ici la dissection des tissus, lyse cellulaire, fixation, purification de tandem de la chromatine et ADN bibliothèque préparation pour la prochaine génération de séquenceurs. Au cours de la procédure, on peut tester la qualité de l’ADN, qui est la clé pour le séquençage réussi, à de multiples étapes (Figure 2). Puisqu’un seul nucléosome est généralement entouré de 147 bp ADN 4, cisaillé ADN ne doit pas être inférieure à c...

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Discussion

Notre protocole a été optimisé pour les neurones du cerveau de souris, dans lequel l’expression de l’indicateur-étiquetées H2B est induite par injection de tamoxifène. Promoteurs, utilisés pour l’expression H2B, matériaux de tissu de départ et la quantité des tissus sont des paramètres pivotales pour succès tChIP-suiv. Ainsi, l’optimisation de ces facteurs devrait considérer pour chaque type de cellules d’intérêt.

Une étape essentielle entre les procédures utilisées dans le présent protocole e...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions tous les membres du laboratoire Iwasaki pour une lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu en partie par une subvention pour la recherche scientifique sur les domaines innovants (#26113005 S.N. et JP17H05679 à s.c.) ; une subvention pour les jeunes scientifiques (A) (JP17H04998 à S.C.) depuis le ministère de l’éducation, sciences, Sports et Culture du Japon (MEXT) ; et la pionnière des projets « Évolution cellulaire » et tous les projet de RIKEN « Maladie et épigénome » de RIKEN (à S.N. et S.C.).

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Matériaux

2
Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube Protéiné LoBind, 2 mLN° Eppendorf 0030108132Pour la lyse cellulaire
Tube Protein LoBind, 1,5 mLN° Eppendorf 0030108116Pour la préparation de ChIP et la préparation de banques
d’ADN, tube LoBind, 1,5 mLN° Eppendorf 0030108051Pour la préparation de ChIP et de banques
Tube PCR à 8 bandesBIO-BIK3247-00Pour la préparation de ChIP et de banques
SK MillTOKKENSK-200Broyeur cryogénique pratique pour fabriquer de la poudre cellulaire pour la fixation
Balle métalliqueTOKKENSK-100-DLC10Accessoire de SK Mill
Tube en acier inoxydable de 2 mLTOKKENTK-AM5-SUSUne option pour cellule
Porte-tube en acier inoxydable de lyse 2 mLTOKKENSK-100-TLUne option pour la lyse cellulaire
16 % formaldéhyde (w/v), sans méthanolPierce28906Pour fixer les cellules. Préparez une solution à 1 % avant utilisation.
GlycineNacalai Tesque17109-35Prepare 2.5 M stock
D-PBS (-)(1x)Nacalai Tesque14249-24Pour le lavage du lysat et de l’ADN purifié
HEPESNacalai Tesque02443-05Pour le tampon de lyse 1. Préparez un bouillon de 1 M, pH 7,5.
5 M NaCl, qualité de biologie moléculaireNacalai Tesque06900-14Pour tampon de lyse 1, tampon de lyse 2, tampon d’élution ChIP et tampon Tris-EDTA-NaCl
0,5 M EDTA, qualité de biologie moléculaireWako Pure Chemical Industries, Ltd.311-90075Pour le tampon de lyse 1, le tampon de lyse 2, le tampon d’élution ChIP et le tampon Tris-EDTA-NaCl
GlycérolWako Pure Chemical Industries, Ltd.072-04945Pour tampon de lyse 1
NP-40Nacalai Tesque25223-75Pour tampon de lyse 1
Triton X-100, grade de biologie moléculaireNacalai Tesque12967-32Pour tampon de lyse 1
TrisNacalai Tesque35406-91Pour tampon de lyse 2, tampon d’élution ChIP et tampon Tris-EDTA-NaCl. Préparez 1 M, pH 8,0 bouillon.
0,1 M EGTA pH neutreNacalai Tesque08947-35Pour tampon de lyse 2
Cocktail inhibiteur de protéase (100x)Nacalai Tesque25955-24Pour bloquer la dégradation des protéines
Tampon RIPAThermo Fisher Scientific89900Pour la lyse cellulaire et le lavage
milliTUBE 1 mL AFA FiberCovaris520130Tube sonicateur. Accessoire de l’ultrasoniseur focalisé
Ultrasonateur focaliséCovarisS220 ou E220Pour digérer l’ADN dans une taille adéquate pour ChIP-Seq
UltraPure 10 % SDSThermo Fisher Scientific15553-027Pour le tampon d’élution ChIP
RNase ANacalai Tesque30141-14Pour purifier l’ADN du lysat
Protéinase K, recombinante, PCR GradeSigma-Aldrich3115887001Pour purifier l’ADN de l’éthanol lysat
Wako Pure Chemical Industries, Ltd.054-07225Faire une solution à 70 %
Anticorps monoclonal anti-FLAG M2 produit chez la sourisSigma-AldrichF1804Pour purifier la chromatine exprimée dans les cellules d’intérêt
Dynabead M-280 Mouton Anti-souris IgGThermo Fisher Scientific11201DCela peut être utilisé pour anti-FLAG IP et anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-méthyl histone H3 (K4), anticorps monoclonal de sourisWako Pure Chemical Industries, Ltd.301-34811Tout autre anticorps qui fonctionne pour l’analyse ChIP fonctionnera
10x Réactif de blocageSigma-Aldrich11096176001Pour le blocage pendant la purification par affinité
Denhardt' s solutionNacalai Tesque10727-74Pour le blocage lors de la purification par affinité
Glycogène (5 mg/ml)Thermo Fisher ScientificAM9510Pour purifier l’ADN du lysat
Fluorimètre Qubit 2.0Thermo Fisher ScientificQ32866Pour la quantification de l’ADN isolé
Qubit dsDNA HS Kit de dosageThermo Fisher ScientificQ32851Pour la quantification de l’ADN isolé
Tube de 0,5 mLAxygen10011-830Pour la quantification par Qubit
Phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25:24:1)Nacalai Tesque25970-56Pour purifier l’ADN des billes de lysat
AMPure XPBeckman CoulterA63881Perles magnétiques SPRI pour la préparation de la bibliothèque
Étagère à glace en métalFunakoshiIR-1Pour conserver le lysat cellulaire congelé
Refroidisseurd’échantillons New England BiolabsT7771SAide à réparer les cellules avec un minimum de dommages
2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939BAPour vérifier la qualité des fragments d’ADN isolés. Un autre analyseur de fragments peut être utilisé.
Bioanalyzer 2100 Expert SoftwareAgilent TechnologiesG2946CAFourni avec le
kit d’ADN haute sensibilitéAgilent Technologies5067-4626Pour vérifier la qualité des fragments d’ADN isolés
KAPA LTP Library Preparation KitRoche07961898001Fourni avec 10 tampons de réparation d’extrémité KAPA, un mélange d’enzymes de réparation d’extrémité KAPA, un tampon de queue KAPA, une enzyme de queue KAPA, un tampon de ligature KAPA, un ligase d’ADN KAPA et des
codes-barres d’ADN NEXTflex PEG/BIOO ScientificNOVA-514101pour la préparation de bibliothèques. Fourni avec des adaptateurs de codes-barres ADN et un mélange d’amorces.
KAPA Real-Time Library AmplificationKit Roche07959028001Fourni avec 2x KAPA HiFi HS Real-Time PCR Master Mix, PCR Primer Mix et Fluorescent
Standards 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMixRocheKM2602Pour la préparation de la bibliothèque. De plus, cette enzyme peut être nécessaire pour le kit d’amplification de la bibliothèque en temps réel KAPA
EBQiagen1908610 mM Tris-Cl, pH 8,5 pour l’élution de l’ADN
Plaque qPCR à 386 puitsThermo Fisher Scientific4309849Pour la PCR en temps réel
QuantStudio 7 Flex Système de PCR en temps réelThermo Fisher Scientific4485701Pour quantifier l’ADN
MicroAmp Film adhésif optiqueThermo Fisher Scientific4311971Pour la PCR en temps réel
Film adhésif transparent MicroAmpThermo Fisher Scientific4306311Pour le scellement des plaques
mixde réparation finale Combine 1.4 & micro ; L de 10x tampon de réparation d’extrémité KAPA, 1 & micro ; L de mélange d’enzymes de réparation des extrémités KAPA, et 1,6 & micro ; L de H2O
Master mixA-taling Combine 1 & micro ; L de tampon de résidus KAPA A, 0,6 & micro ; L de l’enzyme de suivi KAPA A, et 8,4 & micro ; L de H2O
tampons de ligatureCombiner 2 & micro ; L de tampon de ligature KAPA et 6 & micro ; L de H2O
mixCombine 5 & micro ; L de 2x KAPA HiFi HS Real-time PCR Master Mix, 0.35 µ ; L de mélange d’amorces PCR (10 & micro ; M de l’amorce avant AATGATACGGCGACCACCGAG et de l’amorce inverse CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), et 3,15 et micro ; L de mélange
PCRCombiner 10 & micro ; L de 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 & micro ; L de mélange d’amorces PCR, et 0,6 & micro ; L de H2O
Visionneuse de génomique intégrativeBroad InstituteIGV_2.3.88Navigateur de génome pour visualiser les données de séquençage
ADN olgionucléotide : 5&prime ;-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3&prime ;Eurofins GenomicsUne amorce pour amplifier la région promotrice de l’olgionucléotide de l’ADN GAPDH
: 5&prime ;-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3&prime ;Eurofins GenomicsUne amorce pour amplifier la région promotrice de GAPDH
SYBR Premix Ex Taq TakaraRR420LPour quantifier l’ADN correspondant à la région promotrice GADPH
Thermal Cycler DiceTakaraTP870Pour quantifier l’ADN correspondant à la région promotrice GADPH
Bioanalyzer NaCl Adaptateur MasterMélange de Master PCR en temps réel maître HO

Références

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  10. Zhao, Y., Garcia, B. A. Comprehensive catalog of currently documented histone modifications. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064(2015).
  11. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).

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