TChIP-Seq : Type-spécifiques des cellules épigénome profilage

Summary

Les auteurs décrivent un protocole étape par étape pour la chromatine tandem immunoprécipitation séquençage (tChIP-Seq) qui permet l’analyse de la modification d’histone génome cellule-spécifiques au type.

Abstract

Régulation épigénétique joue un rôle central dans l’expression des gènes. Étant donné que la modification d’histone a été découvert dans les années 1960, ses fonctions physiologiques et pathologiques ont été largement étudiées. En effet, l’avènement de la nouvelle génération séquençage en profondeur et immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) par l’intermédiaire des anticorps spécifiques d’histone modification a révolutionné notre vision de la régulation épigénétique au sein du génome. À l’inverse, les tissus sont généralement composent de types cellulaires différents, et leur mélange complexe pose des défis analytiques pour enquêter sur l’épigénome dans un type particulier de cellules. Afin d’examiner l’état de la chromatine spécifiques à un type de cellule dans une manière de tout le génome, nous avons développé récemment en tandem la chromatine immunoprécipitation le séquençage (tChIP-Seq), qui repose sur l’épuration sélective de la chromatine par des protéines histones tagged noyau de cellule types d’intérêt, suivie par ChIP-seq. L’objectif de ce protocole est l’introduction de meilleures pratiques de tChIP-suiv. Cette technique fournit un outil polyvalent pour enquête épigénome tissu-spécifique dans les modifications d’histone diverse et organismes modèles.

Introduction

Les tissus des animaux se composent de types cellulaires différents. La régulation des gènes dans chaque cellule définit le type de cellule. Modifications de la chromatine - modification histone et de méthylation de l’ADN - sous-tendent la spécificité cellulaire de type de l’expression génique. Ainsi, la mesure de régulation épigénétique dans chaque type de cellule a été désirée, mais il a été un défi technique.

Pour étudier l’épigénétique dans un type particulier de cellules, le séquençage de l’immunoprécipitation de la chromatine en tandem (tChIP-Seq) a été récemment mis au point ()Figure 1

Protocol

Toutes les méthodes décrites dans les présentes ont été approuvés par la division de la sécurité du RIKEN (H27-EP071) et réalisées avec les règlements et lignes directrices pertinentes.

1. dissection du tissu

1. Disséquer les tissus d’intérêt en petits morceaux (environ < 3 mm²) à l’aide de ciseaux fine de printemps.
   Remarque : Plus grands fragments de tissu sont plus longs à geler, et petits morceaux porteront sur des volumes plus importants de la mémoire tampon, qui peuvent affecter les résultats.
2. Ajouter les fragments de tissus disséqués à un récipient propre rempli d’azote liquide et les recueillir dans de....

Results

Nous décrivons ici la dissection des tissus, lyse cellulaire, fixation, purification de tandem de la chromatine et ADN bibliothèque préparation pour la prochaine génération de séquenceurs. Au cours de la procédure, on peut tester la qualité de l’ADN, qui est la clé pour le séquençage réussi, à de multiples étapes (Figure 2). Puisqu’un seul nucléosome est généralement entouré de 147 bp ADN ⁴, cisaillé ADN ne doit pas être inférieure à c.......

Discussion

Notre protocole a été optimisé pour les neurones du cerveau de souris, dans lequel l’expression de l’indicateur-étiquetées H2B est induite par injection de tamoxifène. Promoteurs, utilisés pour l’expression H2B, matériaux de tissu de départ et la quantité des tissus sont des paramètres pivotales pour succès tChIP-suiv. Ainsi, l’optimisation de ces facteurs devrait considérer pour chaque type de cellules d’intérêt.

Une étape essentielle entre les procédures utilisées dans le présent protocole e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tube Protéiné LoBind, 2 mL	N° Eppendorf	0030108132	Pour la lyse cellulaire
Tube Protein LoBind, 1,5 mL	N° Eppendorf	0030108116	Pour la préparation de ChIP et la préparation de banques
d’ADN, tube LoBind, 1,5 mL	N° Eppendorf	0030108051	Pour la préparation de ChIP et de banques
Tube PCR à 8 bandes	BIO-BIK	3247-00	Pour la préparation de ChIP et de banques
SK Mill	TOKKEN	SK-200	Broyeur cryogénique pratique pour fabriquer de la poudre cellulaire pour la fixation
Balle métallique	TOKKEN	SK-100-DLC10	Accessoire de SK Mill
Tube en acier inoxydable de 2 mL	TOKKEN	TK-AM5-SUS	Une option pour cellule
Porte-tube en acier inoxydable de lyse 2 mL	TOKKEN	SK-100-TL	Une option pour la lyse cellulaire
16 % formaldéhyde (w/v), sans méthanol	Pierce	28906	Pour fixer les cellules. Préparez une solution à 1 % avant utilisation.
Glycine	Nacalai Tesque	17109-35	Prepare 2.5 M stock
D-PBS (-)(1x)	Nacalai Tesque	14249-24	Pour le lavage du lysat et de l’ADN purifié
HEPES	Nacalai Tesque	02443-05	Pour le tampon de lyse 1. Préparez un bouillon de 1 M, pH 7,5.
5 M NaCl, qualité de biologie moléculaire	Nacalai Tesque	06900-14	Pour tampon de lyse 1, tampon de lyse 2, tampon d’élution ChIP et tampon Tris-EDTA-NaCl
0,5 M EDTA, qualité de biologie moléculaire	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	311-90075	Pour le tampon de lyse 1, le tampon de lyse 2, le tampon d’élution ChIP et le tampon Tris-EDTA-NaCl
Glycérol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	072-04945	Pour tampon de lyse 1
NP-40	Nacalai Tesque	25223-75	Pour tampon de lyse 1
Triton X-100, grade de biologie moléculaire	Nacalai Tesque	12967-32	Pour tampon de lyse 1
Tris	Nacalai Tesque	35406-91	Pour tampon de lyse 2, tampon d’élution ChIP et tampon Tris-EDTA-NaCl. Préparez 1 M, pH 8,0 bouillon.
0,1 M EGTA pH neutre	Nacalai Tesque	08947-35	Pour tampon de lyse 2
Cocktail inhibiteur de protéase (100x)	Nacalai Tesque	25955-24	Pour bloquer la dégradation des protéines
Tampon RIPA	Thermo Fisher Scientific	89900	Pour la lyse cellulaire et le lavage
milliTUBE 1 mL AFA Fiber	Covaris	520130	Tube sonicateur. Accessoire de l’ultrasoniseur focalisé
Ultrasonateur focalisé	Covaris	S220 ou E220	Pour digérer l’ADN dans une taille adéquate pour ChIP-Seq
UltraPure 10 % SDS	Thermo Fisher Scientific	15553-027	Pour le tampon d’élution ChIP
RNase A	Nacalai Tesque	30141-14	Pour purifier l’ADN du lysat
Protéinase K, recombinante, PCR Grade	Sigma-Aldrich	3115887001	Pour purifier l’ADN de l’éthanol lysat
	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-07225	Faire une solution à 70 %
Anticorps monoclonal anti-FLAG M2 produit chez la souris	Sigma-Aldrich	F1804	Pour purifier la chromatine exprimée dans les cellules d’intérêt
Dynabead M-280 Mouton Anti-souris IgG	Thermo Fisher Scientific	11201D	Cela peut être utilisé pour anti-FLAG IP et anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-méthyl histone H3 (K4), anticorps monoclonal de souris	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	301-34811	Tout autre anticorps qui fonctionne pour l’analyse ChIP fonctionnera
10x Réactif de blocage	Sigma-Aldrich	11096176001	Pour le blocage pendant la purification par affinité
Denhardt' s solution	Nacalai Tesque	10727-74	Pour le blocage lors de la purification par affinité
Glycogène (5 mg/ml)	Thermo Fisher Scientific	AM9510	Pour purifier l’ADN du lysat
Fluorimètre Qubit 2.0	Thermo Fisher Scientific	Q32866	Pour la quantification de l’ADN isolé
Qubit dsDNA HS Kit de dosage	Thermo Fisher Scientific	Q32851	Pour la quantification de l’ADN isolé
Tube de 0,5 mL	Axygen	10011-830	Pour la quantification par Qubit
Phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25:24:1)	Nacalai Tesque	25970-56	Pour purifier l’ADN des billes de lysat
AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	Perles magnétiques SPRI pour la préparation de la bibliothèque
Étagère à glace en métal	Funakoshi	IR-1	Pour conserver le lysat cellulaire congelé
Refroidisseur	d’échantillons New England Biolabs	T7771S	Aide à réparer les cellules avec un minimum de dommages
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	Pour vérifier la qualité des fragments d’ADN isolés. Un autre analyseur de fragments peut être utilisé.
Bioanalyzer 2100 Expert Software	Agilent Technologies	G2946CA	Fourni avec le
kit d’ADN haute sensibilité	Agilent Technologies	5067-4626	Pour vérifier la qualité des fragments d’ADN isolés
KAPA LTP Library Preparation Kit	Roche	07961898001	Fourni avec 10 tampons de réparation d’extrémité KAPA, un mélange d’enzymes de réparation d’extrémité KAPA, un tampon de queue KAPA, une enzyme de queue KAPA, un tampon de ligature KAPA, un ligase d’ADN KAPA et des
codes-barres d’ADN NEXTflex PEG/	BIOO Scientific	NOVA-514101	pour la préparation de bibliothèques. Fourni avec des adaptateurs de codes-barres ADN et un mélange d’amorces.
KAPA Real-Time Library Amplification	Kit Roche	07959028001	Fourni avec 2x KAPA HiFi HS Real-Time PCR Master Mix, PCR Primer Mix et Fluorescent
Standards 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Roche	KM2602	Pour la préparation de la bibliothèque. De plus, cette enzyme peut être nécessaire pour le kit d’amplification de la bibliothèque en temps réel KAPA
EB	Qiagen	19086	10 mM Tris-Cl, pH 8,5 pour l’élution de l’ADN
Plaque qPCR à 386 puits	Thermo Fisher Scientific	4309849	Pour la PCR en temps réel
QuantStudio 7 Flex Système de PCR en temps réel	Thermo Fisher Scientific	4485701	Pour quantifier l’ADN
MicroAmp Film adhésif optique	Thermo Fisher Scientific	4311971	Pour la PCR en temps réel
Film adhésif transparent MicroAmp	Thermo Fisher Scientific	4306311	Pour le scellement des plaques
mix			de réparation finale Combine 1.4 & micro ; L de 10x tampon de réparation d’extrémité KAPA, 1 & micro ; L de mélange d’enzymes de réparation des extrémités KAPA, et 1,6 & micro ; L de H2O
Master mix			A-taling Combine 1 & micro ; L de tampon de résidus KAPA A, 0,6 & micro ; L de l’enzyme de suivi KAPA A, et 8,4 & micro ; L de H2O
		tampons de ligature	Combiner 2 & micro ; L de tampon de ligature KAPA et 6 & micro ; L de H2O
mix			Combine 5 & micro ; L de 2x KAPA HiFi HS Real-time PCR Master Mix, 0.35 µ ; L de mélange d’amorces PCR (10 & micro ; M de l’amorce avant AATGATACGGCGACCACCGAG et de l’amorce inverse CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), et 3,15 et micro ; L de mélange
		PCR	Combiner 10 & micro ; L de 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 & micro ; L de mélange d’amorces PCR, et 0,6 & micro ; L de H2O
Visionneuse de génomique intégrative	Broad Institute	IGV_2.3.88	Navigateur de génome pour visualiser les données de séquençage
ADN olgionucléotide : 5&prime ;-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3&prime ;	Eurofins Genomics		Une amorce pour amplifier la région promotrice de l’olgionucléotide de l’ADN GAPDH
: 5&prime ;-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3&prime ;	Eurofins Genomics		Une amorce pour amplifier la région promotrice de GAPDH
SYBR Premix Ex Taq Takara		RR420L	Pour quantifier l’ADN correspondant à la région promotrice GADPH
Thermal Cycler Dice	Takara	TP870	Pour quantifier l’ADN correspondant à la région promotrice GADPH