Method Article

Machine Learning et sans étiquette d’Identification des sous-types de lymphocytes à l’aide de l’imagerie tridimensionnelle Phase Quantitative

DOI:

10.3791/58305

⸱

November 19th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, University of Cambridge, 2Department of Physics, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3KAIST Institute for Health Science and Technology, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 4Tomocube, Inc., 5Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 6Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 7Department of Applied Physics, Stanford University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs décrivent un protocole d’identification des sous-types de lymphocytes en utilisant l’imagerie quantitative phase et un algorithme d’apprentissage machine exempte d’étiquette. Mesures de l’indice de réfraction 3D tomographies des lymphocytes présentent 3D informations morphologiques et biochimiques des cellules individuelles, qui sont ensuite analysées grâce à un algorithme d’apprentissage automatique pour l’identification des types de cellules.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons ici un protocole d’identification exempte d’étiquette des sous-types de lymphocytes en utilisant l’imagerie quantitative phase et apprentissage automatique. Identification des sous-types de lymphocytes est importante pour l’étude de l’immunologie ainsi que diagnostic et le traitement de diverses maladies. Actuellement, des méthodes standard pour la classification des types de lymphocytes s’appuient sur l’étiquetage des protéines membranaires spécifiques via des réactions antigène-anticorps. Toutefois, ces techniques d’étiquetage portent les risques potentiels d’altérer les fonctions cellulaires. Le protocole décrit ici permet de surmonter ces défis en exploitant les contrastes optiques intrinsèques, mesurés par imagerie 3D volet quantitatif et un algorithme d’apprentissage automatique. Mesure des tomographies 3D indice de réfraction (RI) des lymphocytes fournit des informations quantitatives sur la morphologie 3D et les phénotypes des cellules individuelles. Les paramètres biophysiques extraites des tomographies de RI 3D mesurées sont ensuite quantitativement analysés avec un algorithme d’apprentissage machine permettant une identification des types de lymphocytes au niveau unicellulaire exempte d’étiquette. Nous mesurons les tomographies RI 3D des lymphocytes B, T CD4 + et CD8 + T et identifié leurs types de cellules avec plus de 80 % exactitude. Dans ce protocole, nous décrivons la procédure détaillée pour l’isolement de lymphocytes, l’imagerie 3D volet quantitatif et apprentissage automatique pour l’identification des types de lymphocytes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les lymphocytes peuvent être classés en différents sous-types dont B, d’assistance (CD4 +) T cytotoxiques (CD8 +) T et T régulateurs des cellules. Chaque type de lymphocyte a un rôle différent dans le système immunitaire adaptatif ; par exemple, les lymphocytes B produisent des anticorps, alors que les lymphocytes T détecter les antigènes spécifiques, d’éliminer les cellules anormales et réglementent les lymphocytes B. Règlement et fonction lymphocytaire est étroitement contrôlée par et associés à diverses maladies dont les cancers1et maladies auto-immunes2infections virales3. Ainsi, l’identification des types de lymphocytes est importante de comprendre leurs rôles physiopathologiques de ces maladies et d’immunothérapie dans les cliniques.

Actuellement, les méthodes de classification des types de lymphocytes s’appuient sur réactions antigène-anticorps en ciblant les protéines de la membrane de surface spécifique ou de marqueurs de surface4. Ciblage des marqueurs de surface est une méthode précise et exacte pour déterminer les types de lymphocytes. Cependant, elle nécessite des réactifs coûteux et procédures fastidieuses. En outre, il comporte des risques de la modification des structures de protéines membranaires et la modification des fonctions cellulaires.

Pour surmonter ces défis, le protocole décrit ici présente l’identification exempte d’étiquette des types de lymphocytes à l’aide de 3D phase quantitative imaging (QPI) et5en apprentissage automatique. Cette méthode permet la classification des types de lymphocytes au niveau cellule unique basée sur l’information morphologique extraite de l’imagerie 3D exempte d’étiquette de lymphocytes individuels. Contrairement aux techniques de microscopie de fluorescence conventionnels, QPI utilise l’indice de réfraction (RI) des distributions (propriétés optiques intrinsèques des tissus et de cellules vivantes) comme contraste optique6,7. Les tomographies RI des lymphocytes individuels représentent des informations phénotypiques spécifiques aux sous-types des lymphocytes. Dans ce cas, pour pouvoir systématiquement utiliser 3D RI tomographies des lymphocytes individuels, un algorithme d’apprentissage supervisé machine a été utilisé.

En utilisant diverses techniques QPI, les 3D tomographies RI des cellules ont été activement utilisées pour l’étude de la physiopathologie de la cellule parce qu’ils fournissent une étiquette libre, quantitative imaging capacité8,9,10, 11,12,13. Aussi, les distributions de RI 3D de cellules individuelles peuvent fournir des informations morphologiques, biochimiques et biomécaniques sur les cellules. 3D RI tomographies ont été précédemment utilisés dans les domaines de l’hématologie14,15,16,17, maladies infectieuses18,19, 20, immunologie21, cell biology22,23, inflammation24, cancer25, neuroscience26,,27,28de la biologie du développement, toxicologie 29et microbiologie12,30,31,32.

Bien que 3D RI tomographies fournissent des détails morphologiques et biochimiques des cellules, la classification des sous-types de lymphocytes est difficile à réaliser par simplement d’imagerie 3D RI tomographies5. Systématiquement et quantitativement exploiter les tomographies de RI 3D mesurées pour la classification de type de cellule, nous avons utilisé un algorithme d’apprentissage machine. Récemment, plusieurs ouvrages ont été signalés, dans quelle phase quantitative des images de cellules ont été analysées avec divers machine learning algorithmes33, y compris la détection des microorganismes34, classification du genre bactérien35 , 36, détection rapide et sans étiquette de l’anthrax spores37, automatisé d’analyse des spermatozoïdes38, analyse des cellules de cancer39,40et la détection de macrophage activation41.

Ce protocole prévoit la procédure détaillée pour effectuer exempte d’étiquette d’identification des types de lymphocytes au niveau des cellules individuelles à l’aide de 3D QPI et apprentissage automatique. Cela inclut : isolement 1) des lymphocytes de sang de souris, lymphocytes 2) Tri par écoulement cytometry, QPI 3) 3D, 4) quantitative trait extraction de 3D RI tomographies et apprentissage 5) supervisé pour identifier les types de lymphocytes.

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Protocol

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Soins des animaux et des procédures expérimentales ont été effectuées en vertu de l’approbation de l’animalerie institutionnelle et utilisation Comité du KAIST (KA2010-21, KA2014-01 et KA2015-03). Toutes les expériences dans cette étude ont été effectuées conformément aux principes directeurs adoptés.

1. les lymphocytes isolement du sang de souris

  1. Une fois une souris C57BL/6J est euthanasiée par inhalation de CO2 , insérer une aiguille 26-G dans le coeur de souris et recueillir 0,3 mL de sang. Directement mettre en sang dans un tube avec 100 U/mL de solution d’héparine dilué avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    Remarque : Les lymphocytes de la rate peuvent également être isolés.
  2. Centrifuger le tube à 400 x g pendant 5 min à 4 ° C.
  3. Ajouter 0,5 mL de tampon de lyse d’ammonium-chlorure de potassium dans le tube et il retourner doucement quelques fois pour mélanger la solution.
  4. Incuber les tubes à température ambiante (RT) pendant 5 min.
  5. Laver les cellules en ajoutant 4,5 mL de PBS et centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 ° C, deux fois.
  6. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 100 µL de milieu RPMI 1640 frais avec 10 % sérum fœtal (SVF).
  7. Ajouter 0,1 µg d’anticorps CD16/32 (2.4G2) dans le tube pour le blocage.
  8. Maintenir le tube sur la glace.

2. régulateur de cytométrie en flux et tri des sous-types de lymphocytes

NOTE : Tri selon le type de cellules, les lymphocytes est essentiel pour l’établissement de la cellule de réalité-terrain (c'est-à-dire correct) tapez les étiquettes pour former et tester un classifieur de type cellulaire en apprentissage supervisé. Cytométrie en flux, une méthode de l’étalon-or, est utilisé pour identifier et séparer les lymphocytes42.

  1. Faire un mélange de marqueur de surface anticorps dans 100 µL de milieu RPMI 1640 frais de coloration [10 % FBS, 0,1 µg de CD3e (17A2), CD8a (53-6,7), CD19 (1D 3), CD45R (B220, RA3-6 b 2) et NK1.1 (PK136)] et 0,25 µg d’anticorps anti-CD4 (GK1.5) cible B, lymphocytes T CD4 + et CD8 + T lymphocytes humains.
  2. Ajouter 100 µL du mélange anticorps à la suspension de cellules (obtenue à l’étape 1.8).
  3. Incuber pendant 25 minutes sur la glace.
  4. Laver les cellules en ajoutant 5 mL de PBS et centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 ° C, deux fois.
  5. Resuspendre le culot dans 5 mL de milieu RPMI 1640 frais avec 10 % FBS et 2,5 µg de DAPI (4', 6-diamidino-2-phénylindole).
  6. Collecter séparément chaque type de lymphocyte par cytométrie en flux, en utilisant les niveaux de fluorescence des marqueurs décrites ci-dessus. En même temps exclure les cellules mortes en utilisant les signaux DAPI.
    Remarque : Les protocoles détaillés concernant l’écoulement cytometry-base cell tri ont été décrits précédemment42.

3. 3D Phase Quantitative Imaging

  1. Garder les lymphocytes triés sur la glace tout au long des procédures d’imagerie, qui devrait être terminé dans les 5 h (depuis l’isolement de lymphocytes de la souris) pour éviter des dommages aux cellules et les modifications biochimiques.
  2. Sélectionnez un type de cellules triées (parmi les lymphocytes B, T CD4 + et CD8 + T) et diluer l’échantillon (obtenu à l’étape 2.6) pour 180 cellules/µL avec milieu RPMI de condition d’imagerie optimale (c.-à-d., une cellule par simple field-of-view).
  3. Charger les 120 μl de l’échantillon dilué dans une chambre d’imagerie par injection lente. Vérifier soigneusement la présence de bulles dans la chambre d’imagerie avec l’échantillon. S’il y a des bulles, soigneusement supprimer, comme ils vont compromettre la qualité des mesures.
  4. Acquérir des tomographies de RI 3D à l’aide d’un microscope phase quantitatif 3D commercial, ou holotomography et son logiciel d’imagerie.
    NOTE : Des informations détaillées sur l’installation expérimentale se trouvent dans le manuscrit original5.
    1. Déposer une goutte d’eau distillée sur le dessus de la lentille de l’objectif du microscope.
    2. Placez la chambre d’imagerie avec l’échantillon sur l’étape de traduction du microscope et d’ajuster son emplacement afin d’aligner l’échantillon avec la lentille de l’objectif.
    3. Ajustez les positions axiales des lentilles objectif et condenseur en cliquant sur mise au point et la Surface, respectivement, sur l’onglet « Calibration » des perspectives « Microscope » du logiciel d’imagerie.
    4. Aligner les lentilles de l’objectif et condenseur en cliquant sur Mode Auto. Vous pouvez également utiliser le Mode balayage et de régler manuellement les lentilles afin que les modèles d’éclairage sont localisées à la région centrale du champ-de-vue.
    5. Retournez au Mode Normal et ajuster l’étape de traduction pour localiser une cellule dans le champ de vision.
    6. Trouver le plan focal en ajustant la position axiale de l’objectif. Mise au point parfaite fait la limite de l’échantillon visualisée à l’écran presque invisible.
    7. Ajuster l’étape de traduction pour trouver l’emplacement sans une cellule.
    8. Cliquez sur calibrer pour mesurer plusieurs hologrammes 2D avec des angles d’éclairage variables.
    9. Ajuster l’étape de traduction pour localiser une cellule au centre du champ-de-vue.
    10. Accédez à l’onglet « Acquisition » et cliquez sur 3D instantané pour mesurer les hologrammes de la cellule avec les angles d’éclairage identique comme fait à l’étape 3.4.8.
    11. Lorsque les données acquises sont présentées sur le panneau « Gestion des données », faites un clic droit sur les données acquises et cliquez sur le processus pour reconstruire un tomogramme RI 3D depuis les hologrammes mesurée aux étapes 3.4.8 et 3.4.10, à l’aide de l’algorithme de tomographie par diffraction 9 , 10 mises en œuvre dans le logiciel d’imagerie.
    12. Répétez les étapes 3.4.5-3.4.11 pour mesurer plus de 100 cellules afin d’assurer une puissance statistique pour l’apprentissage de la machine.
    13. Toutes les images qui sont traitées par l’étape 3.4.11. peuvent être visualisées. Sur le panneau « Gestion des données », cliquez-droit sur les données et cliquez sur Ouvrir pour visualiser les données. Cliquez sur la tomodensitométrie : RI sur le panneau « Data Manager ». Sous l’onglet « Preset », cliquez sur charger et double-cliquez sur « lymphocyte.xml », qui est une fonction de transfert prédéfinis fournie par le logiciel d’imagerie pour visualiser la tomodensitométrie : selon les distributions RI 3D.
  5. Répétez les étapes 3.2-3.4 à mesurer 3D tomographies RI de tous les sous-types de lymphocytes.

4. quantitatives caractéristique morphologiques et biochimiques Extraction de tomographies RI 3D

  1. Placez toutes les données tomographiques mesurées au-dessus dans un seul dossier. Séparer les types de cellules dans les sous-dossiers de ce dossier. Préparer chaque tomogramme à un fichier unique .mat .
  2. Ouvrir fichier complémentaire 1 - Extraction de caractéristique (écrit pour une logiciel de traitement d’image).
  3. Modifier la ligne 14 de désigner la tomodensitométrie : dossier préparé à l’étape 4.1.
  4. Modifier la ligne 15 de désigner un dossier pour enregistrer les données extraites de fonctionnalité.
  5. Vous pouvez également modifier la ligne 17 pour ajuster les paramètres de seuil RI pour extraction de caractéristiques. L’option par défaut est 20 seuils RI de 1,340-1,378, avec un incrément de 0,002 comme décrit plus haut5.
  6. Exécuter le code. Pour chaque tomogramme dans le dataset, le code calcule cinq caractéristiques : surface de la zone (SA), volume cellulaire (CV), sphéricité (SI), densité de protéines (pp) et masse sèche (DM), par seuil de RI. Les algorithmes détaillées pour l’extraction de caractéristiques sont décrites ailleurs5.
  7. Afin de contrôler l’extraction de caractéristique, lors de l’exécution, vérifier sur l’écran de visualisation de segmentation cellulaire basées sur des seuils de RI.
  8. Vérifier les données extraites, en tant que fichier .mat par tomodensitométrie :, enregistré dans le dossier désigné à l’étape 4.4.

5. sous la supervision d’apprentissage et d’Identification

  1. Au hasard de fractionner les données de fonctionnalité obtenues dans des ensembles d’étape 4.8 pour examen (30 %) et de formation (70 %) avec dossiers séparés.
  2. Ouvrir dossier complémentaire 2 - Train (écrit pour une logiciel de traitement d’image).
  3. Modifiez la ligne 14 pour désigner l’ensemble de la formation établi à l’étape 5.1.
  4. Modifier la ligne 16 pour désigner un dossier pour enregistrer le classificateur formé.
  5. Modifier la ligne 17 pour définir un nom de fichier pour le classifieur.
  6. Vous pouvez également modifier la ligne 19 pour sélectionner les fonctionnalités pour la formation. L’option par défaut, tel que spécifié précédemment5, a été utilisée pour obtenir les résultats représentatifs ci-dessous.
  7. Exécuter le code. En utilisant les fonctions sélectionnées de l’ensemble de la formation, le code entraîne un classifieur avec le k-plus proches de l’algorithme voisin (k -NN ; k = 4), puis enregistre le classificateur (aussi nommé à l’étape 5.5) dans le dossier désigné à l’étape 5.4.
  8. Vérifier sur l’écran de visualisation de l’exécution de classificateur et l’exactitude de la validation croisée.
  9. Éventuellement, former plusieurs classifieurs avec combinaisons de caractéristique différente en répétant les étapes 5,5 à 5,7. Puis choisissez le classifieur avec la plus grande précision de la validation croisée.
  10. Ouvrir le fichier complémentaire 3 - Test (écrit pour une logiciel de traitement d’image).
  11. Modifier lignes 14-15 pour désigner le classificateur formé à tester.
  12. Modifiez la ligne 17 pour désigner l’ensemble d’essai établi à l’étape 5.1.
  13. Exécuter le code. Le classificateur décrit ci-dessus identifie les types de cellule des lymphocytes dans l’ensemble de tests individuels.
  14. Vérifier sur l’écran de visualisation de la performance de l’identification et l’exactitude du test.

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Results

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Figure 1 montre le processus schématique de l’ensemble du protocole. À l’aide de la procédure présentée ici, nous avons isolé B (n = 149), lymphocytes T CD4 + (n = 95) et T CD8 + (n = 112) les lymphocytes. Pour obtenir des informations de phase et d’amplitude à différents angles d’éclairage, plusieurs hologrammes 2D de chaque lymphocyte ont été mesurés en changeant l’angle d’éclairage (à partir de-60 ° c à 60 °). En règle générale, 50 hologrammes peuvent ...

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Discussion

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Nous présentons un protocole qui permet l’identification exempte d’étiquette des types de lymphocytes exploitant imagerie 3D volet quantitatif et apprentissage automatique. Les étapes critiques du présent protocole sont volet quantitatif d’imagerie et de la fonctionnalité de sélection. Pour l’imagerie holographique optimale, la densité des cellules doit être contrôlée comme décrit ci-dessus. La stabilité mécanique des cellules est aussi importante d’obtenir une répartition précise des RI 3D parce que des mouvements cellu...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prof. Y. Park, Jo Y., Y. S. Kim et S. Lee ont des intérêts financiers dans Tomocube, Inc., une société qui commercialise la tomographie optique de diffraction et volet quantitatif imagérie et est l’un des auteurs de l’ouvrage.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par le KAIST BK21 + Program, Tomocube, Inc. et la National Research Foundation of Korea (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). Y. Jo reconnaît le soutien du KAIST présidentielle bourse et bourse de sciences biomédicales de la Fondation Asan.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
SourisDaehan BiolinkC57BL/6J souris  ;Sexe et âge appariés, 6 à 8 semaines
Tube à centrifuger conique FalconThermoFisher Scientific14-959-53A15 mL
Saline tamponnée au phosphate  ;Sigma-Aldrich806544-500ML
Tampon de lyse d’ammonium-chlorure de potassium  ;ThermoFisher ScientificA1049201
RPMI-1640 moyenSigma-AldrichR8758
Sérum fœtal bovinThermoFisher Scientific10438018
AnticorpsBD Biosciences553140 (RRID :AB_394655)CD16/32 (clone 2.4G2)
AnticorpsBD Biosciences555275 (RRID :AB_395699)CD3&epsilon ; (clone 17A2)
AnticorpsBiolegnd100734 (RRID :AB_2075238)CD8&alpha ; (clone 53-6.7)
AnticorpsBD Biosciences557655 (RRID :AB_396770)CD19 (clone 1D3)Anticorps
BD Biosciences557683 (RRID :AB_396793)CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
AnticorpsBD Biosciences552878 (RRID :AB_394507)NK1.1 (clone PK136)
AnticorpseBioscience11-0041-85 (RRID :AB_464893)CD4 (clone GK1.5)
DAPI  ;Roche102362760014,6-diamidino-2-phénylindole
Cytométrie en flux  ;BD BiosciencesAria II ou III  ;
Chambre d’imagerieTomocube, Inc.Holotomographie TomoDish
Tomocube, Inc.HT-1H
Logiciel d’imagerie par holotomographieTomocube, Inc.TomoStudio
Logiciel de traitement d’imagesMathWorksMatlab R2017b

References

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