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Article de méthode

Purification de protéine anaérobie et l’analyse cinétique via la sonde à oxygène pour l’étude de l’Inhibition et l’activité DesB Dioxygenase

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DOI :

10.3791/58307

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3 octobre 2018

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1Department of Chemistry, Wesleyan University

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour la purification de protéine anaérobie, la concentration de protéines anaérobie et ultérieure caractérisation cinétique à l’aide d’un système d’électrodes de l’oxygène. La méthode est illustrée à l’aide de l’enzyme DesB, une enzyme dioxygénase qui est plus stable et plus active lorsque purifié et stockées dans un environnement anaérobie.

Résumé

Les protéines sensibles à l’oxygène, y compris ces enzymes qui utilisent l’oxygène comme substrat, peuvent ont réduit stabilité lorsque purifiée à l’aide de méthodes traditionnelles de purification aérobie. Ce manuscrit montre les détails techniques impliqués dans le processus de purification anaérobie, y compris la préparation des tampons et réactifs, les méthodes de chromatographie sur colonne dans une boîte à gants et le dessalement de la protéine avant cinétique. Également décrites sont les méthodes pour la préparation et à l’aide d’une électrode à oxygène pour effectuer la caractérisation cinétique d’une enzyme utilisant l’oxygène. Ces méthodes sont illustrées à l’aide de l’enzyme dioxygénase DesB, une dioxygénase gallate de la bactérie Sphingobium SP. souche SYK-6.

Introduction

Les enzymes qui utilisent le fer ou autres métaux pour activer l’oxygène sont souvent sensibles à l’inactivation au cours du processus de purification en raison de leur éloignement de l’environnement réducteur d’une cellule. Par conséquent, ces protéines doivent servir de lysats cellulaires, être soumis à des agents réducteurs externes ou être purifiés par voie anaérobie pour s’assurer qu’ils ont une activité enzymatique optimale1,2,3,4. Pour ces enzymes qui sont sensibles à l’oxygène (enzymes contenant du fer plus précisément), effectuer toutes les étapes de purification et caractérisation tout en maintenant des conditions anaérobies est nécessaire pour caractériser complètement à eux. Cela a conduit les chercheurs à élaborer des montages tout laboratoire dans l’enceinte des chambres anaérobies d’études allant de l’expression de la protéine par cristallographie5,6,7,8 .

Dans les présentes, nous rapportons les méthodes d’épuration anaérobie et caractérisation cinétique de l’enzyme DesB à l’aide d’un système d’électrodes de l’oxygène. DesB est une dioxygénase gallate de la bactérie Sphingobium SP. souche SYK-6 qui est lié à LigAB, une dioxygénase protocatecuate partir du même organisme. Les deux enzymes appartiennent à la superfamille des dioxygénase (DGPAM) protocatéchuate de type II qui n’a pas été étudiée date9, probablement en partie due à des enzymes de cette superfamille sont sensibles à l’inactivation quand purifié à l’aide de la norme aérobique méthodes de purification des protéines. Puisque certains enzymes DGPAM affichent promiscuité de substrat, tandis que d’autres sont spécifiques à substrat2,10, plus loin la caractérisation de cette superfamille est nécessaire d’identifier les déterminants de la spécificité. Comme a été observée dans plusieurs enzymes super-familles11,12,13,14,15, petites molécules peuvent modifier l’activité par l’intermédiaire de l’inhibition compétitive directe ou la liaison de molécules à séparer les poches allostériques qui provoque une augmentation ou diminution de l’activité enzymatique16. Alors que la cinétique seul ne peut pas différencier l’emplacement de la reliure d’un modulateur, l’amplitude d’un changement d’activité est important pour comprendre les effets. En tant que telles, méthodes de caractérisation cinétique du DesB native et son activité en présence de 4-nitrocathécol (4NC), un composé utilisé couramment pour caractériser et inhiber dioxygénase enzymes2,17, 18, sont indiqués.

DesB est capable de décomposer gallate, un composé, via une réaction de dioxygénase (EDO) extradiol dans quel anneau ouverture est catalysée par l’oxygène comme l’un des substrats10,19d’aromatique dérivés de la lignine. Cette réaction enzymatique se produit dans le cadre de la décomposition de la lignine, un hétéropolymère aromatique se trouvée dans la paroi cellulaire des plantes. La lignine peut être dépolymérisée, produisant une variété de composés aromatiques qui peut être subdivisée en métabolites central3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygénases (EDO) catalysent un anneau ouverture réaction dihydroxylé de composés aromatiques, où clivage se trouve en bordure d’un diol métal coordonnés ; en revanche, intradiol dioxygénases clivent les composés aromatiques analogues entre les deux groupes hydroxyle (Figure 1). ADE, comme de nombreux autres métalloenzymes, ont un centre métallique divalent pour coordination Fe (II) composé d’un deux-histidine, un-carboxylate triade9,34,35. Ces métalloenzymes devient oxydés, par autooxydation ou axée sur le mécanisme d’inactivation, alors que l’enzyme est rendu inactif2,36,37,38.

Dans les procédures expérimentales décrites dans ce manuscrit, nous utilisons le DesB, un membre de la superfamille DGPAM de la bactérie Sphingobium SP SYK-6, à catalyser l’apport d’oxygène à travers la liaison de C4-C5 de gallate d’Epigallocatechin (Figure 2 a). La régiochimie de ce clivage est analogue à LigAB, qui est une protocatéchuate-4,5-dioxygénase (Figure 2 b). Jusqu’ici, enquêtes de cette dioxygénase gallate n’incluent aucun signalement de composés qui inhibent le DesB10,19,,39. Avec l’utilisation des méthodes de purification aérobie, DesB a manifesté une activité variable, alors qu’avec l’utilisation de méthodes anaérobies, nous avons pu obtenir régulièrement les protéines à activité reproductible. Les études cinétiques décrites ici montrent les méthodes d’épuration anaérobie du DesB, caractérisation cinétique de la réaction du DesB avec gallate et l’inhibition du DesB par 4-nitrocathécol (4NC).

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Protocole

1. Généralités matériaux et méthodes

  1. Préparer tous les médias requis tel que décrit dans le tableau 1. Autoclave à 120 ° c pendant 15 min. stérile filtrer la solution de la SOC, après l’ajout du MgCl2 et du glucose, en le faisant passer à travers un filtre de 0,2 µm. Ajuster le pH de la solution de lysogénie bouillon (médias LB) du meunier avant l’autoclavage. Compléter la solution media LB-Amp après la stérilisation avec des solutions stériles de 0,2 mM de L-cystéine, puis 0,1 mM sulfate d’ammonium ferreux pour améliorer la solubilité et l’expression de la protéine.
  2. Préparer le buffer de Laemmli et en cours d’exécution pour l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) comme décrit dans le tableau 2. Ajuster le pH des solutions (à l’aide de la base Tris HCl M 1 pour la préparation de la mémoire tampon) avant de diluer les composants à leur volume final.
  3. Préparer les mémoires tampons pour la purification de la protéine comme décrit dans le tableau 3. Ajuster le pH des solutions (à l’aide de la base Tris HCl M 1 pour la préparation de la mémoire tampon) avant de diluer les composants à leur volume final.
  4. Transférer les tampons préparées dans une bouteille qui peut être scellée avec un bouchon en caoutchouc monotrou et contient un tube de verre.
    1. Utiliser un tuyau pour raccorder le tube en verre du bouchon à une source de vide. Laisser la solution d’une solution contenant sous pression négative pendant environ 30 min, en brassant à vitesse moyenne.
    2. Couper le vide appliqué au sceau tout d’abord, avant de s’éteindre l’aspirateur. Ensuite, percer à travers le bouchon en caoutchouc avec deux aiguilles de 20G (celle qui est assez long pour atteindre le fond de la bouteille et une aiguille plus courte qui peut être utilisée comme un évent d’évacuation de gaz). Des bulles dans un flux constant d’azote tout en remuant à vitesse moyenne pendant 30 min.
    3. Enlever les aiguilles et répéter le dégazage et le bouillonnement en azote pour un total de trois cycles. Lorsque vous avez terminé, bien sceller la bouteille avec un bouchon en caoutchouc solide. De plus fixer le bouchon avec le film de paraffine et de fil de cuivre (20G) et placez-les dans la boîte à gants.
      Remarque : Tous les matériaux sont placés dans la boîte à gants et soumis à 3 cycles de purge de l’antichambre, suivie de passer l’aspirateur sur l’oxygène et il remplissage à l’azote. Tampons utilisés pour la purification et la concentration peuvent être plafonnés et stockés dans la boîte à gants indéfiniment.
  5. Préparer la solution de dithionate de sodium en dissolvant environ une spatule (0,31 "x 2", la plus petite extrémité d’une double culot micro coniques en acier inoxydable spatule) pleine de sodium dithionate environ 1 ml d’eau dégazée dans un tube de microtubes de 1,5 mL . Fermer le tube avec le film de paraffine avant l’enlèvement de la boîte à gants.
    NOTE : Stocker dithionate de sodium solide dans la boîte à gants pour éviter l’oxydation.

2. préparation de la colonne d’Amylose pour la Purification de protéines

  1. Faire un coulis de résine d’amylose haut débit (15 mL) combiné avec 5 volumes de colonne (75 mL) de tampon de colonne d’amylose. Transférer la suspension résinique dans deux flacons de 50 mL sérum et sceller chaque bouteille avec un septum en caoutchouc. Perforer un 20G, aiguille de 305 mm à travers le septum et l’azote de bulle dans la boue pendant environ 1 minute enlever l’oxygène de la suspension. Transvaser la solution contenant des protéines et résine dans la boîte à gants.
  2. Dans la boîte à gants, verser la résine dans une colonne de borosilicate de 2 x 30 cm munie d’un robinet d’arrêt simple, permettant à la résine s’installer et créer un lit de niveau. Vider le tampon de la colonne et équilibrer la colonne avec 3 volumes de colonne (total environ 30 mL) de tampon de colonne amylose dégazé à l’aide de gaz d’azote sous pression pour pousser le tampon par le biais de la résine à environ 1 goutte/s ou 5 mL/min, jusqu'à ce que le solvant soit juste au-dessus de la lit de résine.
    Remarque : Après la protéine est élué (voir étape 3.5 ci-dessous), la résine de colonne d’amylose est régénérée par un lavage avec volume de 1 colonne (10 mL) d’eau, puis volume 1 colonne de dodécylsulfate de sodium à 1 % (SDS) et enfin, 3 volumes de colonne (30 mL) d’eau. Cette étape peut être effectuée à l’extérieur de la boîte à gants. La résine de la colonne est stockée à 4 ° C à 20 % d’éthanol et peut être régénérée jusqu'à 5 fois.

3. protein Expression et Purification anaérobie du DesB

NOTE : Le gène DesB est synthétisé dans le commerce, ayant été placé en pET-15 b, pET-32 a et vecteurs pMAL-c5x à l’aide de la restriction Ndel et BamHI clonage sites.

  1. Toutes les épreuves d’expression protéique conformément aux directives du fabricant pour déterminer les conditions correctes pour l’expression de grande échelle (décrit brièvement ci-dessous).
    1. Transformer les plasmides contenant du DesB en fabrication commerciale, chimiquement compétent e. coli BL21 (DE3) cellules, selon les instructions du fabricant. En bref, décongeler les cellules sur la glace pendant 10 min, ajouter environ 10-50 ng d’ADN plasmidique au mélange cellulaire, choc thermique des cellules à 42 ° C pendant 10 s et les incuber sur glace pendant un 5 min supplémentaires médias SOC ajouter pour obtenir un volume final de 1 mL et permettre la cellules de secouer (~ 200 tr/min) à 37 ° C pendant 60 min. Sur une plaque de LB-Amp, ajouter et répandre 100 µL de la solution de la cellule et incuber une nuit à 37 ° C.
    2. Sélectionnez une seule unité formant colonie par la plaque après incubation pendant la nuit et utiliser cette colonie pour ensemencer 10 mL de médias LB-Amp. Cultiver les cellules pendant la nuit, avec agitation (~ 200 tr/min) à 37 ° C.
    3. À 10 mL de médias, ajouter 100 µL de la solution de croissance durant la nuit et secouer les nouveaux médias, comme indiqué au point 3.1.2 à 37 ° C. Lorsque la densité optique à 600 nm (OD600) est entre 0,4 à 0,8, ajouter isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) pour obtenir une concentration de la solution finale de 1 mM.
    4. Immédiatement enlever une portion de 1 mL de la solution et le transférer dans un tube de microtubes de 1,5 mL avec le temps marqué = 0 heures. Tourner le tube à 15 000 x g pendant 10 min granuler les cellules. Après l’essorage, éliminer le surnageant et stocker les cellules à 4 ° C.
    5. Retirer les aliquotes supplémentaires (1 mL chacune) à intervalles de temps après l’ajout d’IPTG (généralement à 5, 10, 12, 18 et 24 h). Comme indiqué au point 3.1.4, centrifuger chaque tube, éliminer le surnageant et stocker les cellules à 4 ° C.
    6. Une fois que toutes les parties aliquotes sont obtenus, remettre en suspension les cellules de chaque validant dans 30 µL de solution d’extraction de protéine bactérienne, leur incubation à température ambiante pendant 10-15 minutes et centrifuger les tubes à 15 000 × g pendant 5 min séparer les solubles et insolubles protéines.
    7. Transférer la solution de protéines solubles dans un nouveau tube de microcentrifuge et remettre en suspension les pellets insolubles restantes avec 30 µL de solution d’extraction de protéine bactérienne.
    8. Combiner les 30 µL de chaque solution (solutions solubles et insolubles pour chaque validant) avec un volume égal de tampon de Laemmli, puis visualiser sur un gel SDS-PAGE40. Sélectionnez les conditions correspondant aux voies contenant les bandes de taille correcte dans la fraction soluble pour l’expression de la protéine à grande échelle et la purification.
      Remarque : Comme protéine soluble minime a été initialement généré en utilisant les conditions ci-dessus, divers compléments ont été ajoutés pour tester les effets sur l’expression de la protéine soluble, avec 0,2 mM L-cystéine et montrant la protéine accrue de sulfate d’ammonium ferreux de 0,1 mM expression. Selon cet écran d’expression de protéine, un vecteur d’expression appropriée pour production soluble du DesB est vecteur pMAL-c5x.
  2. Après transformation dans Escherichia coli BL21 (DE3), faire un stock de DesB/pMal-c5x en combinant 900 µL de culture bactérienne (cultivée pendant la nuit avec la secousse à 200 tr/min et 37 ° C) avec 100 µL de 80 % de glycérol. Ranger le stock à-80 ° C dans un tube cryogénique.
    NOTE : Faire un nouveau congelés stock environ tous les 6-8 mois.
  3. Utiliser un embout de la pipette pour gratter les cellules du stock congelé et démarrer une culture bactérienne, de plus en plus du jour au lendemain dans 5 mL de médias LB-Amp à 37 ° C sous agitation. Ensemencer 1,5 litres de médias LB-Amp dans un flacon de 2 L à 37 ° C et 200 tr/min, à l’aide de la culture bactérienne cultivée durant la nuit.
    Remarque : En raison de la sensibilité observée de la protéine à l’oxygène, on a trouvé cet espace libre réduit dans la fiole et rendement amélioré de protéine vitesses pour l’expression à grande échelle de secousse modérée.
  4. Induire l’expression de la protéine quand la densité optique à 600 nm (OD600) se situe entre 0,4 à 0,8 à 1 mM IPTG et additionné de 0,2 mM L-cystéine et 0,1 mM sulfate d’ammonium ferreux. Abaisser la température d’incubation à 30 ° C et agiter à 200 tr/min. Tournez en bas des cellules par l’intermédiaire de centrifugation après induction après 24h à 4 700 x g pendant 10 min et jeter les médias usés.
  5. Resuspendre le culot dans 20 mL de tampon de colonne amylose par tous les 1,5 litres de croissance, suivie par l’ajout de 1 mg de lysozyme. Remuer pendant 20 minutes sur la glace.
    NOTE : Plus de mémoire tampon peut être ajouté si la solution est trop visqueuse, comme protéine de solutions qui sont trop visqueuses peuvent perturber l’étape suivante d’homogénéisation.
  6. Lyse la solution remises en suspension cellulaire par l’intermédiaire de l’homogénéisation à haute pression avec 3-5 passe à environ 15 000 lb/po2. La protéine de transfert dans un tube à centrifuger 50 mL et rincer la feuillure avec de l’azote pendant 1 min. Puis, centrifuger la cellule lysate à 20 000 x g pendant 40 min retirer les débris insolubles.
    NOTE : L’homogénéisation réussie provoque la protéine micelles forme comme il coule à travers le tube et dans le flacon de collection, et la solution apparaît comme une couleur brun-gris translucide. Garder la protéine homogénéisée sur glace tout au long du processus.
  7. Après centrifugation, transvaser le surnageant dans un tube de 50 mL (plus d’un peut être nécessaire), cap le tube avec un septum en caoutchouc et avec une aiguille de calibre 20, lentement bulle azote gazeux à travers la solution pendant 2 min à déplacer l’oxygène. Envelopper le septum avec film de paraffine puis fixer avec du fil de cuivre et amener le liquide surnageant dans la boîte à gants ainsi que les matériaux de la colonne.
  8. Équilibrer la colonne (voir étape 2.3) et la protéine surnageante sur la colonne de charge. Recueillir le cheminement dans les fractions de 5 mL sous azote pressurisé modérément (1 goutte/s soit environ 5 mL/min). Ensuite, laver la colonne en utilisant une autre colonne 3 volumes de tampon de colonne d’amylose et collecter manuellement les fractions de 3 mL dans des éprouvettes de verre sous atmosphère d’azote pressurisé modérément (environ 5 mL/min). Éluer la protéine à l’aide de 5 volumes de colonne (~ 50 mL) de tampon d’élution et collecter manuellement les fractions de 3 mL sous pression d’azote modérée (environ 5 mL/min).
    Remarque : Les fractions peuvent alternativement être collectées à l’aide de filtration de la gravité. Environ 12 fractions d’élution doivent être recueillies.
  9. Collecter 30 µL d’extraits des fractions et les supprimer de la boîte à gants pour permettre la visualisation de protéines contenant fractions via l’analyse SDS-PAGE.
    Remarque : Les fractions collectées restent dans la boîte à gants pour la durée de cet essai. Purifiée DesB élue généralement de la colonne en fractions de 3 à 5.

4. anaérobie protéine Concentration/tampon Exchange

  1. Assembler le concentrateur de cellule sous pression, brassé avec un filtre à membrane cellulosique reconstituée 76 mm (coupure de 10 kDa). Ajouter une quantité suffisante de 20 % d’éthanol dans le concentrateur de maintenir la membrane mouillée comme le concentrateur assemblé est transféré dans la boîte à gants.
    Remarque : S’assurer qu’il n’y a pas de larmes dans la membrane et que le joint torique n’est pas froissé.
  2. Après avoir porté le concentrateur de cellule brassé dans la boîte à gants, laver la solution d’éthanol au large de la membrane avec de l’eau. Boucher et pressuriser la cellule brassée pour nettoyer le tubage et la membrane de tout excès d’eau.
  3. Ajouter toutes les fractions contenant des protéines, tel que déterminé par SDS-PAGE (Figure 3) vers le concentrateur. Ajouter suffisamment de tampon d’échange pour obtenir 150 mL de volume de solution de protéines totales.
  4. Pressurisez la chambre cellule brassé à l’aide d’une ligne externe de2 N et concentrer la protéine à 50 mL avec modéré en remuant la vitesse.
    NOTE : Atteindre une concentration de 50 mL prend environ 20 min.
  5. Compléter à 100 mL de tampon d’échange avec 0,1 mM le dithiothréitol (DTT) et de sulfate d’ammonium ferreux de 0,1 mM, ajouter la solution à la cellule brassée et concentrer la protéine à un volume total de 50 mL avec un modéré en remuant la vitesse.
  6. Après que la solution a atteint un volume de 50 mL, ajouter dans le tampon d’échange complété une fois de plus, mais se concentrer la solution d’un volume total de 10 mL avec modéré en remuant la vitesse.
  7. Filtrer le concentré de protéine utilisant un 0,45 µm pore seringue-filtre de taille et partie aliquote dans des tubes de réaction en chaîne (pcr) polymérase individuels 0,2 mL (chacune contenant environ 150 µL de la solution de protéines). Retirer les aliquotes plafonnés de la boîte à gants et immédiatement flash congeler à l’azote liquide. Stocker les aliquotes à-80 ° C.

5. dessalement DesB

  1. Rincer le sac à gants à l’azote pendant environ 1,5 heures avant utilisation.
  2. Décongeler une quantité de 150 µL de protéine purifiée de DesB à l’intérieur du sac à gants, sur la glace.
  3. Pendant ce temps la protéine dégèle, préparez une petite gravité, dessalage colonne contenant 3 mL de gel de dessalement grossier de Sephadex G-25 dans une colonne de borosilicate de 9 mL. Laver la colonne avec 2 volumes de colonne (~ 6 mL) de dégazé desalt tampon.
    NOTE : Remplacez le dessalement gel lorsqu’il y a un changement de couleur de gel du blanc au jaune (après environ 7 utilisations).
  4. Charger le DesB décongelée sur la colonne en utilisant un processus contrôlé par gravité. Jeter le cheminement. Éluer la protéine avec environ 5 mL de tampon de dessalage.
    Remarque : La pression entre le réservoir de remplissage continuellement le sac à gants affectera le taux auquel les solutions s’écouler de la colonne.
  5. Pour la détermination initiale d’élution de la protéine de la colonne, recueillir 12 flacons/elutions (contenant 3 gouttes par flacon). Scellé avec un septum en caoutchouc, retirer le sac à gants et un test pour la présence de la protéine soit directement (par analyse de gel SDS-PAGE) ou indirectement (par l’examen de l’activité de chaque fraction).
    Remarque : En règle générale, les fractions sont testées individuellement pour l’activité, comme indiqué au point 7.1, avec la plus grande activité correspondant à la fraction la plus grande concentration de protéine active. DesB élue généralement à partir de la 7e baisse, après quoi les suivants 9 gouttes de la protéine de morue dessalée sont collectées. Aliquotes de protéine sont stockés sur la glace lors de la mesure de la cinétique (étapes 7.1 à 7.4).

6. préparation de la sonde à oxygène

  1. Polir la bague argent anode et cathode platine avec électrode plus propre et un coton-tige humide jusqu'à ce qu’il n’y a aucun signe visible de dépôts d’oxyde noir.
  2. Avec des ciseaux, coupez environ un carré de 1,5 pouces de papier entretoise (ou roulement papier à cigarettes, qui fonctionne tout aussi bien aussi). Ensuite, couper 1) petits triangles sur chaque face de la place et les fentes 2) dans les coins pour faciliter l’habillage de l’électrode.
  3. Ajouter 5 gouttes d’une solution de KCl 50 % sur l’anode argent groove et connectez-les afin qu’ils forment un anneau continu de la solution. Ajouter 2 gouttes de la solution de KCl 50 % vers le haut de l’électrode de platine. Placez le papier de l’entretoise sur le dessus de l’électrode de platine délicatement et lisser le papier de l’entretoise, donc il n’y a pas de bulles d’air.
    Remarque : Soyez prudent pour éviter de déchirer le papier de l’entretoise.
  4. Couper un morceau de la membrane PTFE (polytétrafluoroéthylène) de 30m de S4 qui est d’environ 2 pouces de longs et placez-le sur le dessus le papier de l’entretoise. Couper les bords de la membrane afin qu’ils sont alignent sur la bague extérieure de l’électrode.
  5. À l’aide de l’applicateur joint torique, pousser le petit joint torique sur l’électrode pour garantir l’entretoise papier et membrane sur l’électrode. Placez le plus grand joint torique sur la rainure circulaire de l’électrode, assurer qu'il n’y a aucune membrane sous elle. Glissez la chambre supérieure de l’électrode sur la base et visser les deux ensemble.
    Remarque : Les deux sont vissés correctement si aucun bâton de bulles d’air sur les côtés de la chambre.
  6. Placer l’électrode assemblé sur sa base et connecter l’électrode au système de surveillance. Lancer le programme de contrôle des électrodes et étalonner l’électrode en exécutant le protocole d’étalonnage de phase liquide (Figure 4 a). La variable de la température doit être la température de la pièce dans laquelle l’expérience est réalisée, et la variable de la pression ambiante est dépendante de la région et les conditions météorologiques actuelles.
    Remarque : La pression ambiante peut provenir d’un bulletin météorologique pour la région.
  7. Ajouter 1 mL de tampon Tris 25 mM dans la chambre d’électrodes, insérer le piston, commencer l’étalonnage de la solution oxygène saturé et ajuster la vitesse d’agitation à 100. Après que l’électrode se stabilise, le point de consigne d’étalonnage pour l’oxygène en solution saturée est déterminée (Figure 4 b).
  8. Sans enlever le piston, utiliser une seringue de l’aiguille et 1 mL de 1,2 x 40 mm à injecter environ 1 mL de solution de dithionite de sodium dans la chambre, en prenant soin d’éviter d’ajouter des bulles d’air (Figure 4). Utiliser un bouchon en caoutchouc pour sceller la chambre d’électrodes immédiatement après addition de dithionite de sodium.
  9. Permettre l’étalonnage de continuer jusqu'à ce que tout l’oxygène est utilisé et le programme est terminé et sauver l’étalonnage (Figure 4). Aspirer la solution de la chambre et rincer la salle avec de l’eau désionisée et piston 5 - 6 fois pour assurer le retrait complet de la dithionite de sodium. Lorsque le rinçage, utilisez un tube de plastique équipé d’un embout de la pipette relié à une fiole à vide côté-bras. Éviter d’endommager la membrane.

7. cinétiques tests à l’aide de la sonde à oxygène

  1. Identifier les aliquotes de morue dessalées contenant la protéine active par tests en série 1 µL de solution d’enzyme à activité dans une solution de tampon Tris de 25 mM, avec un pH de 7,5 et contenant 100 µM gallate. Utilisez les aliquot(s) avec la plus grande activité observée pour les autres expériences. (Voir étape 5.5.1)
  2. Déterminer la vitesse de la réaction enzymatique en mesurant la consommation2 O en utilisant une O2-électrode sensible Clark avec intégration de l’ordinateur par l’intermédiaire de l’unité de commande d’électrode.
    1. Pour chaque donnée cinétique point mesure du DesB, ajouter 1 mL de tampon Tris de 25 mM (pH 7.5) dans la chambre d’électrodes. Ajouter un volume calculé d’une solution mère de 25 mM de gallate d’Epigallocatechin au tampon Tris pour atteindre la concentration de substrat final désiré (0,05-25 mM).
      NOTE : Préparer les solutions fraîches de gallate et composés inhibiteurs avec de l’eau tous les jours et ajuster le pH à 7,5 avec l’ajout de 0,1 mM NaOH, si nécessaire.
    2. Après 10 s de remuer pour permettre pour le mélange de la solution, sceller la chambre avec le piston lentement et visser le haut vers le bas. Un tissu propre peut servir pour absorber l’excès de liquide qui est déplacé de la chambre. Laissez l’électrode s’équilibrer où il peut produire une mesure stable de la concentration d’oxygène dans la solution pendant au moins 1 minute avant de procéder à l’ajout d’enzyme (fond O2 taux de consommation de ± 0,5 µM/min).
    3. À l’aide d’une seringue µL à 10 de gaz, serré, ajouter environ 1 µL d’enzyme (environ enzymatique de 3-7 µM) à la chambre d’électrodes par le piston.
      Remarque : La quantité d’enzyme peut augmenter ou de diminuer en réponse à l’activité observée de l’aliquote spécifique pour permettre des vitesses de réaction suffisante.
    4. Calculer la vitesse de réaction basée sur la pente de la première 30 s de données linéaires après addition de l’enzyme et correct pour fond la consommation2 O en utilisant les 30 s de données immédiatement avant l’addition de l’enzyme. Le taux de la catalyse est égal au taux de consommation de2 O (Figure 5 a).
    5. Après la collecte des données à la fréquence pour une concentration de substrat donné, vider la chambre d’électrodes par aspiration à l’aide d’un tube en plastique relié à une fiole à vide côté-bras et puis les rincer plusieurs fois à l’eau pendant 4 à 6 cycles. Mettre en place la solution dans l’électrode comme indiqué au point 7.2.1 en utilisant une nouvelle concentration de substrat.
    6. Varier les concentrations du substrat de manière non ordonnée et reproduire tout au long de l’expérience pour tenir compte de la diminution de l’activité enzymatique avec le temps (Figure 5 b).
      Remarque : Lorsque les réplicats d’une concentration spécifique sont exécutés et démontrent plus qu’une baisse de 30 % en taux par rapport à une exécution plus tôt, sans essais supplémentaires doivent être effectuées avec ce lot d’enzyme. En règle générale, après 30-40 pistes, l’enzyme montre une diminution de 30 % dans l’activité.
    7. Déterminer les paramètres cinétiques, kchat (la constante catalytique pour la conversion du substrat en produit) et Km (la constante de Michaelis, opérationnellement définie comme la concentration de substrat au cours de laquelle la vitesse initiale est la moitié de la vitesse maximale), par un agencement de moindres carrés des données de chacune des concentrations de substrat à l’équation de Michaelis−Menten (Figure 6) à l’aide de GraphPad Prism.
  3. Ajouter 4-nitrocathécol (4NC) afin de tester son impact sur la cinétique de la dioxygenation et de déterminer la constante d’inhibition (Kj’ai) avec DesB. Pour chaque condition de réaction, les courants des solutions de Tris (50 mM), gallate (25 mM) et 4NC (25 mM) sont combinés et dilué avec de l’eau pour obtenir une solution de 2 mL de tampon Tris de 25 mM (pH 7,5) avec 1 mM gallate et diverses concentrations de 4NC. Le volume de 4NC a été modifié pour atteindre la concentration de l’inhibiteur final désiré (0,05-20 mM).
    1. Après 10 secondes en remuant pour permettre le mélange de la solution, placer le piston dans la chambre lentement et visser le haut vers le bas. Un tissu propre peut servir pour absorber l’excès de liquide qui est déplacé de la chambre. Laissez l’électrode à équilibrer et à produire une mesure stable de la concentration d’oxygène dans la solution pendant au moins 1 minute avant de procéder à l’ajout d’enzyme (fond O2 taux de consommation de ± 0,5 µM/min).
    2. Comme décrit précédemment, ajoutez la protéine (étape 7.2.3), déterminer la vitesse de réaction (étape 7.2.4) et réinitialiser l’électrode pour la condition suivante.
    3. Dans le cadre de cette série d’expériences, déterminer la vitesse de réaction en l’absence d’inhibiteur plusieurs fois. Déterminer l’inhibition par la normalisation des taux de consommation d’oxygène en présence de diverses concentrations d’inhibiteur avec substrat de 1 mM et l’absence d’inhibiteur (v/vo).
    4. Ajustement de l’inhibition de la dioxygenation gallate d’équation 7.3A, puis les données de l’équation 7.3B à l’aide d’un programme graphique (Figure 7).
  4. Déterminer la concentration de l’enzyme précise pour chaque expérience en effectuant une analyse de Bradford après l’achèvement de toutes les séries de cinétiques.
    Remarque : Tous les tarifs ont été corrigées pour la concentration de l’enzyme. Cette étape n’a pas besoin d’être fait dans une boîte à gants ou le sac à gants.

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Résultats

L’analyse de gel SDS-PAGE des différentes fractions de purification de la construction de fusion DesB-maltose binding protein (MBP) (Figure 3) est présentée. Le gel révèle que la protéine est pure (MW = 91,22 kDa), à l’exception de la présence du DesB (MW = 49.22 kDa) et domaine de protéine MBP (42 kDa) clivé les uns des autres. Fractions E2 et E3 ont été sélectionnés pour la concentration (étape 4.2).

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Discussion

Les étapes critiques dans l’obtention de protéines DesB active purifiée impliquent la formation et le maintien du site actif réduit Fe (II) de l’enzyme. Ainsi, corriger les performances de l’induction, la purification, la concentration, et dessalement étapes sont essentielles à l’obtention d’enzyme active avec succès. Induire l’expression de la protéine en présence de 1 mM de sulfate d’ammonium ferreux assure que Fe (II) est correctement incorporé dans le site actif du DesB. Cette méthode s’inspire des études comme celle...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ont pas concurrentes d’intérêts financiers ou autres conflits d’intérêts.

Remerciements

Nous tenons à remercier le Dr Camille Keller de l’Université wesleyenne pour le support technique. Merci professeur Lindsay D. Eltis et Jenna K. Capyk de l’Université de la Colombie-Britannique, ainsi que Christian Whitman de l’Université du Texas à Austin, pour leurs conseils concernant les méthodes de purification des protéines anaérobie et l’utilisation d’un O2 -électrode sensible.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Isopropyl &beta ;-D-1-thiogalactopyranodiseGold Bio TechnologiesI2481C50
Coomassie Brilliant Blue R-250Bio-Rad161-0400
Persulfate d’ammoniumBio-Rad161-0700
30 % AcrylamideBio-Rad161-0158
N,N’tétraméthyl-éthylènediamineBio-Rad161-0801
Résine amylose à haut débitNew England BiolabsE8022S
BL21 (DE3) cellules Escherichia coli compétentesNew England BiolabsC2527I
L-cystéineSigma AldrichC7352
acide galliqueSigma AldrichG7384
4-nitrocatécholSigma AldrichN15553
Ferreux sulfate d’ammoniumMallinckrodt5064
Dithionite de sodiumAlfa Aesar33381-22
bouteilles de sérum de bléFisher Scientific06-406G
25 mm Acrodisc PF Seringue Filtre avec membrane SuporPall Corportation4187
400 mL Amicon Concentrateur de cellules agitéesEMD MilliporeUFSC40001
76 mm Millipore Ultracel 10 kDa filtre à membrane cellulosique reconstituéeEMD MilliporePLGC07610
DL-dithiothreitolGold Bio TechnologiesDTT50
Sephadex G-25 colonne de salage grossierGE Healthcare17-0033-01
2 mL Flacons à sertirFisher Scientific03-391-38
Oxygraph Plus Unité de contrôle d’électrodeHansatech InstrumentsOXYG1 Plus
Chambre d’électrode d’oxygèneHansatech InstrumentsDW1
Disque d’électrodeHansatech InstrumentsS1
PTFE (0.0125 mmX25mm) Bobine de 30mHansatech InstrumentsS4
Kit de nettoyage d’électrodesHansatech InstrumentsS16
Papier d’espacementZig Zagdisponible dans n’importe quelle station-service
He-series Dri-Labboîte à gants Vacuum/Atmospheres Company
HE-493 Dri-TrainVacuum/Atmospheres Company
Spatule en acier inoxydable micro-conique à double extrémitéFisher Scientific21-401-10
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy ColumnFisher Scientifick420400-1530
10 &mu ; L, modèle 701 N SYR, cimenté NDL 26s ga, 2 po, point stlye 2 seringueHamilton80300
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy ColumnFisher ScientificK420401-1505
Emulsiflex-C5 homogénéisateur haute pressionAvestin
B-PER Réactif complet d’extraction de protéines bactériennesThermo Fisher Scientific89821
Lysozyme à partir d’un blanc d’œuf de pouleSigma Aldrich12650-88-3
Dodécylsulfate de sodiumThermo Fisher Scientific151-21-3
ampicillineSigma Aldrich7177-48-2
TryptoneFisher ScientificBP-1421-500
Extrait de levureFisher ScientificBP1422-2
Chlorurede sodiumFisher ScientificS271-10
Chlorure de potassiumFisher ScientificP217-3
Chlorure de magnésiumFisher ScientificM33-500
DextroseFisher ScientificD16-3
Hydroxyde de sodiumFisher ScientificS318-1
Chlorhydrate de trisFisher ScientificBP153-500
MaltoseFisher ScientificBP684-500
GlycineFisher ScientificG46-500

Références

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