Article de méthode

Isolement des vésicules extracellulaires du murin lavage broncho-alvéolaire fluide à l’aide d’une Technique de Centrifugation de l’Ultrafiltration

DOI :

10.3791/58310

⸱

9 novembre 2018

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1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care, Women's Guild Lung Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Medicine, Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons ici les deux protocoles d’isolement vésicule extracellulaire, centrifugation d’ultrafiltration et ultracentrifugation avec centrifugation en gradient de densité, d’isoler des vésicules extracellulaires des échantillons de liquide de lavage broncho-alvéolaire murine. Les vésicules extracellulaires dérivés du murin de lavage bronchoalvéolaire par ces deux méthodes sont quantifiés et caractérisés.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vésicules extracellulaires (EVs) sont des composants subcellulaires nouvellement découverts qui jouent un rôle important dans de nombreux biologique des fonctions de signalisation lors d’États physiologiques et pathologiques. L’isolement du SVE demeure un défi majeur dans ce domaine, en raison des limites inhérentes à chaque technique. L’ultracentrifugation différentielle avec la méthode de centrifugation en gradient de densité est une approche couramment utilisée et est considérée comme la procédure de l’étalon-or pour l’isolement de l’EV. Toutefois, cette procédure est longue et fastidieuse et donne généralement lieu à faible évolutivité, qui peut ne pas convenir pour les petits échantillons comme liquide de lavage broncho-alvéolaire. Nous démontrons qu’une méthode d’isolement de centrifugation ultrafiltration est simple et efficace-temps et travail encore fournit un rendement élevé de récupération et la pureté. Nous proposons que cette méthode d’isolement pourrait être une approche alternative qui convient pour l’isolation de l’EV, particulièrement pour les petits spécimens biologiques.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosomes sont le plus petit sous-ensemble du SVE, 50 à 200 nm de diamètre et ont plusieurs fonctions biologiques à travers un large éventail de processus1,2,3,4,5de signalisation. Elles régissent l’homéostasie cellulaire et tissulaire principalement en facilitant la communication intercellulaire par l’intermédiaire de molécules de fret comme les lipides, les protéines et acides nucléiques6,7,8,9 . Une étape critique dans la recherche de l’EV est le processus d’isolement. Ultracentrifugation différentielle (UC), avec ou sans la centrifugation en gradient de densité (DGC), est considéré comme l’approche de l’étalon-or, mais cette méthode comporte des limites importantes, y compris les taux de récupération des EV inefficaces et faible évolutivité10 , 11 , 12, qui limitent sa meilleure utilisation de plus grands échantillons de volume, comme cell culture exosome surnageant ou haute production. Les avantages et les inconvénients des autres méthodes, telles que l’exclusion de taille par ultrafiltration ou chromatographie d’immunoaffinité isolation par perles ou colonnes et microfluidique, sont bien décrits, et des procédures supplémentaires modernes ont été développés pour surmonter et réduire au minimum les limitations techniques dans chaque approche11,12,13,14,15. D’autres ont montré qu’une centrifugation d’ultrafiltration (UFC) par une membrane NANOPOREUSE dans l’unité de filtration est une technique alternative qui assure une pureté comparable à une UC méthode16,17,18. Cette technique pourrait être considérée comme une des méthodes alternatives d’isolation.

Lavage bronchoalvéolaire (LLBA) contient le serveur virtuel Exchange qui possède de nombreuses fonctions biologiques dans diverses affections respiratoires19,20,21,22. Étudier EVs BALF dérivés implique certains défis en raison de l’empiétement que constitue la procédure bronchoscopie chez l’homme, mais aussi une quantité limitée de récupération liquide de lavage. Petits animaux de laboratoire comme les souris, seulement quelques millilitres peuvent être récupérés dans des conditions normales de poumon, encore moins dans les poumons enflammés ou fibreuses23. Par conséquent, recueillir une quantité suffisante de BALF pour EV isolement par une ultracentrifugation différentielle pour les applications en aval ne peut être réalisable. Cependant, les populations EV correctes est d’isoler un facteur crucial pour l’étude des fonctions biologiques EV. Le fragile équilibre entre l’efficience et l’efficacité continue d’être un défi dans les méthodes d’isolation EV bien établies.

Dans cette étude, nous montrons qu’une approche de l’ultrafiltration centrifuge, utilisant une unité de filtration 100 kDa poids moléculaire limite (MWCO) nanomembrane, est adaptée aux petits échantillons biologiques tels que BALF. Cette technique est simple, efficace et fournit la haute pureté et évolutivité pour soutenir l’étude des dérivés BALF EVs.

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Protocole

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L’utilisation des animaux et toutes les procédures d’animaux ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation comités (IACUC) au Cedars-Sinai Medical Center (CSMC).

1. préparation et collecte de fluide (LLBA) murin lavage broncho-alvéolaire

  1. Collection de BALF
    1. Euthanasier la souris avec un cocktail de kétamine (300 mg/kg) et de xylazine (30 mg/kg) par voie intrapéritonéale suivie par dislocation cervicale.
    2. Insérer un cathéter 22 G dans la trachée. Fixez une seringue à insuline contenant 1 mL (mL) de solution saline tampon phosphate de Dulbecco stérile glacé (SPD) et instiller 1 mL du SPD dans les deux poumons à travers le cathéter.
    3. Retirer lentement le piston de la seringue pour récupérer BALF et distribuer la BALF dans un tube conique de 50 mL. Garder la BALF sur la glace.
    4. Répétez les étapes 1.1.2 et 1.1.3). 3 x (4 au total dans chacune des souris).
      Remarque : Environ 0,8 mL est généralement récupéré par millilitre de l’instillation. Aussi, les étapes suivantes peuvent être exécutées pour chaque souris (c.-à-d., 3 mL de BALF), mais la mise en commun de plusieurs échantillons BALF permettra l’isolement d’un lot plu d’EVs pour assurer l’uniformité dans les expériences en aval.
  2. Préparation de la BALF
    1. Piscine BALF de 25 souris et divisez-le en deux ensembles égales (environ 35 mL / portion).
    2. Centrifuger le BALF x 400 g, à 4 ° C pendant 5 min, afin de retirer les cellules et autres débris cellulaires et récupérer le surnageant.
    3. Centrifuger le surnageant à 1 500 g, à 4 ° C pendant 10 min, pour supprimer les débris cellulaires. Recueillir le liquide surnageant et passez aux étapes d’isolation EV.

2. isolement des vésicules extracellulaires du fluide Murine lavage broncho-alvéolaire

Remarque : Dans cette étude, EV deux techniques d’isolation, nommément UFC et ultracentrifugation avec flottant utilisé pour isoler EVs de BALF. Le protocole détaillé de chaque méthode est décrite ci-dessous.

  1. Méthode d’enrichissement ultrafiltration centrifugation (UFC)
    Remarque : Cette méthode a été modifiée d’un protocole décrit précédemment10.
    1. Filtrer le surnageant à l’étape 1.2.3 à travers un filtre de seringue stérile 0,2 μm et garder la BALF filtrée sur la glace.
      NOTE : Ceci est une mesure d’exclusion de taille selon laquelle seuls les vésicules inférieurs à 200 nm sont collectées.
    2. Equilibrer l’unité de filtration centrifuge de MWCO 100 kDa avec SPD stérile pendant 10 min. Centrifuger l’unité centrifuge à 1 500 x g pendant 10 min à 4 ° C pour ignorer le SPD.
      ATTENTION : Une fois la membrane dans le dispositif de filtration est équilibrée avec le SPD, la membrane doit rester humide en tout temps jusqu'à ce que l’appareil est utilisé.
    3. Remplir le filtre avec 15 mL d’échantillon BALF étape 2.1.1 et centrifuger à 3 000 x g pendant 30 min à 4 ° C. La BALF intermédiaires peut être mis au rebut ou recueilli dans une éprouvette canonique et stockée à-80 ° C pour une utilisation future.
    4. Répétez l’étape 2.1.3 pour les restants 0,2 µm filtré BALF.
      Remarque : Il a fallu trois répétitions de centrifugations de concentrer suffisamment l’EVs BALF de volume départ initial de 35 mL. Il en est résulté 1 – 1,5 mL de rétentat.
    5. Laver le rétentat avec 14 mL de SPD stérile par une douceur pipetage répétitivement. Centrifuger l’ensemble filtrant à 3 000 x g, à 4 ° C pendant 30 min, retirez du SPD et de se concentrer le rétentat EV.
    6. Recueillir le SVE concentré BALF-dérivé de l’appareil de filtrage en insérant une pipette dans le bas de l’appareil filtre et en retirant l’échantillon à l’aide d’un mouvement de balayage à côté pour assurer le recouvrement total.
    7. Aliquote le SVE BALF-dérivées et les stocker à-80 ° C pour les autres particules quantification et caractérisation (voir étape 3).
  2. Ultracentrifugation (UC) avec centrifugation en gradient de densité (DGC)
    Remarque : Le protocole suivant a été modifié depuis le protocole décrit précédemment24.
    1. Transférer le surnageant de l’étape 2.1.1 dans un tube de 37 mL ultracentrifugeuse et centrifuger l’échantillon à 10 000 x g pendant 30 min à 4 ° C à l’aide d’ultracentrifugeuse. Recueillir le liquide surnageant et centrifuger à 100 000 x g, à 4 ° C pendant 60 min. Pendant que les pellets EV sont centrifugés, préparer différentes concentrations de tampons de gradient de densité (tableau 1) pour l’étape 2.2.3.
    2. Jeter le surnageant et remettre en suspension les pellets EV dans 200 μl de SPD.
    3. Mélanger la suspension EV à 300 μl de solution de travail iodixanol de 50 % (tableau 1) et transférez-le vers le tube de 15 mL ultracentrifugeuse. Sur le dessus de la suspension de mélange 50 % iodixanol-EV, séquentiellement couche la solution tampon suivant dans l’ordre du bas vers le haut : 30 % iodixanol (4,5 mL), 25 % d’iodixanol (3 mL), 15 % iodixanol (2,5 mL) et 5 % iodixanol (6 mL). Centrifuger à 100 000 x g, à 4 ° C min 230.
      Remarque : Le gradient de densité est basé sur le pourcentage de mise à l’échelle la plus forte concentration (50 %) dans la partie inférieure à la concentration la plus faible (5 %) au sommet d’iodixanol. Pour générer les différentes concentrations d’iodixanol, des quantités variables de milieu d’homogénéisation (tableau 1) ont été mélangées avec la solution de travail (50 % iodixanol).
    4. Recueillir la fraction de 15 % et 25 % et Diluez-les dans SPD stérile pour faire apparaître le volume à 15 mL. Transférez-les dans un nouveau tube petit ultracentrifugeuse et centrifuger à 100 000 x g, à 4 ° C pendant 60 min.
    5. Jeter le surnageant et remettre en suspension les pellets EV dans 50 μL de SPD stérile pour davantage de caractérisation.

3. extracellulaire vésicule Quantification

Remarque : Le rendement de récupération de dérivés BALF EVs est dosé avec deux paramètres.

  1. NANOPARTICULES suivi mesure analyse (NTA)
    1. Diluer l’échantillon EV au 1 : 200 – 1/500 à 1 mL de SPD et charge l’échantillon dans une seringue à insuline. Fixez une seringue d’échantillon à un pousse-seringue et commencer à mesurer le nombre de particules et la taille (voir Table des matières).
    2. Définir le niveau de l’appareil photo à 14 et le seuil de détection à 1 pour toutes les mesures de l’échantillon. Cinq mesures répétitives avec 1 500 cadres en 30 s ont été enregistrés pour chaque échantillon, avec une temporisation de 20 s entre les lectures. Combiner et les données pour les rapports de taille et de concentration finale en moyenne.
      Remarque : Pour capturer précis de toutes les particules, réglez le niveau de la caméra selon qu’il conviendra de visualiser toutes les particules et d’utiliser des paramètres semblables pour toutes les mesures d’échantillons dans chaque expérience.
  2. Quantification des protéines
    Remarque : L’analyse de protéine (BCA) acide bicinchoninic a été utilisé pour mesurer la concentration de la protéine de l’EVs BALF-dérivé.
    1. Solubiliser les échantillons EV dans le tampon de lyse x 1.
    2. Quantifier la quantité de protéine dans le SVE BALF dérivée selon le protocole standard de BCA à l’aide de détection colorimétrique en mesurant l’absorbance à 560 nm dans un lecteur de plaque.

4. détection des vésicules extracellulaires dérivés BALF

NOTE : Protéines de marqueur de surface communément appelé exosome (TSG101 CD63, CD81 et CD9) ont servi à vérifier les recouvrements EV par SDS-PAGE et immunoblotting et écoulement cytometry analyse.

  1. SDS-PAGE et immunoblot
    1. Dissoudre une quantité égale de protéines EV de chaque échantillon avec un buvard tampon (dodécyl sulfate de lithium) et 50 mM le dithiothréitol (DTT) dans un tube de 1,6 mL de chargement. Faire chauffer les échantillons à 70 ° C pendant 10 min.
    2. Charger les échantillons de l’étape 4.1.1 dans un gel d’acrylamide Bis-Tris Plus 4 – 12 % et exécuter l’électrophorèse (150 volts, 35 mA) pendant 35 min.
    3. Protéines de transfert sur une membrane de nitrocellulose en utilisant une méthode de transfert a sec.
    4. Bloquer la membrane avec du lait écrémé en poudre 5 % pendant 60 min, bascule à température ambiante (RT).
    5. Incuber la membrane avec un anticorps dirigé contre un marqueur de la protéine de surface EV, tumeur Susceptibility Gene 101 (TSG101), à la dilution de 1/500 à 5 % de BSA dans du tampon Tris salin Tween-20 (TBST) à 4 ° C, bascule du jour au lendemain.
    6. Le lendemain, lavez la membrane 3 x, 10 min chacun laver, dans un tampon TBST et incuber il avec anti-lapin IgG, un anticorps HRP-joint, à 1:5,000 de dilution pendant 60 min à température ambiante.
    7. Laver la membrane 3 x, 10 min chacun laver, dans un tampon TBST. Développer la membrane avec le réactif de détection des anticorps HRP par chimiluminescence et image (voir la Table des matières pour le système d’imagerie).
  2. Cytométrie en flux
    1. Diluer les dérivés BALF EVs dans le 49 μL de PEB coloration tampon (PBS, 5 mM EDTA + 0,5 % de BSA, filtrée à travers une membrane de filtre de seringue de 0,1 μm).
    2. Ajouter chacun des anticorps suivants dans chaque échantillon individuel : 1) rat de PE CD63 anticorps anti-souris (100 ng par réaction) ; 2) anti-souris rat PE CD81 (500 ng) ; 3) anti-souris rat CD9 FITC (200 ng). Incuber à 4 ° C, bascule pendant 60 min à l’obscurité.
    3. Diluer les échantillons avec 450 μl de membrane filtrée PEB tampon de coloration et de soumettre des échantillons pour analyse en cytométrie en flux (voir Table des matières)25.
    4. Ajuster les paramètres de cytomètre de flux comme suit : 1) Réglez tous les canaux hyper log (hlog) ; 2) régler la gâchette sur SSC à 4 ; 3) désactiver la détente secondaire. Exécuter les exemples dans un environnement à basse vitesse et acquérir au moins 10 000 événements dans chaque échantillon.
    5. Effectuer des analyses de données cytometry faible dans chaque échantillon à l’aide de logiciels d’analyse (voir Table des matières).

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Résultats

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Nous avons réalisé isolement EV de souris BALF à l’aide de méthodes d’isolation UFC et UC-GCR le jour même. La méthode UFC exigeait environ 2,5 à 3 h, tandis que la technique de l’UC-DGC requis 8 h de temps de traitement. Cela ne comprenait pas les tampons et les temps de préparation de réactif. Il est à noter que certaines autres tâches peuvent être effectuées durant les périodes longues de centrifugation. Néanmoins, l’ensemble de la procédure a duré presque une journée entière pour la t...

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Discussion

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Dans les dernières décennies, les scientifiques ont démêlé les significations du SVE dans l’homéostasie cellulaire. Plus important encore, les EVs jouent un rôle important dans de nombreux processus de maladie en modulant les cellules voisines et lointaines à leur cargaison bioactifs molécules1,21,22,26,27 , 28 , <...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le travail est soutenu par les subventions NHLBI/NIH HL103868 (à C.P.) et HL137076 (à C.P.), l’American Heart Association subvention (à C.P.) et le Samuel Oschin complets Cancer Institute (SOCCI) Lung Cancer Research Award (à C.P.). Nous tenons à exprimer notre vive reconnaissance à l’Institut de cardiologie de Smidt au Cedars-Sinai Medical Center qui nous fournit une machine Nanosight pour EV NANOPARTICULE analyse de suivi.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Material
Amicon Ultra-15 Ultracel-100KSigma-Millipore, St. Louis, MOUFC910024
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)Corning Cellgro, Manassas, VA21-031-CV
SaccharoseSigma-Millipore, St. Louis, MOEMD8550
HEPESResearch Products International, Prospect, IL75277-39-3
EDTACorning Cellgro, Manassas, VA46-034-CI
Chlorure de sodiumSigma-Millipore, St. Louis, MOS3014-1KG
OptiPrepSigma-Millipore, St. Louis, MOMKCD9753Gradient de densité moyen
KétamineVetOne, Boise, ID13985-702-10
XylazineAkorn Animal Health, Lake Forest, IL59399-110-20
Seringue 1 mLSeringue BD, Franklin Lakes, NJ309656
Angiocatheter 20 GBD Seringue, Franklin Lakes, NJ381703
Tubes à centrifuger 15 mLVWR, Radnor, PA89039-666
Tubes à centrifuger 50 mLCorning Cellgro, Manassas, VA430828
Test de la protéine d’acide bicchonique (BCA)Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL23235
Anticorps anti-souris TSG101 de lapinAbCam, Cambridge, MAAB125011
Anticorps anti-souris PE-CD63 de ratBiolegend, San Diego, CA143904
CD81
CD9
IgG anti-lapin, anticorps liés à HRPTechnologie de signalisation cellulaire, Danvers, MA7074S
4x LDS
10x Agent réducteur (Bolt)
10x Tampon de lyse (Bolt)Technologie de signalisation cellulaire, Danvers, MA
Bolt 4-12 % Bis-Tris Plus acrylamidegel Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MANW04120
iBlot 2 Mini piles de nitrocelluloseInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAIB23002
Réactif chimiluminescent de détection d’anticorps HRP HyGLODenville Scientific, Holliston, MAE2400
Tubes ultracentrifuges 17 mLBeckman Coulter, Pasadena, CA337986
Tubes ultracentrifuges 38,5 mLBeckman Coulter, Pasadena, CA326823
Corning SFCA Filtres pour seringues 0.2 & micro ; m poreThermo Fisher Scientific, Waltham, MA09-754-13
Equipment
CentrifugeuseEppendorf, Hambourg,Allemagne-Ultracentrifugeuse
Beckman Coulter, Pasadena, CA-Nanosight
(NS300)Malvern, Worcestershire,UK-Pourmesurer la distribution granulométrique et concentration de particules
MACSQuant Analyzer 10 cytomètre en fluxMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,Allemagne-iBlot
Appareil de transfertThermo Fischer Scientific, Waltham, MA-Bio-Rad
ChemiDoc MP Imaging SystemBio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10Logiciel d’analyse
Filtres centrifuges

Références

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