Réalisation de multiples Modes d’imagerie avec un Microscope à Fluorescence

Summary

Nous présentons ici un guide pratique de construction d’un système de microscopie intégrée, qui fusionne l’imagerie conventionnelle épi-fluorescence, l’imagerie Super-résolution axée sur la détection de molécules simples et détection de molécules simples multicolore, y compris transfert d’énergie Single-molecule fluorescence resonance imaging, dans une mise en place d’une manière rentable.

Abstract

La microscopie de fluorescence est un outil puissant pour détecter des molécules biologiques in situ et surveiller leur dynamique et les interactions en temps réel. En plus de la microscopie épifluorescente classiques, diverses techniques d’imagerie ont été développés pour atteindre des objectifs précis expérimentales. Les techniques répandues parmi single-molecule fluorescence transfert d’énergie (smFRET), qui peut signaler des changements conformationnels et interactions moléculaires avec une résolution de l’angström et molécule unique axée sur la détection Super résolution (SR) d’imagerie, qui peut améliorer la résolution spatiale environ dix à vingt par rapport à la microscopie limitée par la diffraction. Nous présentons un système intégré de conçue par le client, qui fusionne plusieurs méthodes d’imagerie dans un microscope, y compris l’imagerie conventionnelle épi-fluorescence, molécule unique axée sur la détection SR imagerie et détection de molécules simples multicolore, y compris l’imagerie smFRET. Différentes méthodes d’imagerie est possible facilement et de façon reproductible par des éléments optiques de commutation. Cette configuration est facile à adopter par tout laboratoire de recherche en sciences biologiques avec un besoin de routine et diverses expériences d’imagerie à un coût réduit et espace par rapport aux microscopes distincts à des fins individuelles de construction.

Introduction

Microscopes de fluorescence sont des outils importants pour la recherche en sciences biologiques modernes et imagerie de fluorescence est effectuée régulièrement dans de nombreux laboratoires de biologie. Par le marquage de molécules d’intérêt avec des fluorophores, nous pouvons directement les visualiser au microscope et enregistrer les changements temporels dans la localisation, conformation, interaction et l’Assemblée d’état in vivo ou in vitro. Microscopes de fluorescence conventionnels ont une résolution spatiale limitée par la diffraction, c'est-à-dire ~ 200-300 nm dans le sens latéral et ~ 500-700 nm dans le sens axial¹....

Protocol

1. montage et conception du microscope

1. Chemin de l’excitation
   Remarque : Le chemin d’accès d’excitation comprend des lasers, composants (DIC) de contraste interférentiel différentiel, le corps de microscope et ses bras d’éclairage.
   1. Préparer une table optique vibration isolé. Par exemple, un tableau amortissement structural de 48 x 96 x 12'' donne assez d’espace pour tous les composants.
      NOTE : Construire la mise en place dans une chambre avec contrôle de la température (par exemple, 21,4 ± 0,55 ° C). Stabilité de température est essentielle pour maintenir l’alignement optique.
   2. Installer un corps de microsco....

Results

Ce microscope permet flexible et reproductible de commutation entre les différentes méthodes d’imagerie. Nous montrons ici des exemples d’images collectées avec chaque module d’imagerie.

Figure 5 illustre la PSF de la molécule de clignotant sur lors de l’acquisition de SR. Des milliers de telles images sont reconstruits pour générer l’image finale de SR (Figure 5E).

Discussion

Ce système de microscope hybride élimine le besoin d’acheter plusieurs microscopes. Le coût total de toutes les parties, y compris la table optique, table installation travail, logiciel et poste de travail, est environ $ 230 000. Les pièces usinées avec personnalisé, y compris l’objectif mag et l’objectif 3D, coûtent environ 700 $ (le coût dépend des montants réels exigés dans les différents instituts). Typique disponible dans le commerce des systèmes intégrés pour la microscopie seule molécule de SR axée sur la détectio.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Support de microscope Nikon Ti-E	Nikon	Ti-E
Nikon		100X NA 1.49 CFI HP TIRF
Logiciel d’imagerie de microscopie	Nikon	NIS-Elements Advanced Research/HC	HC comprend le module « JOBS », le module d’acquisition programmé utilisé pour l’imagerie SR.
Le bras d’éclairage	Nikon	Ti-TIRF-EM Unité d’éclairage motorisé M	Ce bras dispose d’une fente pour une lentille de grossissement
Bloc d’analyse	Nikon	Ti-A Celui-ci	est installé dans la tourelle du filtre.
Système de correction de la dérive en Z	Nikon	PFS	Ce système est composé d’un moteur pas à pas sur la tourelle porte-objectifs d’un objectif, d’une LED IR et d’un détecteur.
Plateau de table optique	TMC	783-655-02R
Bases de table optiques	TMC	14-426-35
647 nm laser	Cobolt	90346 (0647-06-01-0120-100)	Diode laser modulée 647nm 120mW avec tête laser, boîtier de commande CDRH, câble USB et bloc d’alimentation (bloc d’alimentation)
Laser 561 nm Cohérent		1280721	OBIS 561nm LS 150mW Système laser
488 nm	Cobolt	90308 (0488-06-01-0060-100)	Diode laser modulée 488nm 60mW avec tête laser, boîtier de commande CDRH, câble USB et bloc d’alimentation (bloc d’alimentation)
Cristalliseur	laser 405 nm	DL405-025-O	405 (+/-5)nm, 25mW, Circulaire , M2 < 1.3, Low Noise, CW, TTL jusqu’à 20MHz. 2 connecteurs BNC pour TTL & Dissipateur
thermique	Cobolt	11658 (HS-03)	Deux unités, Dissipateur thermique sans ventilateur HS-03, Dissipateur thermique pour lasers 647 nm et 488 nm
Dissipateur thermique	Cohérent	1193289	Dissipateur thermique Obis avec ventilateur, 165 x 50 x 50 mm pour le laser 561 nm
CAB-USB-miniUSB	Cobolt	10908	Deux unités, câble de communication pour lasers 647 nm et 488 nm
Aluminium pour le réglage en hauteur	McMaster-Carr	9146T35	Aluminium 6061 polyvalent, barre rectangulaire, 4 MM x 40 mm, 1 pi de long pour le levage Aluminium laser 561 nm
pour le réglage de la hauteur	McMaster-Carr	8975K248	Aluminium 6061 polyvalent, 1-1/4" d’épaisseur x 3 po de largeur x 1 pi Longueur pour le levage du câble BNC laser 405 nm
	L-com	CC58C-6	RG58C Câble coaxial, BNC mâle / mâle,
adaptateur BNC	L-com	BA1087	Adaptateur coaxial, cloison BNC,
adaptateur SMA vers BNC mis à	HOD	SMA-870	Cobolt MLD ont une interface SMA, cet adaptateur est donc utilisé pour la connexion BNC.
Adaptateur SMB vers BNC	Fairview Micro-ondes	FMC1638316-12	SMB Plug vers BNC Câble de cloison femelle RG316 Coaxial en 12 pouces pour lasers Obis cohérents
Carte d’acquisition de données	National Instruments	PCI-6723	13 bits, 32 canaux, 800 kéch./s Périphérique de sortie analogique pour le contrôle des lasers, LED DIC, etc
Contrôleur de roue à filtres barrière	Sutter Instrument	Lambda 10-B	Changeur
de filtre optiqueSéparateur d’émission	Cairn	OptoSplit III
Séparateur de faisceau dichroïque	Chroma	T640LPXR-UF2	Séparateur de faisceau dichroïque séparant l’émission rouge de l’émission verte dans OptoSplit III
Séparateur de faisceau dichroïque	Chroma	T565LPXR-UF2	Séparateur de faisceau dichroïque séparant l’émission verte et rouge de l’émission bleue dans OptoSplit III
Filtre d’émission	Chroma	ET700/75M	Deux unités, Filtre d’émission pour l’émission rouge (comme Alexa Fluor 647) dans OptoSplit III ainsi que dans la roue à filtres barrière
Filtre d’émission	Chroma	ET595/50M	Deux unités, Filtre d’émission pour l’émission jaune/vert (comme Cy3B) dans OptoSplit III ainsi que dans la roue à filtres barrière
Filtre d’émission	Chroma	ET525/50M	Deux unités, Filtre d’émission pour l’émission de bleu (comme Alexa Fluor 488/GFP) dans OptoSplit III ainsi que dans la roue à filtres barrière
Filtre d’émission	Semrock	FF02-447/60-25	Filtre d’émission pour émission violette (comme DAPI/Alexa Fluor 405), installé dans la roue à filtres
barrière Séparateur de faisceau dichroïque	Chroma	zt405/488/561/647/752rpc-UF3	Séparateur de faisceau dichroïque multibande pour excitations laser 647, 561, 488 et 405 nm à l’intérieur du corps du microscope
Jeu de filtres DAPI	installé		dans le corps du microscope
laser/TIRF Nikon	Chroma	91032
590 Filtre passe-long	Chroma	T590LPXR-UF1	pour combiner un laser 647 nm et un laser 561 nm
Filtre passe-long 525	Chroma	T525LPXR-UF1	pour combiner des lasers 647 nm et 561 nm déjà combinés avec un laser 488 nm
Filtre passe-long 470	Chroma	T470LPXR-UF1	pour combiner des lasers 647 nm, 561 nm et 488 nm déjà combinés avec un laser 405 nm
Filtre de nettoyage laser (647)	Chroma	zet640/20x	pour nettoyer les autres longueurs d’onde du laser 647 nm
Filtre de nettoyage laser (488)	Semrock	LL01-488-25	pour nettoyer d’autres longueurs d’onde de la source lumineuse laser LED 488 nm
	Excelitas	X-Cite120LED	utilisée uniquement pour l’imagerie DAPI
Monture miroir	Newport	SU100-F3K
Poteaux optiques	Newport	PS-2
Fourche de serrage	Newport	PS-F
Power Meter	Newport	PMKIT	Pour la mesure de la puissance laser
Monture de combinateur de faisceaux dichroïques	Edmund Optics	58-872	Monture cinématique à monture C, pour maintenir les combinateurs de faisceaux dichroïques dans l’ensemble d’excitation laser
Bague de retenue	Thorlabs	CMRR	utilisée pour les montures de combinateur de faisceaux dichroïques
Plaque d’adaptation de fibre	Thorlabs	SM1FC	FC/PC Plaque d’adaptation de fibre avec SM1 externe (1.035"-40)
Monture translationnelle de l’axe Z	Monture de translation de l’axe Z Thorlabs	SM1Z	compatible avec la cage de 30 mm
	Thorlabs	AC050-008-A-ML	Ø ; 5 mm, doublets achromatiques montés, revêtement AR : plaque de cage 400 - 700 nm
	Thorlabs	CP1TM09	plaque de cage de 30 mm avec filetages internes M9 x 0,5, tige d’assemblage de cage de taraudage 8-32
Tige	d’assemblage de cage Thorlabs	ER4	, 4" de long, et Oslash ;
Support de montage de cage	Thorlabs	CP02B	Support de montage de cage de 30 mm
Fibre optique monomode	Thorlabs	P5-405BPM-FC-2	Câble de raccordement, PM, FC/PC vers FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m
Fibre optique multimode	Thorlabs	M42L01	Ø ; 50 et micro ; m, 0,22 NA, câble de raccordement à fibre optique FC/PC-FC-PC, 1 m
Lentille doublet achromatique (lentille magnétique)	Thorlabs	ACN127-025-A	ACN127-025-A - f=-25,0 mm, & Oslash ; Doublet achromatique 1/2 », ARC : 400-700 nm, une lentille concave dans la « lentille mag"
Lentille doublette achromatique (lentille magnétique)	Thorlabs	AC127-050-A	f=50,0 mm, & Oslash ; Doublet achromatique 1/2 », ARC : 400-700 nm, une lentille convexe dans la « lentille mag"
Bague de retenue	Thorlabs	SM05PRR	SM05 Bague de retenue en plastique pour & Oslash ; Tubes et montures d’objectif 1/2 », pour « objectif mag
"Vis à embout nylon	Thorlabs	SS3MN6	M3 x 0,5 Vis de réglage à pointe de nylon, 6 mm de long, pour maintenir « objectif 3D"Objectif 3DObjectif
3D	CVI Laser Optics	RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700	f=10 m, lentille cylindrique rectangulaire
Caméra EMCCD	Andor	iXon Ultra 888
100 nm billes multicanaux	Thermo	T7279, microsphères
colorant rouge	Thermo	Alexa Fluor 647
colorant jaune-vert	GE Healthcare	Cy3
colorant vert	GE Healthcare	Cy3B
colorant bleu	Thermo	Alexa Fluor 488