Réalisation de multiples Modes d’imagerie avec un Microscope à Fluorescence

Summary

Nous présentons ici un guide pratique de construction d’un système de microscopie intégrée, qui fusionne l’imagerie conventionnelle épi-fluorescence, l’imagerie Super-résolution axée sur la détection de molécules simples et détection de molécules simples multicolore, y compris transfert d’énergie Single-molecule fluorescence resonance imaging, dans une mise en place d’une manière rentable.

Abstract

La microscopie de fluorescence est un outil puissant pour détecter des molécules biologiques in situ et surveiller leur dynamique et les interactions en temps réel. En plus de la microscopie épifluorescente classiques, diverses techniques d’imagerie ont été développés pour atteindre des objectifs précis expérimentales. Les techniques répandues parmi single-molecule fluorescence transfert d’énergie (smFRET), qui peut signaler des changements conformationnels et interactions moléculaires avec une résolution de l’angström et molécule unique axée sur la détection Super résolution (SR) d’imagerie, qui peut améliorer la résolution spatiale environ dix à vingt par rapport à la microscopie limitée par la diffraction. Nous présentons un système intégré de conçue par le client, qui fusionne plusieurs méthodes d’imagerie dans un microscope, y compris l’imagerie conventionnelle épi-fluorescence, molécule unique axée sur la détection SR imagerie et détection de molécules simples multicolore, y compris l’imagerie smFRET. Différentes méthodes d’imagerie est possible facilement et de façon reproductible par des éléments optiques de commutation. Cette configuration est facile à adopter par tout laboratoire de recherche en sciences biologiques avec un besoin de routine et diverses expériences d’imagerie à un coût réduit et espace par rapport aux microscopes distincts à des fins individuelles de construction.

Introduction

Microscopes de fluorescence sont des outils importants pour la recherche en sciences biologiques modernes et imagerie de fluorescence est effectuée régulièrement dans de nombreux laboratoires de biologie. Par le marquage de molécules d’intérêt avec des fluorophores, nous pouvons directement les visualiser au microscope et enregistrer les changements temporels dans la localisation, conformation, interaction et l’Assemblée d’état in vivo ou in vitro. Microscopes de fluorescence conventionnels ont une résolution spatiale limitée par la diffraction, c'est-à-dire ~ 200-300 nm dans le sens latéral et ~ 500-700 nm dans le sens axial^1,2et sont, par conséquent, limité à l’imagerie à la 100 s de échelle de nanomètres-à-micron. Afin de révéler les détails dans l’Assemblée moléculaire ou l’organisation, les différentes microscopies SR qui peuvent briser la limite de diffraction ont été développés. Stratégies utilisées pour atteindre SR comprennent des effets optiques non linéaires, tels qu’émission stimulée épuisement (STED) microscopie^3,4 et illumination structurée microscopie (SIM)^{5,6, 7}, stochastique détection de molécules simples, tels que le stochastique optique reconstruction microscopie (tempête)⁸ et photoactivation localisation microscopie (PALM)⁹et une combinaison des deux, par exemple MINFLUX¹⁰. Parmi ces microscopies SR, microscopes de SR axée sur la détection seule molécule peuvent être modifiés relativement facilement d’une configuration de microscope de molécules simples. Avec activation répétitive et l’imagerie des protéines fluorescentes photoactivatable (FPs) ou photo-commutable colorants contenant le tag sur les biomolécules d’intérêt, une résolution spatiale peut atteindre 10 à 20 nm¹¹. Pour obtenir des informations sur les interactions moléculaires et conformationnelle dynamique dans la résolution en temps réel, angstrom-à-nanomètre est nécessaire. smFRET^12,13 est une façon d’atteindre cette résolution. En général, selon les questions biologiques d’intérêt, les méthodes d’imagerie avec différentes résolutions spatiales sont nécessaires.

En général, pour chaque type d’imagerie, configuration optique excitation et/ou d’émission spécifique est nécessaire. Par exemple, une des méthodes illumination plus couramment utilisés pour la détection de molécules simples est par le biais de la réflexion totale interne (TIR), dans lequel un angle excitation spécifique doit être réalisé à travers un prisme ou au travers de l’objectif. Pour la détection de smFRET, les émissions des colorants donneur et accepteur doivent être spatialement séparés et dirigés vers les différentes parties de l’électron-multipliant, coupled dispositif de charge (EMCCD), qui peut être réalisé avec un jeu de miroirs et de séparateurs de faisceau dichroïque placé dans le chemin d’émission. Pour en trois dimensions (3d) SR d’imagerie, un composant optique, comme une lentille cylindrique¹⁴, est nécessaire pour provoquer un effet de l’astigmatisme dans le chemin d’accès d’émission. Par conséquent, fabrication artisanale ou microscopes intégrés disponibles dans le commerce sont, généralement, fonctionnellement spécialisés pour chaque type de méthode d’imagerie et ne sont pas flexibles pour basculer entre les différentes méthodes d’imagerie sur la mise en place même. Nous présentons un système hybride rentable, qui fournit des commutateurs réglables et reproductibles entre trois différentes méthodes d’imagerie : conventionnelle épi-fluorescence imagerie avec une résolution limitée par la diffraction, axée sur la détection de molécules simples SR imagerie et détection de molécules simples multicolore, y compris smFRET imaging (Figure 1 a). Plus précisément, le montage présenté ici contient des lasers d’entrée fibre couplés pour excitation multicolore et un bras d’éclairage commercial dans le chemin de l’excitation, qui permet de programmer contrôle de l’angle de l’excitation, pour basculer entre les modes TIR et epi. Dans le chemin d’accès d’émission, une cassette de lentille cylindrique amovible fabrication artisanale est placée dans le corps de microscope pour l’imagerie 3D SR, et un séparateur de faisceau commercial est placé devant une caméra EMCCD qui peut être sélectivement activée pour détecter plusieurs canaux d’émission en même temps.

Protocol

1. montage et conception du microscope

1. Chemin de l’excitation
   Remarque : Le chemin d’accès d’excitation comprend des lasers, composants (DIC) de contraste interférentiel différentiel, le corps de microscope et ses bras d’éclairage.
   1. Préparer une table optique vibration isolé. Par exemple, un tableau amortissement structural de 48 x 96 x 12'' donne assez d’espace pour tous les composants.
      NOTE : Construire la mise en place dans une chambre avec contrôle de la température (par exemple, 21,4 ± 0,55 ° C). Stabilité de température est essentielle pour maintenir l’alignement optique.
   2. Installer un corps de microscope qui est équipé d’un bras d’illumination pour le raccordement de la fibre optique, 100 X-immersion dans l’huile FRBR objectif et composants DIC.
   3. Placez les quatre têtes de laser (647 nm, 561 nm, 488 nm et 405 nm, encerclé dans la Figure 1 b) et leur chaleur coule sur la table optique, et assurez-vous que les faisceaux laser émis ont la même hauteur et sont aussi court que possible pour assurer une bonne stabilité (p. ex. 3'').
      Remarque : Si une tête laser se trouve à une hauteur plus courte que les autres lasers, mettre une plaque en aluminium avec une épaisseur suffisante sous elle. Vérifiez toujours le maximum de contact entre les dissipateurs de chaleur et de la table optique pour la meilleure dissipation de la chaleur (Figure 1 b). Les lasers doivent être assez puissants pour l’imagerie de la SR. Voir Table des matières. Il est recommandé d’avoir des filtres de nettoyage laser devant les lasers à diode.
   4. Installer une carte d’acquisition de données via une interface de peripheral component interconnect (PCI) dans un poste de travail et connecter les lasers avec cette carte. Contrôler les comportements ON/OFF des lasers par logique de transistor-transistor (TTL) de sortie et leur réglage de la puissance de la sortie analogique de cette carte (Figure 1). Installer un bon microscope imaging software (commerciale ou artisanale) pour contrôler la carte d’acquisition de données, ainsi que le corps de microscope.
   5. Montez les miroirs et les séparateurs de faisceau dichroïque (590, 525 et 470 longtemps passer les filtres) sur leurs montures respectives. Utiliser les supports de miroir très stable pour les miroirs. Utilisez diviseurs circulaires avec circlips pour éviter de tout plier les séparateurs de faisceau dichroïque (Figure 1).
   6. Placez les miroirs et les séparateurs de faisceau dichroïque sur la table optique pour combiner les faisceaux laser (Figure 1 b). Pour réaliser l’alignement plus stable, faire la solution proposée aussi compact que possible et utiliser 1''-épaisseur optique postes. Réorganisez les lasers afin que les lasers de longueur d’onde plus courtes sont plus proches de l’accouplement de la fibre optique (Figure 1 b) étant donné que les lumières de courte longueur d’onde se dissipent plus dans l’air.
   7. Combiner les faisceaux laser dans une fibre optique monomode. Pour ce faire, construire un coupleur de fibres dans un système de cage par les étapes suivantes :
      1. Monter un adaptateur fibre dans une monture de translation d’axe z (Figure 1E, groupe d’extrême gauche).
      2. Monter un objectif doublet achromatique (distance focale = 7,5 mm) dans une plaque de cage (Figure 1E, deuxième groupe de la gauche).
      3. Rassembler les deux parties ci-dessus de rallonges pour former une cage. Monter la cage sur la table optique avec supports de fixation sur les postes optiques 1'' d’épaisseur (Figure 1E, panneau central).
      4. Aligner le 647 nm laser tout d’abord avec une fibre optique (fin FC/APC au coupleur).
         Remarque : Un alignement approximatif en utilisant une fibre optique multimodale avant d’utiliser la fibre optique monomode peut aider le processus d’alignement. Ajuster les angles des miroirs et séparateurs de faisceau dichroïque (Figure 1, par les boutons de réglage), ainsi que la distance entre la lentille doublet achromatique et la plaque adaptatrice de fibre (Figure 1E, en ajustant le Mont traduction axe z) à gagner puissance maximale laser par l’intermédiaire de la fibre.
      5. Une fois l’alignement du premier laser fait, temporairement installer une paire d’IRIS et aligner le reste des lasers un après l’autre (Figure 1F). Vérifier l’efficacité de l’alignement avec un wattmètre.
      6. Laisser un iris sur le devant de la plaque d’adaptation pour réduire les reflets des lasers.
         NOTE : Strong retour réflexions peuvent réduire la durée de vie des sources laser. Éventuellement, un isolateur optique peut être installé en face de chaque tête de laser pour enlever les reflets complètement.
   8. Branchez l’autre extrémité de la fibre optique sur le bras de l’éclairage du microscope (Figure 1 H).
   9. Concevoir et installer le « grossissement objectif (mag) » par les étapes suivantes :
      Remarque : Les lasers peuvent être utilisés pour l’imagerie de l’épi-fluorescence de l’échantillon, mais la taille de faisceau étroit de chaque laser limite la zone éclairée de l’échantillon à une superficie plusieurs fois inférieure à la taille réelle du capteur caméra correspondante, en particulier pour les plus récents caméras (avec 18,8 mm en longueur de diagonale par rapport à la durée conventionnelle de 11,6 mm). Ainsi, il est souhaitable d’élargir le faisceau pour obtenir un éclairage plus large et plus plat de l’échantillon.
      1. Concevoir l’objectif mag, ce qui peut s’insérer dans le bras de l’éclairage (Figure 1 H).
         Remarque : La conception de l’objectif de mag dépend où il sera installé. 1 H de la figure montre un exemple de l’installation dans le bras de l’éclairage, mais il peut être installé dans n’importe quel endroit après que les faisceaux laser sont collimaté (voir Discussion). Concevoir avec un logiciel de rédaction et de conception assistée par ordinateur.
      2. Placer deux lentilles achromatiques, un concave (distance focale = f₁) et l’autre convexe (longueur focale = f₂) dans le porte-objectif mag artisanale (Figure 2 a et 2C), avec la distance égale à la somme de leurs focales, f₁ + f₂ = (-25) + 50 = 25 mm (Figure 2 b).
         Remarque : Avec ce choix de longueurs focales, l’objectif de mag étend le faisceau en f₂/ | f₁| = 2 plis. L’objectif de mag offre une polyvalence. Il peut être enlevé pour reprendre l’éclairage régulier sans développer les poutres (Figure 2D) ou insérée dans le sens inverse de concentrer le faisceau laser pour parvenir à une plus forte intensité d’excitation.

2. chemin d’accès d’émission

Remarque : Le chemin d’accès d’émission est composé d’une lentille cylindrique amovible, une roue de filtre de barrière, un séparateur d’émission et une caméra EMCCD (Figure 1). Pour atteindre le meilleur point spread function (PSF) de molécules simples, le prisme de la DIC est placé loin de l’objectif.

1. Concevoir la cassette cylindrique (objectif 3-d), qui peut s’insérer dans l’analyseur DIC manuel insérer la fente dans le corps du microscope (Figure 3).
   Remarque : Cette conception ne compromet pas l’analyseur DIC depuis un bloc analyseur peut être inséré dans la tourelle de filtre.
2. Placer la lentille 3D de 10 m de longueur focale dans la cassette et l’insérer dans le chemin d’accès du faisceau d’émission pour créer l’effet de l’astigmatisme nécessaire pour extraire la coordonnée z de chaque molécule unique¹⁴.
   Remarque : Vous pouvez également la cassette de la lentille 3D peut être placée dans ou hors de la trajectoire des émissions (Figure 3).
3. Installer un séparateur de faisceau dichroïque multi-band dans la tourelle de filtre à l’intérieur du corps de microscope.
4. Installer les filtres d’émission.
   Remarque : Les filtres d’émission sont choisis selon les fluorophores préférés. Selon le module d’imagerie, filtres d’émission placés à différents endroits sont utilisés tel que décrit ci-dessous :
   1. Pour l’imagerie séquentielle épifluorescente multicolore ou imagerie SR, utilisez des filtres d’émission placés dans la roue de filtre barrière relié près du corps de microscope pour minimiser les vibrations dans le corps du microscope au cours de la commutation de canal (Figure 1).
   2. Pour la détection simultanée multicolore (p. ex., des expériences de smFRET), placer un autre filtre dans un séparateur d’émission (cocher l’étape 4 pour plus de détails).
      Remarque : Généralement, un séparateur d’émission commerciale possède deux modes commutables (c.-à-d.« engagés » ou « bypass » modes). Pour séparer les lumières d’émission chromatiquement pour l’imagerie simultanée de multicolore (mode « engagé »), un cube de filtre tenant deux séparateurs de faisceau dichroïque et trois filtres d’émission est utilisé (« triple cube, » Figure 4 et 4D). Un emplacement vide dans la roue de filtre de barrière est utilisé en combinaison avec le cube triple. En revanche, pour l’imagerie séquentielle multicolore, le cube triple est remplacé par un cube qui a juste un miroir à l’intérieur (« contournement cube, » Figure 4 a et 4D).
5. Installez la caméra EMCCD comme la dernière partie du chemin d’émission. Utiliser la connexion USB-PCI pour atteindre une cadence rapide.
   Remarque : Une caméra EMCCD est recommandée pour la détection de molécules simples plus sensible, mais une caméra sCMOS avancée peut être une alternative.

3. diffraction-limited d’imagerie avec Epi-excitation

1. Orienter des lasers à excitation accessoires epi-mode dans le bras de l’illumination.
2. Débrayer la lentille 3D si engagé (Figure 3, panneau de droite).
3. Insérer le cube de dérivation dans le séparateur d’émission (Figure 4 a et 4F, panneau inférieur).
4. (Facultatif) Insérez la lentille mag pour une zone d’illumination élargie (Figure 2D, panneau de gauche).
   Remarque : Avec l’utilisation d’une lentille de mag et un 100 X objectif immersion dans l’huile, environ 91 x 91 µm² peuvent être illuminés uniformément, éliminant le besoin d’utiliser une source de lumière blanche et plusieurs cubes de filtre.
5. Utilisez une microscopie imagerie du logiciel pour pouvoir multi-canal, Z-pile ou Time-lapse images.
   Remarque : Il existe plusieurs programmes pour l’imagerie microscopie, non seulement de fabricants de microscopes, mais aussi de sociétés tierces ou de développeurs open source.

4. multi-canal Single-molecule Imaging y compris smFRET

Remarque : Déplacer vers une position « vide » dans la roue de filtre barrière, afin que toutes les émissions avec une longueur d’onde peuvent atteindre à la deuxième série de filtres/dichroïque séparateurs de faisceau dans le séparateur d’émission.

1. Pour configurer la détection de molécules simples multicolore de molécules de surface immobilisée¹⁵ utilisant l’excitation de la FRBR, y compris la mesure smFRET, orienter des lasers à excitation accessoires à l’angle de la FRBR. Débrayez l’objectif mag et la lentille 3D.
2. Engager le mode trois canaux dans le séparateur d’émission (Figure 1) par les étapes suivantes :
   1. Remplacer le cube de dérivation avec un cube « étalonnage » qui permet à la lumière de passer par tous les canaux (Figure 4 b et 4E).
   2. Mettez l’appareil photo sous DIC (c.-à-d., aucun filtre d’émission dans la roue de filtre barrière) et régler l’ouverture du séparateur d’émission jusqu'à ce que trois canaux entièrement séparés apparaître sur l’écran.
      Remarque : Effectuer cette étape avec la lumière allumée, pour visualiser tous les canaux.
   3. Tournez les boutons de commande de réglage vertical/horizontal sur la barre de fractionnement d’émission et aligner à peu près les trois canaux (Figure 4E et 4F).
   4. Éteignez votre appareil et remplacer le cube de calibration avec un triple cube (Figure 4 et 4E).
   5. Placez un échantillon avec 100 nm multicanal perles sur le dessus 100 X lentille d’objectif et de se concentrer sur l’échantillon.
   6. Allumez la caméra et le laser 488 nm, effectuer un zoom avant sur l’une des perles brillantes et finement aligner trois canaux en tournant les commande boutons de réglage à nouveau (Figure 4F et 4 G).
      Remarque : 100 nm perles multicanal émettent différentes longueurs d’onde de la lumière sur l’excitation de 488 nm, ce qui permet l’alignement de trois canaux.
3. Allumez la caméra et les lasers, les focus et trouver une bonne position avec une densité de spot raisonnable. Ajuster le temps de puissance et de l’exposition de laser pour atteindre des niveaux acceptables de signal-bruit et photoblanchiment. Utilisez la logiciel d’imagerie de la microscopie pour prendre des images de Time-lapse.

5. l’imagerie SR

NOTE : Ceci est la microscopie seule molécule de SR axée sur la détection.

1. Pour configurer l’imagerie SR, insérez la lentille 3D et retirez la lentille mag. Définir la durée d’exposition de la caméra dans les canaux de laser approprié (par exemple, 5 à 60 ms). Déterminer et définir manuellement l’angle accessoire des lasers à l’excitation optimal à l’angle de la FRBR.
2. Placer l’échantillon dans SR imagerie tampon¹⁶. Laisser le tampon s’équilibrer pendant au moins 10 min avant l’imagerie.
   NOTE : Tampon d’imagerie SR expire après environ 1 h, donc faire SR nouvelle imagerie tampon en conséquence.
3. Prendre une image DIC avant l’imagerie SR. Afin de trouver la bonne hauteur objective pour SR, qui optimise l’effet de l’astigmatisme, utiliser DIC imaging pour trouver le plan médian des cellules. Identifier le plan de la hauteur à laquelle les cellules de transition de la « lumière » images « sombre » et semblent devenir transparent (Figure 5 a, 5 bet 5C). Une fois le plan focal désiré est déterminé, engager le système de correction de dérive des z (Figure 1 a).
4. Imagerie de conduite de SR. Changer la puissance du laser de 405 nm pour maintenir une densité raisonnable de « clignotant-on » taches.
   Remarque : S’il est possible de changer le 405 nm laser manuellement, il est plus pratique d’exécuter un code d’acquisition de données programmées pour maintenir la densité de « clignotant-sur » taches. Voici un exemple de comment il se déroule automatiquement. Le code source est disponible sur demande (Figure 6).
   1. Démarrer l’acquisition d’imagerie avec puissance de laser violet 0 W/cm² .
   2. Compter le nombre de clignotement sur taches dans une certaine période.
   3. Moduler la puissance du laser violet afin de préserver le nombre de clignotement-sur les taches un seuil défini par l’utilisateur « comptage » dans le champ de vision. Augmenter la puissance de laser violet quand le nombre de clignotement sur taches descend sous le seuil de comptage.
   4. Résilier l’acquisition lorsque le nombre de clignotement sur taches descend sous le seuil de comptage à l’aide de la puissance maximale laser violet.
      Remarque : La valeur maximale peut être réglée différemment selon la luminosité de l’échantillon, mais ne dépassant pas 130 W/cm². Selon l’objectif réel de l’imagerie de SR, ce code d’acquisition automatique peut être résilié manuellement à tout moment.
5. Vérifier le comportement clignotant et SP des taches peu après le début de l’acquisition.
   Remarque : Si le comportement de clignotant n’est pas idéal, changer les accessoires angle des lasers à l’excitation ou remplacer le tampon d’imagerie. S’attendre à un échantillon de « verticale », « horizontale » et « losanges » fibres discontinues de polyesters, représentant fluorophores par en dessous, au-dessus et dans le plan focal, respectivement (Figure 5). Si la plupart des taches afficher SP vertical ou horizontal, puis le plan focal est éteint depuis le Centre des cellules, donc mettre fin à l’expérience et ajustez de nouveau le plan focal. Une présence de bulle d’air dans l’huile d’immersion ou d’autres facteurs les peut affecter la qualité de la filature, alors il peut être nécessaire de remplacer l’huile ou changer vers une autre zone d’imagerie de l’échantillon.
6. Pour l’analyse des données, utiliser open source (dans plugins ImageJ NIH) ou codes disponibles dans le commerce pour détecter le centre de gravité de chaque endroit dans chaque cadre d’imagerie et extrait les valeurs z de chaque spot de largeurs x - et y¹⁴.
   Remarque : Dans le présent rapport, un code source développé à l’origine dans l’une des plus ancienne molécule unique axée sur la détection SR⁸ a été modifié pour détection 3D¹⁶ et a été utilisé.
7. Dans le cas de l’imagerie de deux couleurs, image le fluorophore avec la longueur d’onde excitation plus longtemps, suivi par celui qui a la plus courte longueur d’onde d’excitation. Exécutez le code d’acquisition automatique de même que celle décrite à l’étape 5.4, mais avec un laser différent d’imagerie.
   NOTE : il convient de corriger l’aberration chromatique entre les images avec des fluorophores différents (p. ex., colorant rouge et jaune-vert colorant). Voici les étapes.
   1. Immobiliser plusieurs perles multicanaux de 100 nm sur la lamelle de verre, en évitant de former des grappes.
   2. Prendre des photos d’eux dans les canaux différents d’excitation.
   3. Extrait de leur (X, Y, Z) coordonne par logiciel (point 5.6).
   4. ΔX_j’ai tracer = X_1i - X_2i et ΔY_i = Y_1i - Y_2i (j’ai est pour différentes perles et 1 et 2 sont des canaux de couleur différente) séparément et fixez-les avec des fonctions appropriées. Enregistrer les fonctions.
      Remarque : Les fonctions linéaires sont suffisantes dans la plupart des cas. Une fois ces fonctions déterminées, cette mesure n’a pas à être répété chaque fois que de l’imagerie.
   5. Dans l’imagerie réelle de SR de deux couleurs d’un échantillon d’intérêt, appliquer les fonctions de l’aberration chromatique correcte (X, Y). Pour z-directional l’aberration chromatique, le conduisent en obtenant ΔZ = Z₁ - Z₂ perles multicanaux ou échantillons multicanaux de référence connue ensemencées avec l’échantillon.
      Remarque : contrairement à (X, Y) l’aberration chromatique, aberration chromatique z directionnel n’est pas bien reproductibles dans chaque expérience, principalement en raison de l’entretien incomplètes z-directional focus lors du passage du canal. Ainsi, il est recommandé d’effectuer la correction chaque fois. ΔZ = Z₁ - Z₂ est le plus souvent indépendante de (X, Y), donc juste quelques perles ou échantillons de référence serait suffisants par chaque zone d’intérêt. Tracer les images construites du SR bicolore finales dans un logiciel de visualisation 3D et vérifier manuellement les ΔZ.

Results

Ce microscope permet flexible et reproductible de commutation entre les différentes méthodes d’imagerie. Nous montrons ici des exemples d’images collectées avec chaque module d’imagerie.

Figure 5 illustre la PSF de la molécule de clignotant sur lors de l’acquisition de SR. Des milliers de telles images sont reconstruits pour générer l’image finale de SR (Figure 5E).

Discussion

Ce système de microscope hybride élimine le besoin d’acheter plusieurs microscopes. Le coût total de toutes les parties, y compris la table optique, table installation travail, logiciel et poste de travail, est environ $ 230 000. Les pièces usinées avec personnalisé, y compris l’objectif mag et l’objectif 3D, coûtent environ 700 $ (le coût dépend des montants réels exigés dans les différents instituts). Typique disponible dans le commerce des systèmes intégrés pour la microscopie seule molécule de SR axée sur la détectio...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Support de microscope Nikon Ti-E	Nikon	Ti-E
Nikon		100X NA 1.49 CFI HP TIRF
Logiciel d’imagerie de microscopie	Nikon	NIS-Elements Advanced Research/HC	HC comprend le module « JOBS », le module d’acquisition programmé utilisé pour l’imagerie SR.
Le bras d’éclairage	Nikon	Ti-TIRF-EM Unité d’éclairage motorisé M	Ce bras dispose d’une fente pour une lentille de grossissement
Bloc d’analyse	Nikon	Ti-A Celui-ci	est installé dans la tourelle du filtre.
Système de correction de la dérive en Z	Nikon	PFS	Ce système est composé d’un moteur pas à pas sur la tourelle porte-objectifs d’un objectif, d’une LED IR et d’un détecteur.
Plateau de table optique	TMC	783-655-02R
Bases de table optiques	TMC	14-426-35
647 nm laser	Cobolt	90346 (0647-06-01-0120-100)	Diode laser modulée 647nm 120mW avec tête laser, boîtier de commande CDRH, câble USB et bloc d’alimentation (bloc d’alimentation)
Laser 561 nm Cohérent		1280721	OBIS 561nm LS 150mW Système laser
488 nm	Cobolt	90308 (0488-06-01-0060-100)	Diode laser modulée 488nm 60mW avec tête laser, boîtier de commande CDRH, câble USB et bloc d’alimentation (bloc d’alimentation)
Cristalliseur	laser 405 nm	DL405-025-O	405 (+/-5)nm, 25mW, Circulaire , M2 < 1.3, Low Noise, CW, TTL jusqu’à 20MHz. 2 connecteurs BNC pour TTL & Dissipateur
thermique	Cobolt	11658 (HS-03)	Deux unités, Dissipateur thermique sans ventilateur HS-03, Dissipateur thermique pour lasers 647 nm et 488 nm
Dissipateur thermique	Cohérent	1193289	Dissipateur thermique Obis avec ventilateur, 165 x 50 x 50 mm pour le laser 561 nm
CAB-USB-miniUSB	Cobolt	10908	Deux unités, câble de communication pour lasers 647 nm et 488 nm
Aluminium pour le réglage en hauteur	McMaster-Carr	9146T35	Aluminium 6061 polyvalent, barre rectangulaire, 4 MM x 40 mm, 1 pi de long pour le levage Aluminium laser 561 nm
pour le réglage de la hauteur	McMaster-Carr	8975K248	Aluminium 6061 polyvalent, 1-1/4" d’épaisseur x 3 po de largeur x 1 pi Longueur pour le levage du câble BNC laser 405 nm
	L-com	CC58C-6	RG58C Câble coaxial, BNC mâle / mâle,
adaptateur BNC	L-com	BA1087	Adaptateur coaxial, cloison BNC,
adaptateur SMA vers BNC mis à	HOD	SMA-870	Cobolt MLD ont une interface SMA, cet adaptateur est donc utilisé pour la connexion BNC.
Adaptateur SMB vers BNC	Fairview Micro-ondes	FMC1638316-12	SMB Plug vers BNC Câble de cloison femelle RG316 Coaxial en 12 pouces pour lasers Obis cohérents
Carte d’acquisition de données	National Instruments	PCI-6723	13 bits, 32 canaux, 800 kéch./s Périphérique de sortie analogique pour le contrôle des lasers, LED DIC, etc
Contrôleur de roue à filtres barrière	Sutter Instrument	Lambda 10-B	Changeur
de filtre optiqueSéparateur d’émission	Cairn	OptoSplit III
Séparateur de faisceau dichroïque	Chroma	T640LPXR-UF2	Séparateur de faisceau dichroïque séparant l’émission rouge de l’émission verte dans OptoSplit III
Séparateur de faisceau dichroïque	Chroma	T565LPXR-UF2	Séparateur de faisceau dichroïque séparant l’émission verte et rouge de l’émission bleue dans OptoSplit III
Filtre d’émission	Chroma	ET700/75M	Deux unités, Filtre d’émission pour l’émission rouge (comme Alexa Fluor 647) dans OptoSplit III ainsi que dans la roue à filtres barrière
Filtre d’émission	Chroma	ET595/50M	Deux unités, Filtre d’émission pour l’émission jaune/vert (comme Cy3B) dans OptoSplit III ainsi que dans la roue à filtres barrière
Filtre d’émission	Chroma	ET525/50M	Deux unités, Filtre d’émission pour l’émission de bleu (comme Alexa Fluor 488/GFP) dans OptoSplit III ainsi que dans la roue à filtres barrière
Filtre d’émission	Semrock	FF02-447/60-25	Filtre d’émission pour émission violette (comme DAPI/Alexa Fluor 405), installé dans la roue à filtres
barrière Séparateur de faisceau dichroïque	Chroma	zt405/488/561/647/752rpc-UF3	Séparateur de faisceau dichroïque multibande pour excitations laser 647, 561, 488 et 405 nm à l’intérieur du corps du microscope
Jeu de filtres DAPI	installé		dans le corps du microscope
laser/TIRF Nikon	Chroma	91032
590 Filtre passe-long	Chroma	T590LPXR-UF1	pour combiner un laser 647 nm et un laser 561 nm
Filtre passe-long 525	Chroma	T525LPXR-UF1	pour combiner des lasers 647 nm et 561 nm déjà combinés avec un laser 488 nm
Filtre passe-long 470	Chroma	T470LPXR-UF1	pour combiner des lasers 647 nm, 561 nm et 488 nm déjà combinés avec un laser 405 nm
Filtre de nettoyage laser (647)	Chroma	zet640/20x	pour nettoyer les autres longueurs d’onde du laser 647 nm
Filtre de nettoyage laser (488)	Semrock	LL01-488-25	pour nettoyer d’autres longueurs d’onde de la source lumineuse laser LED 488 nm
	Excelitas	X-Cite120LED	utilisée uniquement pour l’imagerie DAPI
Monture miroir	Newport	SU100-F3K
Poteaux optiques	Newport	PS-2
Fourche de serrage	Newport	PS-F
Power Meter	Newport	PMKIT	Pour la mesure de la puissance laser
Monture de combinateur de faisceaux dichroïques	Edmund Optics	58-872	Monture cinématique à monture C, pour maintenir les combinateurs de faisceaux dichroïques dans l’ensemble d’excitation laser
Bague de retenue	Thorlabs	CMRR	utilisée pour les montures de combinateur de faisceaux dichroïques
Plaque d’adaptation de fibre	Thorlabs	SM1FC	FC/PC Plaque d’adaptation de fibre avec SM1 externe (1.035"-40)
Monture translationnelle de l’axe Z	Monture de translation de l’axe Z Thorlabs	SM1Z	compatible avec la cage de 30 mm
	Thorlabs	AC050-008-A-ML	Ø ; 5 mm, doublets achromatiques montés, revêtement AR : plaque de cage 400 - 700 nm
	Thorlabs	CP1TM09	plaque de cage de 30 mm avec filetages internes M9 x 0,5, tige d’assemblage de cage de taraudage 8-32
Tige	d’assemblage de cage Thorlabs	ER4	, 4" de long, et Oslash ;
Support de montage de cage	Thorlabs	CP02B	Support de montage de cage de 30 mm
Fibre optique monomode	Thorlabs	P5-405BPM-FC-2	Câble de raccordement, PM, FC/PC vers FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m
Fibre optique multimode	Thorlabs	M42L01	Ø ; 50 et micro ; m, 0,22 NA, câble de raccordement à fibre optique FC/PC-FC-PC, 1 m
Lentille doublet achromatique (lentille magnétique)	Thorlabs	ACN127-025-A	ACN127-025-A - f=-25,0 mm, & Oslash ; Doublet achromatique 1/2 », ARC : 400-700 nm, une lentille concave dans la « lentille mag"
Lentille doublette achromatique (lentille magnétique)	Thorlabs	AC127-050-A	f=50,0 mm, & Oslash ; Doublet achromatique 1/2 », ARC : 400-700 nm, une lentille convexe dans la « lentille mag"
Bague de retenue	Thorlabs	SM05PRR	SM05 Bague de retenue en plastique pour & Oslash ; Tubes et montures d’objectif 1/2 », pour « objectif mag
"Vis à embout nylon	Thorlabs	SS3MN6	M3 x 0,5 Vis de réglage à pointe de nylon, 6 mm de long, pour maintenir « objectif 3D"Objectif 3DObjectif
3D	CVI Laser Optics	RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700	f=10 m, lentille cylindrique rectangulaire
Caméra EMCCD	Andor	iXon Ultra 888
100 nm billes multicanaux	Thermo	T7279, microsphères
colorant rouge	Thermo	Alexa Fluor 647
colorant jaune-vert	GE Healthcare	Cy3
colorant vert	GE Healthcare	Cy3B
colorant bleu	Thermo	Alexa Fluor 488