Article de méthode

Un dosage anaérobie biocapteurs pour la détection du mercure et du Cadmium

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DOI :

10.3791/58324

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17 décembre 2018

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1Department of Biology, University of Ottawa

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour utiliser un biocapteur microbiens anaérobie de cellules entières pour évaluer comment les différentes variables environnementales affectent la biodisponibilité du Hg et Cd de bactéries en milieu anoxique.

Résumé

Biodisponibilité de mercure (Hg) aux microbes est une étape clé pour toxiques Hg bioamplification dans les réseaux trophiques. Les transformations de cadmium (Cd) et de la biodisponibilité de bactéries contrôlent la quantité qui s’accumulent dans les cultures vivrières de base. La biodisponibilité de ces métaux est tributaire de leur spéciation en solution, mais plus particulièrement dans des conditions anoxiques où Hg est méthylé de monomethylmercury toxique (MeHg) et Cd persiste dans la rhizosphère. Cellule entière biocapteurs microbiens donnent un signal quantifiable quand un métal entre le cytosol et est donc des outils utiles pour évaluer la biodisponibilité des métaux. Malheureusement, la plupart des efforts de biodétection ont jusqu'à présent été limités aux environnements oxiques due à la capacité limitée des protéines existantes de reporter à la fonction en l’absence d’oxygène. Dans cette étude, nous présentons nos efforts visant à développer et optimiser un dosage de biocapteur cellule entière capable de fonctionner en anaérobiose qui peut détecter des métaux dans des conditions anoxiques en temps quasi réel et quelques heures. Les auteurs décrivent comment le biocapteur peut aider à évaluer comment chimiques variables pertinentes pour les cycles environnementaux de métaux affecte leur biodisponibilité. Le protocole suivant inclut des méthodes pour (1) préparer les Hg et normes Cd dans des conditions anoxiques, (2) préparent le biocapteur en l’absence d’oxygène, (3) conception et exécutent une expérience pour déterminer comment une série de variable affecte la biodisponibilité Hg ou Cd et (4) pour quantifier et interpréter les données du biocapteur. Nous montrent les chaînes linéaires des biocapteurs et fournissent des exemples montrant la capacité de la méthode de distinguer entre la toxicité et la biodisponibilité des métaux en utilisant des souches fois métal-inductible et constitutives.

Introduction

Mercure (Hg) est un polluant global et sa biodisponibilité en Hg microbes de méthylation est le premier pas vers sa bioamplification dans les réseaux trophiques et ses possibles effets neurotoxiques chez les humains et la faune1. On pense actuellement que la méthylation Hg microbienne est un processus intracellulaire qui exige : i) les espèces de Hg à être biodisponibles2,3,4,5,6,7 et ii) pour la cellule physiologiquement capable de méthylation Hg8,9,10. Cadmium (Cd) s’accumule dans les organismes, mais fait pas la bioamplification dans les réseaux trophiques et est largement utilisé dans les processus industriels et commerciaux qui causent fréquemment des expositions aiguës dans les gens et l' environnement11. Bien que les microbes jouent plusieurs rôles clés dans le devenir du mercure dans l’environnement, la plupart des études sur la géochimie des Cd et écotoxicologie concentrent aux eucaryotes microbiens12. La consommation de produits agricoles (p. ex., riz) est la principale source d’exposition directe au cadmium ; dans ce cas, la biodisponibilité du Cd aux microbes de la rhizosphère influence directement le montant plantes peuvent s’accumuler13.

Les voies de transport Hg sont complexes et impliquent probablement un transport actif étape14. Lorsqu’un transporteur est impliqué, des travaux récents suggèrent que HgII utilise un ZnII ou MnII transporteur7,15,16,17. Alors que l’hypothèse CdII pour être transportés accidentellement dans le cytosol, par des voies de transport métal divalent (particulièrement MnII ou ZnII), mécanismes de CdII de transport intérieur, les cellules demeurent sentier de transport spéculative et Cd spécifique n’a été identifié13,18. Quelle que soit la nature des transporteurs concernés, trois facteurs mécanistes finalement déterminent la capacité des métaux à pénétrer dans une cellule : i) la spéciation des métaux dans la solution2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) les propriétés biophysiochemical de la membrane cellulaire17,24,25,26,27,28,29 ,30,31et iii) la capacité pour le métal accéder à un transport site7,32. Cadmium et le mercure sont peu susceptibles d’existe sous forme d’ions libres dans des conditions physiologiquement pertinentes microbiennes en raison de leur forte affinité pour dissous Organic Matter (DOM), chélation des contaminants (p. ex., EDTA), ou réduit soufre moitiés33, 34,35 (CdII peut exister comme un libre ion ou formulaire de paires d’ions en l’absence de ces ligands). Il y a un manque de méthodes efficaces pour déterminer comment ces espèces métalliques sont biodisponibles dans les conditions pertinentes à leur sort dans l’environnement. Par exemple, Hg est méthylée en vertu des conditions d’anaérobiose14et cadmium et le mercure sont des métaux mous (ou classe B cations), exigeant que leur spéciation fassent dans des conditions qui préservent l’intégrité des groupes du soufre réduit.

Les biocapteurs microbiens sont des cellules bactériennes qui émettent un signal quantifiable en réponse aux concentrations intracellulaires d’un métal, dans ce cas Hg ou un Cd. À ce titre, ils sont les outils idéaux pour comprendre comment les métaux dans une cellule36, sous réserve que les conditions d’exposition sont soigneusement contrôlées pour. Biocapteurs Hg contiennent généralement des fusions de gènes entre les circuits réglementaires du mer-opéron (y compris gènes codant pour le régulateur de la transcription Mathieu, ainsi que l’opérateur et le promoteur, régions de l’opéron) et la déclaration des gènes (par exemple, Lux, gfp, lac gènes). Lorsque le mercure est présent dans le cytoplasme, elle se liera à MerR, résultant dans la transcription des gènes considérées et ultérieures signal production19,37. Biocapteurs de Cd spécifiques sont généralement conçues à l’aide de la cadC, cadAC, zntA ou zntR codé de régulateurs de transcription38, mais il est à noter que MerR a une affinité plus faible, et pourtant quantifiable à Cd5. En raison de la restriction aérobie de la plupart couramment protéines journaliste luminescents ou fluo, jusqu'à ce que les biocapteurs microbiens récemment resta incapables d’offrir des aperçus de la biotransformation des métaux dans des conditions anoxiques. Cela rend détection anaérobie de la biodisponibilité des métaux très difficile sur une gamme des conditions pertinentes à leur devenir dans l’environnement, spécifiquement en présence d’oxydo-réduction des ligands sensibles (p. ex., sulfure et thiols)4, 5 , 39.

Pour atténuer l’obstacle méthodologique de vivre d’imagerie en l’absence d’oxygène, Drepper et al. (2007) ont mis au point une protéine fluorescente axée sur la flavine (FbFp), basé sur le domaine de tension légère oxygène de protéine SB2 de P. putida. Cette famille de protéines est en mesure de fluorescence en l’absence d’oxygène40. S’appuyant sur les travaux de Drepper et al., notre laboratoire a conçu un biocapteur anaérobique permettant l’étude de la biodisponibilité de l’Hg dans des conditions oxiques et anoxiques et sur une large gamme de salinité 17. Dans le présent document, nous décrivons comment préparer et utiliser le biocapteur de tester l’influence des variables environnementales sur la biodisponibilité de Hg ou Cd. Bien que nous avons développé le biocapteur pour HgII, nous avons choisi de réaliser des expériences avec CdII comme un moyen d’attirer l’attention du lecteur sur le fait que biocapteurs peuvent également répondre à des stresseurs multiples qui sont susceptibles de survenir conjointement dans l’environnement matrices ; dans ce cas le CdII a été étudiée car il est connu pour lier à l’autorité de régulation transcriptionnelle MerR5. Ici, nous montrons étalonnage représentative et fonctionnelle linéaire varie en ce qui concerne l’autre métal. Nous donnons aussi un exemple lorsque résultats du biocapteur est concluants (MgII et MnII sur la biodisponibilité de Hg) et non concluant (ZnII sur la biodisponibilité de Hg).

Protocole

1. croissance Media et préparation de l’exposition médiatique

  1. Pour faire 250 mL de milieu de croissance:
    Remarque : Si la solution d’oligo-éléments #1 et oligo-éléments #2 sont déjà préparées, passez à l’étape 1.1.5.
    1. Préparer les oligo-éléments #1 solution dans une fiole jaugée propre (200 mL) pour contenir les molarités finales de 1.5 x 10-3 M Na2MoO4, 6.5 x 10-4 M Na2SeO4, 5 x 10-3 M H3BO 3et NaOH 0,1 M.
      Attention : Les bases fortes (NaOH) sont corrosifs. Faire bien sûr quelle pesant les réactifs pour s’assurer que la molarité finale représente les principaux oligo-éléments ; Mo, Se et B.
    2. Sous un champ stérile, filtre stériliser à l’aide d’un filtre de seringue 0,22 µm polyéthersulfone dans une bouteille en plastique stérile/nettoyer/polytétrafluoroéthylène (PTFE).
    3. Préparer la solution d’oligo-éléments #2 dans une fiole jaugée propre (200 mL) pour contenir les molarités finales de 0,01 M MnSO4, 5 x 10-4 M ZnSO4, 3.25 x 10-3 M CoCl2, 6,25 x 10-3 M NiCl 2et 0,1 M H2SO4.
      Attention : Les acides forts (H2SO4) sont corrosifs. Faire bien sûr quelle pesant les réactifs pour s’assurer que la molarité finale représente les principaux oligo-éléments ; Mn, Zn, Co et Ni.
    4. Sous un champ stérile, filtre stériliser à l’aide d’un filtre de seringue 0,22 µm polyéthersulfone dans une bouteille en verre propre.
    5. Sous un champ stérile, dans une bouteille en verre propre ou stérile (minimum 250 mL) ; ajouter 200 mL d’eau ultrapure, 42,5 mL de sels minime de M9 (x 5, voir Table des matières), 2,5 mL de 2 M de Glucose, 125 µL de 2 M MgSO4, 1200 µL de 0,6 M Thiamine HCl d’une partie aliquote de congelés (-20 ° c), 1,25 mL de NaNO de 4 M3 , 770 µL de L-leucine de 0,075 M / L-isoleucine / solution de valine, 250 µL oligo-éléments #1, 250 µL d’oligoélément #2et 250 µL de sodium EDTA 0,01 M de sel.
      Remarque : Tous les réactifs à l’étape 1.1.5 doivent être préparés avant et filtre stérilisé à l’aide d’un filtre de seringue de polyethersulfone de 0,22 µm. Eau ultrapure peut être stérilisé à l’aide d’un autoclave.
    6. Prendre la bouteille en verre contenant maintenant la solution de l’étape 1.1.5., vaguement couronner et il faire défiler la poche d’air chambre anaérobie .
    7. Dans la chambre anaérobie, ajoutez 15 µL de 0,225 M FeSO4 à 0,2 M H2donc4, bouchon de bouteille hermétiquement et agiter jusqu'à ce que tous les précipités blanches disparaissent.
      Remarque : Tous les réactifs à l’étape 1.1.7 doivent être préparés avant et filtre stérilisé à l’aide d’un filtre de seringue de polyethersulfone de 0,22 µm. Stocker 0,225 M FeSO4 à 0,2 M H2SO4 dans la chambre anaérobie.
    8. Enlevez le bouchon du flacon, attendez une minute pour l’air d’échanger, de remettre le bouchon de la bouteille et puis agiter vigoureusement. Répétez cette opération une fois.
    9. Fixer le cap fermement sur la bouteille, retirer de chambre anaérobieet conservez le flacon au réfrigérateur (4 ° c) jusqu'à utilisation.
    10. Milieu de culture doit être refait une fois par semaine en répétant les étapes 1.1.5 à 1.1.9.
  2. Pour faire 100 mL du milieu de l’exposition dans 2 x 50 mL, tubes à centrifuger coniques de polypropylène stérile :
    Remarque : Nous recommandons ce moyen d’exposition être préparé le jour de l' analyse de l’exposition afin de minimiser le risque de contamination, mais elle peut être faite à l’avance et conserver au réfrigérateur.
    1. Dans la chambre anaérobie, à chaque 50 mL tube à centrifuger ajoutez 42 mL d’eau ultrapure anaérobie, 350 µL de 1 M Sodium Beta-Gylcerophosphate d’une partie aliquote de congelés (-20 ° c), 2 mL de 1 M VADROUILLES acide, 50 μL de 1 M (NH4)2libre donc4 , 125 μL de Glucose de 2 M, 300 μL de 2,5 M KOH et 200 μl de 2,5 M de NaOH.
      Remarque : Tous les réactifs à l’étape 1.2.1 doivent être préparés avant et filtre stérilisé à l’aide d’un filtre de seringue de polyethersulfone de 0,22 µm. Eau ultrapure peut être stérilisé par autoclave de chaleur. 2,5 NaOH de M et 2,5 M NaOH doivent être stockés dans des bouteilles en plastique/PTFE. Tous les réactifs cités doivent être stockés dans la chambre anaérobie sauf Sodium bêta-Gylcerophosphate, qui doit être conservé dans un congélateur (-20 ° c). En général, il est conseillé de laisser toutes les pièces en plastique ou en verre et les conteneurs pendant plusieurs jours dans la chambre anaérobie afin de n’assurer qu’aucune trace d’oxygène.
    2. Boucher les tubes de centrifugeuse 50 mL, bien agiter et supprimer une portion de 10 mL pour mesurer le pH. Le pH mesuré de ce média de l’exposition doit toujours mesurer 7,00 ± 0,02 à 25 ˚C. Si le pH ne se mesure pas dans cet intervalle, réajuster le volume ajouté 2,5 m KOH pour corriger cela.
      Remarque : Ne jamais titrer la solution pour corriger le pH avec une sonde de pH. sondes pH représentent une source de contamination pour le milieu de l’exposition. Le pH doit toujours être un produit des réactifs ajoutés à l’étape 1.2.1.
  3. Préparer une solution 5-10 mM NaNO3 et laisser dans la chambre anaérobie à utiliser pendant le temps de l' analyse de l’exposition.
    Remarque : Il est plus facile à diluer un plus concentrée NaNO3 étalon primaire plutôt que de faire un 5-10 mM NaNO3 étalon primaire.

2. Elaboration de normes de Cadmium et de mercure.

  1. Préparer une solution de mercure (HgII) 4-8 µM à 0,2 M H2SO4.
    1. Préparer un Hg2 + étalon en faisant un millimolaire (1 à 10 mM) HgCl2, HgNO3 ou une HgSO4 solution à 0,2 M H2SO4.
      Attention : Le mercure est très toxique et H2SO4 corrosif. Exploitée dans des hottes avec tous les équipements de protection individuelle.
    2. Dans une bouteille PTFE, diluer standard 2.1.1. dans 0,2 M H2SO4 pour obtenir une concentration dans la fourchette de 4 à 8 µM Hg2 +.
      Remarque : L’acide utilisé doit être de qualité analytique H2donc4.
    3. La concentration de Hg de 2.1.2 doit être validée à l’aide d’un analyseur de mercure (voir Table des matières).
      Remarque : Autres méthodes de validation de la concentration de mercure peuvent être utilisées.
  2. Préparation d’un Cd de 10 µMII solution dans 10 mM H2SO4.
    1. Préparer un étalon primaire de CdCl2 (plage de 10 à 50 mM pour un pesage précis de poudre) à 0,1 M H2SO4.
    2. Dans une série de dilutions en série dans propre acide rincé 20 mL flacons en verre borosilicate avec bouchons à vis phénoliques noires avec PTFE face revêtements en caoutchouc, diluer la norme de 2.2.1 à 10 µM Cd2 +. S’assurer que la concentration de H2donc4 dans chaque dilution en série ultérieure reste 10 mM.

3. préparation du biocapteur pour l’analyse de l’exposition anaérobie

  1. Plaque le biocapteur inductible de mercure (E. coli NEB5α qui PUC57merR-PpFbFp) et le biocapteur constitutivement exprimé (E. coli NEB5α qui PUC19Balch-PpFbFp) de-80 ° c cryostock sur des plaques de Lysogénie bouillon contenant 120 ampicilline ug/mL. Voir nos travaux déjà publié pour plus de détails sur la production de ces biocapteurs17.
  2. À 04:30-17:00, ensemencer une culture dans 10 mL de LB (+ ampli) et pousser du jour au lendemain.
    Remarque : À partir d’une plaque, il faut 2 jours pour préparer la culture anaérobie pour le dosage de l’exposition (c'est-à-dire, une culture a commencé lundi après-midi (04:30-17:00) sera prêt pour test d’exposition à vers midi le mercredi). Les étapes suivantes sont les techniques microbiologiques requis nécessaires à la préparation des cultures sur le jour de l' analyse de l’exposition.
    1. Prenez une colonie sur la culture de la plaque et ajouter à 10 mL de bouillon de Lysogénie (LB) avec 21 µL d’une solution mère de 100 mg/mL de sel de sodium d’ampicilline (concentration finale est de 210 amp ug/mL) dans un tube à culture stérile.
    2. Placer la culture dans un incubateur/agitateur et croître durant la nuit à + 37 ° c sous agitation à 220 tr/mn.
  3. Le lendemain matin à 9-10, remettre en suspension de la culture et de grandir en anaérobiose tout au long de la journée (inoculum de 20 %).
    1. Apporter la culture de l’incubateur (étape 3.2.1) et le milieu de culture (étape 1.1.9) dans la chambre anaérobie.
    2. Ajoutez 8 mL de frais milieu de croissance et à l’ampicilline (210 μg/mL) dans un tube stérile de Balch.
    3. Prélever 2 mL de la culture cultivée pendant la nuit et le transfert dans un tube de Microcentrifuge de 2 mL. Centrifuger à 10 000 pas RCF pendant 90 secondes, jeter le surnageant et remettre en suspension dans 2 mL d’un milieu de croissancefrais. Ajouter la culture resuspendue dans le tube de Balch contenant 8 mL d’un milieu de croissance frais et à l’ampicilline.
    4. Utilisant une technique stérile, délicatement poser un bouchon en caoutchouc sur le tube de Balch. Retirer de la chambre anaérobie et placer dans un incubateur/agitateur et croître en anaérobiose jusqu'à 3-17:00 à + 37 ° c sous agitation à 220 tr/mn.
  4. Entre 3 et 17:00, effectuer un inoculum anaérobie de 1 % dans un milieu de croissance frais et se développer pendant la nuit.
    1. Mettre le tube Balch (étape 3.3.4) dans la chambre anaérobie ainsi que du milieu de croissance. Ajouter 100 µL de la culture à 10 mL de frais milieu de croissance (1 % inoculum) avec ampli (ampli de 210 ug/mL) dans un tube stérile de Balch.
    2. Utilisant une technique stérile, délicatement poser un bouchon en caoutchouc sur le tube de Balch. Retirer de la chambre anaérobie, placer dans un incubateur/agitateur et croître durant la nuit à + 37 ° c sous agitation à 220 tr/mn.
  5. Entre le 9 et 10:00, remettre la culture de croître en anaérobiose tout au long de la journée (inoculum de 20 %).
    1. Apporter la culture de l’incubateur (étape 3.4.1) et le milieu de culture (étape 1.1.9) dans la chambre anaérobie.
    2. Ajoutez 8 mL de milieu de croissance et à l’ampicilline (210 amp d’ug/mL) dans un tube stérile de Balch.
    3. Recueillir 2 m de la culture cultivée pendant la nuit et le transfert dans un tube de Microcentrifuge de 2 mL. Centrifuger à 10 000 x g pendant 90 secondes, jeter le surnageant et resuspendre dans 2 mL de frais milieu de croissance. Ajouter la culture resuspendue dans le tube de Balch contenant 8 mL d’un milieu de croissance frais et à l’ampicilline.
    4. Utilisant une technique stérile, délicatement poser un bouchon en caoutchouc sur le tube de Balch. Retirer de l’alvéole et placer dans un incubateur/agitateur et croître en anaérobiose à + 37 ° c sous agitation à 220 tr/min.
  6. Surveiller la croissance de la culture à l’aide d’un spectrophotomètre (étape 3.5.4) jusqu'à atteindre une OD600 de 0,6 . N’oubliez pas de culture de vortex avant chaque OD lecture.
    Remarque : Cette étape prend 3-4 heures, et le milieu de l’exposition (étape 1.2) doit être préparé au cours de cette période ainsi que dosage de l’exposition (étape 4.1).
  7. Arrêter la croissance lorsque la culture atteint une OD600 de 0,6 (±0, 1) (croissance de 3-4 heures prévus).
    1. Mettre le tube dans la chambre anaérobie (étape 3.6) et la culture de transfert en tubes de Microcentrifuge de 2 x 2 mL . Centrifuger à 10 000 x g pendant 90 secondes, dump surnageant et remettre en suspension en 2 x 2 mL de frais moyen d’exposition.
    2. Répétez l’étape lavage 3.7.1. fois pour éliminer toute trace du milieu de croissance.
  8. Combiner les deux tubes de microcentrifuge de culture cellulaire (étape 3,7) dans un flacon standard de PTFE de 7 mL pour obtenir le Stock de biocapteur à utiliser dans l' Analyse de l’exposition (étape 4).
    Remarque : N’oubliez pas de mélanger le Biocapteur Stock par soigneusement mais délicatement pipetage en arrière avant l’utilisation. La méthode peut être suspendue ici pour jusqu'à une heure.

4. l’exposition Assay

  1. La conception d’un schéma.
    Remarque : Assurez-vous d’avoir tout pipetage valeurs calculées et les stocks préparés avant de commencer le essai exposition. Comment correctement design expérimental et les contrôles à inclure est détaillé dans le texte. En outre, l’expérience ne devrait pas démarrer si il y a d’oxygène dans la chambre anaérobie indiquée sur le moniteur anaérobie.
    1. Concevoir le schéma selon un modèle de 96 puits. Pour exécuter des expériences dans des répétitions techniques de 3, cela permettra à 32 différents traitements, qui est le mieux représenté par une grille de 4 x 8 de mettre en place les flacons (voir Figure 1).

figure-protocol-1
Figure 1 : un 96 plaque bien (gauche) et une grille de 4 x 8 correspondante contenant du PTFE flacons (à droite) pour les transférer vers la plaque. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Remarque : Lorsque essais pour le rôle d’une variable sur l’absorption du Hg avec les biocapteur inductible mercure ; deux traitements sont requises pour chaque variable : le traitement (biocapteur + Hg + variable + nitrate) et son traitement vide (biocapteur + variable + nitrate). Lors de l’essai pour le rôle d’une variable sur la physiologie de la cellule en utilisant le biocapteur constitutive, deux traitements sont nécessaires pour chaque variable : le traitement (biocapteur + Hg + variable + nitrate) et le ( vide ) traitement biocapteur + variable + Hg). Mercure peut être remplacé par du Cadmium. HG ou Cd deviendra la variable lorsque vous effectuez une courbe d’étalonnage. Le constitutive et inductible biocapteurs n’ont pas besoin d’être exécuté en même temps (dans le même schéma). Un exemple de modèle pour la présentation de la plaque et grille de 4 x 8 correspondante lorsque vous testez une gamme de concentrations de magnésium (variable) est fourni dans le tableau 1).

123456789101112
unHG induite par biocapteur + Hg + Nitrate mM 0 MgHG induite par biocapteur + nitrates + 0 mM MgBiocapteur constitutive + Hg + Nitrate mM 0 MgBiocapteur constitutive + Hg + 0 mM Mg
bHG induite par biocapteur + Hg + nitrates + 0,1 mM MgHG induite par biocapteur + nitrates + 0,1 mM MgBiocapteur constitutive + Hg + nitrates + 0,1 mM MgBiocapteur constitutive + Hg + 0,1 mM Mg
cHG induite par biocapteur + Hg + Nitrate 1 mM MgHG induite par biocapteur + nitrates + 1 mM MgBiocapteur constitutive + Hg + Nitrate 1 mM MgBiocapteur constitutive + Hg + 1 mM Mg
dHG induite par biocapteur + Hg + Nitrate mM 10 MgHG induite par biocapteur + nitrates + 10 mM MgBiocapteur constitutive + Hg + Nitrate mM 10 MgBiocapteur constitutive + Hg + 10 mM Mg
e

Tableau 1 : Un exemple schéma d’utilisation le biocapteur pour tester la biodisponibilité de Hg (5 nM) sur une pente de magnésium (0-10 mM)

  1. Mettre en place la grille de 4 x 8 selon le schéma test.
    1. Place 7 flacons standards mL PTFE dans la barre d’état.
      Remarque : PTFE flacons doivent être acid washed/chaleur stérilisé avant usage. Flacons doivent uniquement être manipulés en manipulant l’extérieur de la cuvette.
    2. Dans chaque flacon, ajouter le volume moyen d’exposition correspondant à chaque traitement.
      Note : Une exposition avec un volume total de 2 000 µL (2 mL), ajouté moyen d’exposition sera : µL de milieu d’exposition = 2 000 µL – traitement (vide) µL. (p. ex., l’exposition moyenne µL = 2 000 – 100 µL (biocapteur) – 40 µL (nitrate) – 100 µL (Hg )-100 µL (variable (par exemple, MgSO4)) = 1660 µL). N’oubliez pas que le volume ajouté de la variable testée ne dépasse pas 5 % (100 µL) du volume final.
    3. Dans chaque flacon, ajouter le volume correspondant de la solution de la variable chimique à tester selon le schéma.
    4. De l’étape 1.3, ajouter le nitrate dans chaque flacon afin que la concentration finale est 200 µM (40-80 µL). Exclure cette étape pour flans traitement biocapteur constitutive.
    5. À l’étape 2.1 ou 2.2, ajouter Hg (5 nM lors du test d’une variable) ou Cd (300 nM lors du test d’une variable) pour les flacons, selon le schéma. Exclure cette étape pour les flans de traitement pour le biocapteur inductible mercure.
      1. Lorsque vous utilisez Hg, faire le point sur les 4-8 µM et secouez bien. Diluer la solution dans le milieu de l’exposition dans un flacon de 7 mL PTFE à 100-250 nM pour faire un travail solution Hg. De cette solution de travail ajouter Hg pour les flacons requis. Dans ce cas, une courbe d’étalonnage du Hg allant de 0 à 12,5 nM.
        Remarque : Lors du test d’effet de la variable sur la biodisponibilité de Hg ou Cd, assurez-vous que le [Hg] ou [Cd] reste constante à travers tous les traitements. Lors de l’ajout de Hg ou Cd, n’oubliez pas d’utiliser un embout de la pipette, mais ne jamais toucher le milieu de l’exposition dans les flacons.
  2. Agiter dans un mouvement orbital manuellement.
    Remarque : L’expérience peut être suspendue maintenant selon le temps requis pour Hg ou Cd speciate dans la solution. Si laissé pendant plus d’une heure, placer PTFE capuchons sur les flacons PTFE pour empêcher l’évaporation/contamination.
  3. Pipetez doucement Biocapteur Stock en arrière afin de garantir l’homogénéité. Ajouter 100 µL de Biocapteur Stock à chaque flacon. Secouez orbitalement manuellement.
  4. Préparer le lecteur à se réchauffer à lire avec les critères suivants : la température à 37˚C, cinétique fonctionner pendant 10 heures , avec des lectures toutes les 2,5 et 5 minutes avec agitation orbitale entre les deux lectures et des mesures de fluorescence avec une excitation de fluorescence de 440 nm et une des émissions de 500 nm.
  5. Pipeter 200 µL de chaque flacon PTFE dans la grille de 4 x 8 dans les puits correspondantes de la plaque 96 puits (Clear noir, 96 puits-bas Charte Surface microplaques). Pipetter en arrière 5 fois avant de transférer chaque 200 µL.
    Remarque : Au lieu de jeter l’embout de la pipette, laissant l’embout de la pipette dans le PTFE pour suivre les progrès de pipetage.
  6. Placer la plaque 96 puits dans le plateau du lecteur de plaque, puis placez le couvercle sur la plaque 96 puits et commencer le test.

5. quantifier les données

  1. La fluorescence de chaque traitement à chaque point dans le temps doit être corrigée pour chaque bruit bien individuel et masquée à la traitement vide.
    1. La fluorescence pour chaque point dans le temps (t) de chaque traitement (T) doit être traduite pour tenir compte de la fluorescence initiale (t0) de la première fois point de chaque puits, puis moyennée sur les 3 traitements réplique (r1- r3 ). Cette moyenne de traitement doit alors être occultée au moyen traitement vide (TB) traduit de la même manière (équation 1).

Fluorescence (t) = moyenne(Tr1()t) – Tr1()t0), Tr2()t) – Tr2 ()t0), Tr3()t) – Tr3()t0)) – moyen(TB R1 ()t) – TBr1()t0), TBr2()t)– TBr2( ) t0 ), TBr3()t) – TBr3()t0)) (1)

Remarque : Il doit être fait comme une fonction de feuille de calcul. Bonne propagation d’erreur devrait également être calculée pour chaque point dans le temps.

  1. Graphique la fluorescence corrigée de chaque traitement en fonction du temps

figure-protocol-2
Figure 2 : corrigé les données de fluorescence en fonction du temps. Fluorescence mesurée en unités de fluorescence relative (RFU) émises par e. coli NEB5α nourrissait du pUC57merR-Pp (souche inductible) au fil du temps avec l’ajout de HgII (0 à 12,5 nM) dans des conditions anaérobies. Fluorescence est que la moyenne des 3 techniques réplique à 37 ° c. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Remarque : Il n’a aucune valeur de Hg 0 nM sur le graphe, et toutes les autres concentrations de mercure ont été obturées à la 0 nM Hg comme traitement vide. Donc, 0 nM Hg représente l’axe des x et aucune fluorescence positive représente fluorescence du Hg donné n’importe quelle variable. Il est facultatif à ne blanc pas la fluorescence de cette manière, mais les courbes fluorescentes donnera des courbes de fluorescence trompeuse si la variable testée a fluorescence de fond (c'est-à-dire, la matière organique dissoute lui-même va fluorescer et si il n’y a aucune traitement vide contenant quelques cellules et la matière organique dissoute, augmentation de la concentration de la matière organique dissoute augmentera le signal fluorescent).

  1. Quantifier le pic de fluorescence. Un pic de fluorescence quantifiables interviendra généralement après 2,5 à 4 heures, ce qui représente l’énergie dépensée à la consommation de tout le nitrate 200 µM comme accepteur terminal d’électron. Ce sommet devrait être quantifié et représente la valeur finale de fluorescence de qu’un traitementspécifique.
    Remarque : dans le cas où aucun pic de fluorescence n’est observée (c.-à-d., aucun biodisponibilité de Hg), la fluorescence du traitement au point de temps de l’apogée de la fluorescence du contrôle (c'est-à-dire, aucune variable ajouté ou 5nM Hg) doivent être quantifiées. Sinon, si il y a induction de fluorescence dans le traitement, mais la fluorescence ne produit pas un pic bien défini, il y a contamination probable d’un accepteur d’électron affinité supérieur comme O2 et mesures devraient être prises pour éliminer les traces de oxygène de toutes les solutions et l’expérience doit être exécuté de nouveau.

Résultats

Une fois que les pics de fluorescence ont été quantifiés selon l’étape 5.3, le résultat des pics de fluorescence peut être représenté graphiquement selon la concentration variable qui illustrent comment cette variable affecte la biodisponibilité relative de Hg ou Cd. Par exemple, la courbe d’étalonnage de la fluorescence sur [HgII] Figure 2 permettra d’obtenir les données inductibles présentées dans la Figure 3 a. Pour HgII étalonnage, la volonté de courbe toujours contenir 3 composants pour la souche inductible par Hg ; une réponse de seuil d’environ 1 à 2 nM HgII avant la production de signal de fluorescence est linéairement proportionnelle à [HgII], la gamme linéaire où 5 nM HgII sera sûrement toujours au centre de cette plage et un plateau où augmenter [HgII] n’augmente plus le signal de fluorescence. Aucun changement dans la production du signal sur la souche constitutive n’indique que la toxicité du [HgII] n’affecte pas la production du signal. CDII dans la Figure 3 b, il y a toujours 2 composants pour la souche inductible ; une gamme linéaire où les 200-300 nM CdII sera sûrement toujours dans le centre de la gamme linéaire et un plateau. Une diminution de signal de fluorescence avec une augmentation [CdII] montre que des concentrations plus élevées de Cd sont toxiques pour les cellules et peuvent expliquer une baisse de la production inductible fluorescence après le plateau à 1000 nM CdII. Par conséquent, lorsque vous testez une biodisponibilité Hg ou un Cd par rapport à une variable d’environnementale, nous vous suggérons d’utiliser 5 nM pour HgII et 300 nM pour le CdII.

Dans certains cas, production du signal peut être correctement attribuée à biodisponibilité Hg ou Cd, mais dans d’autres cas, production du signal peut être affectée par la variation de l’état physiologique de l’hôte de cellule de biocapteurs (par exemple, le métal d’intérêt ou les conditions environnementales testées sont toxiques). Dans la Figure 4 a, 5 biodisponibilité de Hg nM a été testé sur un gradient de Zn (0-10 µM). En Hg-inductible et souches constitutives, il y a une diminution semblable au signal avec augmentation des concentrations de Zn. Par conséquent, on ne peuvent pas distinguer si le signal résultant d’une biodisponibilité réduite ou est le résultat de la toxicité du Zn. Dans la Figure 4 b et 4C, biodisponibilité de Hg de 5 nm a été testée sur un gradient de MgII (0-10 mM) et MnII (0-10 µM). Augmentation de MgII et MnII concentration diminue le signal de fluorescence de la souche inductible. En revanche, la souche constitutive n’a pas montré une diminution de fluorescence avec une augmentation de MgII et MnII concentration (MgII et MnII sont bénéfiques pour les cellules dans la production de la FbFp, comme en témoigne une augmentation du signal de fluorescence). Cela démontre que les cellules sont viables et la diminution de la fluorescence de la souche Hg-inductible résulte d’une diminution de biodisponibilité de Hg. Ces données souligne combien il est important pour tous les essais de biocapteurs fournir également des mesures constitutives de la condition physique de cellule.

figure-results-1
Figure 3 : gammes linéaires du biocapteur avec Mercure et le Cadmium. Fluorescence maximale mesurée comme la fluorescence relative unités (RFU) ± 1 écart-type émis par e. coli NEB5α hébergeant le pUC57merR-Pp (Hg-inductible) et pUC19Balch-(Constitutive) avec l’ajout de A) HgII (0-15 nM) et B) CdII (0-1 000 nM) dans des conditions anaérobies. Fluorescence est que la moyenne des 3 techniques réplique à 37 ° c. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : exemple d’un résultat non concluant avec le Zinc et un résultat concluant avec magnésium et manganèse. Fluorescence maximale mesurée comme la fluorescence relative unités (RFU) ± 1 écart-type émis par e. coli NEB5α hébergeant le pUC57merR-Pp (Hg-inductible) et pUC19Balch-(Constitutive) avec l’ajout de A) ZnII (0-10 µM), B) MgII (0-10 mM), et C) MnII (0-10 µM) dans des conditions anaérobies. [HgII] a été fixé à 5 nM pour tous les traitements et la fluorescence est la moyenne des 3 répétitions techniques à 37 ° c. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les biocapteurs microbiens sont des outils utiles pour identifier les mécanismes par lesquels les métaux interagissent avec les microbes. Nous décrivons ici une méthode qui permet de quantifier en anaérobiose HgII et CdII biodisponibilité à une cellule hôte gram négatif (Escherichia coli) et de donner un résultat quantifiable en quelques heures. Un des atouts majeurs de ce protocole est qu’il permet un contrôle étendu de la spéciation des métaux dans le milieu de l’exposition en évitant les ligands de forte liaison ou composants qui peuvent conduire à la précipitation de métaux. Spéciation des métaux a été modélisée et testée dans ce milieu d’exposition à l’aide de PHREEQC17, mais d’autres logiciels de la spéciation des métaux peut être déployé. Dans le cas d’aucun ajout de ligands, Hg spéciation est censée être présent comme 97 % Hg(OH)2 et 3 % Hg (NH3)22 +, tandis que la spéciation Cd sera présenter que 59 % Cd-β-glycérophosphate, 25 % Cd2 +et 16 % CdSO4. À l’aide d’un logiciel de modélisation thermodynamique simple, l’utilisateur peut concevoir des supports d’exposition et d’essai pour la biodisponibilité du métal d’intérêt. En outre, la cellule-hôte biocapteur (NEB5αd’e. coli ) est viable sur une large gamme de pH (5 à 8,5) et de la concentration de NaCl (0-0,55 M)17.

Méthylation de l’HG est un processus anaérobie, et le protocole décrit dans la présente étude n’a pas une exigence pour l’oxygène, permettant une description plus précise du métabolisme anaérobie sur la biodisponibilité des métaux. Ceci est important car la présence d’oxygène altère gene expression profiles48,49 et par conséquent, le potentiel transport voies ; par conséquent, cette méthode présente un avantage par rapport à actuellement existant des solutions de rechange aérobies. La construction de biodétection présentée ici est potentiellement utilisable avec d’autres hôtes anaérobies qui pourraient être plus pertinents pour la méthylation du mercure (par exemple Geobacter, Desulfovibrio), mais peut-être moins docile qu’e. coli. Une limitation du courant de l’approche présentée ici est que notre limite de détection n’a pas encore atteint les niveaux de particules, contrairement aux actuels systèmes aérobies4,19,37. Il est toutefois important de noter que pour atteindre ces limites de détection faible plusieurs mesures doivent être prises44: J’ai) addition de ligand est nécessaire pour assurer que Hg reste en solution et ne pas s’adsorber sur la paroi cellulaire microbienne (Hg sera irréversible lié aux dans la cellule des thiols surfaces empêchant sa biodisponibilité25,27; voir la réponse de seuil pour le mercure dans la Figure 3 a), ii) modifications de la densité cellulaire, ou iii) modifier la construction génétique afin d’inclure des protéines de transport du mer-opéron ( merT et merP), le flux croissant de Hg à l’intérieur de la cellule50,51. Ces modifications seraient bénéfiques dans la détection de faibles concentrations de mercure, mais pas nécessairement idéale lors de l’évaluation des situations pertinentes pour l’environnement. Considérant que la précédente biocapteurs cadmium existent principalement comme une « preuve de principe », ils ont été conçus dans un milieu complexe qui ne permettre pas l’enquêteur évaluer le rôle de la spéciation, biodisponibilité41,42, 43 , 44.

Le biocapteur est un outil incroyablement utile pour déterminer les mécanismes dans lesquels les espèces métalliques sont biodisponibles. Parce que l’organisme hôte n’est pas un Hg-methylator, il est utilisable uniquement pour élaborer un modèle pour comment Hg peut inscrire des bactéries à gram négatif et pas une justification définitive pour comment Hg-methylators acquièrent Hg. D’autres méthodes existent pour déterminer la biodisponibilité du Hg, telles que la méthylation, comme un résultat de l’absorption ou l’utilisation d’une démarche de bilan massique10,15,20,45,46. Cela étant dit, la méthode présentée ici offre l’avantage de données en temps quasi réel sur la biodisponibilité en cellules viables. Nous ne recommandons pas que cette méthode permettant de quantifier les concentrations totales de mercure ou Cd dans une matrice d’environnementale. Malgré l’utilisation de biocapteurs pour déterminer les concentrations de métaux dans l' environnement36, beaucoup de méthodes standard plus facilement accessibles est disponibles tels que l’ICP-MS, FAAS (pour l’analyse de Cd) ou spectroscopie d’absorption atomique de vapeur froide (pour Hg analyse). Le biocapteur peut cependant être utilisée pour déterminer si une matrice donnée environnementale a le potentiel d’améliorer ou d’entraver la biodisponibilité ; Ceci est réalisé en effectuant des ajouts dosés.

Le pH du milieu exposition peut-être être modifié à n’importe où au sein de la gamme de 5 et 8,5, pourvu que l’acide libre MOPS (tampon) est échangé avec un autre acide libre d’un tampon avec le pKa approprié (voir liste des tampons appropriées (Ferreira et al. (2015) 47) et ajusté avec KOH au pH approprié quand faire les médias de l’exposition. En outre, la méthode n’est pas limitée aux Hg et Cd, mais pourrait être étendue à d’autres métaux à l’aide d’autres régulateurs de la transcription.

L’essai d’exposition peut-être être modifié pour étudier l’influence d’autres accepteurs d’électrons comme O2 et fumarate sur la biodisponibilité de Hg ou Cd. Des modifications mineures à la méthode d’utiliser O2 et fumarate comme accepteurs d’électrons sont disponibles sur demande.

En résumé, nous tenons à mettre l’accent sur les points suivants : j’ai) il est impératif que les concentrations de stocks de Cd et Hg sont connues à l’étape 2, que ceux-ci seront utilisés pour calibrer le biocapteur. II) le jour de l’exposition, la croissance des cellules doit être arrêtée à une OD600 de 0,6 (± 0,1) et que les soins sont franchie avec la resuspendant les cultures de cellules, comme le biocapteur est calibré à la densité de cette cellule. III) enfin, il est important que le milieu de l’exposition fait méticuleusement le jour de l’exposition. Pour assurer le succès du protocole, des cultures multiples doivent être cultivées en même temps (pour contourner la possibilité d’un échec de croissance) et le milieu de culture doit être refait chaque semaine (pour contourner la Métastabilité des médias et la possibilité de contamination). Il convient également de noter que les réplicats biologiques (cultures de cellules multiples) expriment variabilité lorsqu’il s’agit de la production de signaux. Bien que les réponses fluorescents peuvent varier d’une culture, les tendances fluorescents en réponse à une variable donnée reste le même tout au long de nombreuses répétitions biologiques.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier les commentaires de deux réviseurs anonymes bien membres du laboratoire du Poulain pour discussion perspicace sur le développement de l’anaérobie biocapteur. Cette étude financée par une bourse de nouveau chercheur de la Province d’Ontario et d’une subvention à la découverte et un supplément d’accélérateur de Sciences naturelles et génie conseil de recherches à A.J.P..

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Flacon standard de 7 ml, intérieur arrondiDelta Scientific200-007-2034
recommandés Plateau de flacon, ouvertures de 21 mmDelta Scientific730-20014 pour (grille 4 x 8)
Fermeture de 24 mmDelta Scientific600-024-0132 recommandé
ENCOCHE D’ANGLE DU COUVERCLE NOIR STR CS/50CorningCorning 3931
Corning 96- microplaque de surface à fond transparentnon contraignant CorningCorning 3651
Chambre anaérobie (boîte à gants)L’air dans la chambre anaérobie doit être (97 % N2 ± ; 2 % et 3 % H2 ± ; 2 %)
Catalyseurau palladiumConvertit O2 en H2O dans la chambre anaérobie. Non obligatoire, mais recommandé.
Lecteur de
450 (± ; 10) Filtre nM pour le lecteur
500 (± ; 10) Filtre nM pour le lecteur
Flacon de culture anaérobie (tubes balches) + bouchons
SpectrophotomètreModifié pour les tubes de culture anaérobies
MA-3000 (analyseur de mercure)
SondeN’importe quelle sonde de pH fonctionnera
Tubes à centrifuger coniques stériles en polypropylène de 50 ml.
0,22 et micro ; Filtre pour seringue en polyéthersulfone m + seringue
FlaconsPour les milieux de culture et les étalons
Flaconssolutions alcalines (NaOH/KOH)
Poudres de réactifs : Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, sel d’ampicilline sodique, Difco M9 Sels minimaux, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, sel de sodium EDTA, FeSO4, bêta-gylcérophosphate de sodium, vadrouille acide libre, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2
EauAutoclavée ou stérilisée par filtre est acceptable.
lysogénie
Qualité analytique H2SO4
microplaquesde microplaquesde microplaquesen caoutchouc de pH en verre stériles/propres stériles en plastique ou en PTFE Pour stérile Milli-Q Bouillon de

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