Article de méthode

Analyse du Cycle cellulaire dans la lignée germinale de c. elegans avec la Thymidine Analog EdU

DOI :

10.3791/58339

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22 octobre 2018

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1Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, 2Department of Genetics, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri

Dans cet article

Résumé

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On décrit une méthode axée sur l’imagerie qui peut être utilisé pour identifier la phase S et analyser la dynamique du cycle cellulaire dans le c. elegans de germline hermaphrodite à l’aide de la thymidine EdU analogique. Cette méthode ne nécessite aucun transgènes et est compatible avec la coloration par immunofluorescence.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analyse du cycle cellulaire chez les eucaryotes utilise fréquemment la morphologie des chromosomes, expression et/ou la localisation des produits des gènes requis pour les différentes phases du cycle cellulaire, ou l’incorporation d’analogues nucléosidiques. Au cours de la phase S, ADN polymérases incorporent analogues de la thymidine par exemple EdU ou BrdU dans l’ADN chromosomique, marquage des cellules pour l’analyse. Pour c. elegans, le nucléoside EdU analogique est alimenté à la worms durant la culture ordinaire et est compatible avec les techniques d’immunofluorescence. La lignée germinale de c. elegans est un système puissant modèle pour les études de la signalisation des voies, cellules souches, la méiose et cycle cellulaire parce qu’il est transparent, génétiquement facile, et la prophase méiotique et différenciation cellulaire/gamétogenèse se produisent dans un Assemblée-comme la mode linéaire. Ces caractéristiques font de EdU un excellent outil pour étudier les aspects dynamiques des cellules mitotiquement cyclisme et développement de la lignée germinale. Ce protocole décrit comment correctement préparer EdU bactéries, nourrissez-les à sauvage c. elegans hermaphrodites, disséquer la gonade hermaphrodite, détachant pour EdU incorporation dans l’ADN, détachant avec les anticorps pour détecter différents cycle cellulaire et les marqueurs du développement, l’image de la gonade et analyser les résultats. Le protocole décrit les variations dans la méthode et l’analyse pour la mesure de phase S index, phase M index, G2 durée, durée du cycle cellulaire, taux d’entrée méiotique et taux de progression de la prophase méiotique. Cette méthode peut être adaptée à l’étude du cycle cellulaire ou l’histoire de la cellule dans d’autres tissus, stades, antécédents génétiques et des conditions physiologiques.

Introduction

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En développement animal, centaines, milliers, millions, milliards ou même des trillions de divisions cellulaires sont nécessaires pour former l’organisme adulte. Le cycle cellulaire, composé de l’ensemble des événements cellulaires de G1 (gap), S (synthèse), G2 (gap), et M (mitose) définissent la série d’événements qui sont exécutées à chaque division cellulaire. Le cycle cellulaire est dynamique et mieux appréciée en temps réel, qui peut être techniquement difficile. Les techniques présentées dans le présent protocole permettent d’effectuer les mesures des phases et le calendrier du cycle cellulaire des images fixes.

Marquage avec des analogues de nucléosides comme 5-éthynyl-2'-déoxyuridine (EdU) ou 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) est l’étalon-or pour identifier la phase S dans les études de la dynamique du cycle cellulaire chez l’adulte Caenorhabditis elegans (c. elegans) lignée germinale hermaphrodite1,2,3,4,5. EdU et BrdU peuvent être utilisé dans presque n’importe quel fond génétique, car ils ne reposent pas sur n’importe quelle construction génétique. Visualisation BrdU nécessite un traitement chimique sévère pour exposer l’antigène anticorps anti-BrdU, coloration, qui est souvent incompatible avec l’évaluation d’autres marqueurs cellulaires visualisées par la souillure conjointement avec d’autres anticorps. En revanche, la visualisation EdU s’effectue par chimie de clic dans des conditions douces et est donc compatible avec anticorps co coloration6,7.

La spécificité de l’étiquette est évidente, puisque les noyaux incorporent seulement les analogues (5-éthynyl-2'-déoxyuridine) de thymidine dans l’ADN au cours de la phase S. Visualisation se déroule dans le tissu fixe. L’étiquette EdU est invisible par lui-même jusqu'à un colorant contenant de l’azide ou fluorophore réagit par liaison covalente avec l’alcyne en EdU par clic catalysé par le cuivre chimie8. EdU étiquetage peut fournir des informations immédiates sur lequel les noyaux sont en phase S, à l’aide d’une brève impulsion d’étiquetage. EdU peut également fournir des informations dynamiques, à l’aide de pulse-chase ou marquage continu ; par exemple, dans une expérience de chasse, l’étiquette est dilué à chaque division cellulaire soit propagée aussi ne se divisant pas cellules progrès par le développement.

La lignée germinale hermaphrodite de c. elegans est un système puissant de modèle pour les études de la signalisation des voies, des cellules souches, la méiose et cycle cellulaire. La lignée germinale adulte est une chaîne de montage polarisée avec des cellules souches à l’extrémité distale, suivie de l’entrée et la progression à travers la prophase méiotique, coordonnée avec les stades de la gamétogenèse plus proximale (Figure 1). À l’extrémité proximale, ovocytes matures, sont ovulés et fertilisé et commencent l’embryogenèse dans l’utérus9,10,11. La région de long ~ 20 cellules de diamètre près du capteur de l’extrémité distale, qui comprend la tige de la lignée germinale mitotiquement cyclisme, cellules progénitrices et cellules en phase S méiotiques mais pas les cellules en prophase méiotique, s’appelle l’ancêtre zone2,4 , 9 , 12. les membranes des cellules fournissent une séparation incomplète entre les noyaux dans la lignée germinale distale, mais les cellules progénitrices de la zone subissent une mitose cellule cyclisme en grande partie indépendamment. La durée médiane cycle cellulaire mitotique des cellules de la zone germinale progénitrices en jeunes adultes hermaphrodites est ~6.5 h ; La phase G1 est brève ou absent, et le repos n’est pas observé de1,2,13. Différenciation des cellules souches germinales se fait par différenciation essentiellement directe et donc n’a pas de titres de transport en commun-amplification4. Au cours de la différenciation dans le stade pachytène, environ 4 des 5 noyaux ne feront pas d’ovocytes mais plutôt apoptose, agissant comme cellules nourricières en faisant don de leur contenu cytoplasmique à l’ovocyte en développement12,14 , 15.

En plus de l’étiquetage des cellules en phase S avec les analogues nucléosidiques, on peut identifier les cellules en mitose et méiose utilisant des anticorps. Lors de la mitose, les noyaux sont immunoréactives à anti-phospho-histone H3 (Ser10) anticorps (appelé pH3)7,16. Lors de la méiose, les noyaux sont immunoréactives à anticorps anti-lui-3 (une protéine d’axe méiotique)17. Noyaux dans la zone de souches peuvent être identifiées par l’absence de HIM-3, la présence de nucléoplasmique REC-818ou la présence de WAPL-119. WAPL-1 intensité est plus élevée dans la gonade somatique, élevée dans la zone de l’ancêtre et faible pendant début prophases méiotiques19. Plusieurs mesures de cycle cellulaire sont possibles avec quelques variations dans le protocole : J’ai) identifier les noyaux en phase S et mesurer l’indice de la phase S ; II) identifier les noyaux en phase M et mesurer l’indice de la phase M ; III) déterminer si les noyaux étaient en phase S mitotique ou méiotique ; IV) mesure la durée du G2 ; V) mesure la duartion des phases G2 + M + G1 ; VI) mesure le taux d’entrée méiotique ; VII) estimer le taux de progression de la méiose.

On peut faire plusieurs mesures cycle cellulaire de seulement quelques types d’expériences de wet-lab. Le protocole ci-dessous décrit un étiquetage d’impulsion de 30 min en se nourrissant de c. elegans adultes hermaphrodites avec EdU étiqueté les bactéries et les cellules de phase M co marquage par coloration avec progénitrices et anticorps anti-pH3 cellules de la zone de coloration avec l’anticorps anti-WAPL-1. Seuls les changements dans la durée de l’Education se nourrissent (étape 2.5), type d’anticorps utilisé (étape 5), et analyses (étape 8.3) sont nécessaires pour les mesures supplémentaires.

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Protocole

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1. préparation de bactéries marquées EdU

  1. Développer une culture de départ de MG1693. Escherichia coli MG1693 (e. coli) porte une mutation en thyA.
    1. Strie à MG1693 d’e. coli provenant d’un stock de glycérol congelé sur une gélose de bouillon (LB) de lysogénie 120 mm boîte de Pétri. Culture à 37 ° C pendant la nuit.
    2. Ensemencer de deux individuels e. coli MG1693 colonies en deux en double 4 tubes mL de liquide lb Culture à 37 ° C pendant environ 16 h.
      Remarque : MG1693 pousse très bien dans LB sans complétant avec thymine ou thymidine.
  2. Croissance MG1693 d’e. coli en milieu minimal additionné de EdU.
    1. Stériliser une fiole conique de 500 mL.
    2. Technique de stérilisation permet d’ajouter 5 mL de 20 % de glucose, 50 μL de 10 mg/mL de thiamine, 120 μL de thymidine 5 mM, 100 μL de 1 M MgSO4, 200 μL de 10 mM EdU, 100 mL de tampon de M9 et 4 mL de la culture de MG1693 nuitée fraîchement cultivés.
      Remarque : La concentration finale de EdU est 20 μM dans cette culture1,7. Cette concentration conduit à l’arrestation de dégâts et cycle cellulaire ADN si appliqué directement sur les cellules de mammifères en culture20. Cependant, seulement une fraction de ce EdU est incorporée le e. coli et donc disponibles pour le c. elegans. Il n’y a aucune preuve de l’arrêt du cycle cellulaire et aucun changement de la taille de la zone de l’ancêtre ou l’index de la phase M après traitement EdU de jeunes adultes hermaphrodites.
    3. La culture du jour au lendemain, mais pas plus de 24 h à 37 ° C sous agitation à 200 tr/min.
  3. Concentrer les EdU-étiqueté e. coli et s’appliquent à M9 gélose de Pétri.
    1. Refroidir préalablement une table centrifuger à 4 ° C.
    2. Technique de stérilisation permet de transférer la culture en tubes coniques de 2 – 4 stérile de 50 mL.
    3. Centrifuger les cultures à 3 000 x g à 4 ° C pendant 30 min granuler les EdU-étiqueté e. coli.
      NOTE : Disposer de surnageant contenant EdU selon les directives locales et institutionnelles.
    4. Remettre en suspension les pellets avec 4 mL de M9 fraîches. Utiliser un embout de pipette stérile de 1 mL ou une pipette sérologique stériles de 5 mL. Resuspendant des granulés peut prendre plusieurs minutes.
    5. Utilisez la même pipette pour appliquer et versez environ 8 gouttes de resuspendues EdU-étiqueté e. coli MG1693 au centre de température ambiante 60 mm M9 gélose de Pétri. Un seul lot donne ~ 16 plats.
    6. Laissez la vaisselle sécher pendant plusieurs heures ou une nuit à température ambiante, puis sceller chaque plat avec une bande de film de laboratoire. Des plats peuvent être stockés à 15 ° C, pendant environ 2 semaines et à 4 ° C pendant environ 2 mois. Utilisez le même lot d’EdU plats pour chaque série d’expériences.

2. alimentation EdU de c. elegans

  1. Synchroniser la population oeuf chronométré hypochlorite Lapointe, alcaline traitement suivi de couver en S-moyenne avec le cholestérol, ou en choisissant le bon stade21. Cultiver les animaux au stade désiré (ici, 24h post-L4) sur milieu de culture de nématode ensemencé avec e. coli OP50 à 20 ° C.
    NOTE : Préparez 50 – 100 animaux par expérience, que certains ne peuvent pas bien disséquer, et d’autres seront perdus dans le processus de lavage et de transfert.
  2. Laissez la vaisselle EdU chauffer à 20 ° C (ou à la température requise pour l’expérience).
  3. Laver les animaux de la vaisselle NGM utilisant M9 ou une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans un tube de 1,5 mL. Que les animaux puissent s’installer brièvement par gravité ou une brève rotation dans une micro-centrifugeuse.
  4. Retirez le surnageant et laver les animaux 1 à 2 fois avec ~ 1 mL de M9 ou PBS. Retirez le surnageant.
  5. Utiliser une pipette Pasteur en verre pour transférer les animaux dans une minuscule goutte de M9 ou PBS sur le centre de la pelouse de EdU. Attendre quelques minutes pour que le liquide être absorbé, puis incuber à 20 ° C pendant 30 min (pour la mesure directe de phase S) ou plus (pour mesurer l’histoire de la phase S), selon les besoins.
    NOTE : Signal de EdU est détectable dans les noyaux des cellules germinales après aussi peu que 15 min de EdU alimentation1.
  6. Laver les vers le plat EdU avec environ 2 mL de M9 ou PBS dans un verre plat de dissection.

3. dissection et la Fixation des cellules germinales de c. elegans

Remarque : Ce protocole pour la dissection, la fixation et souillure d’anticorps de la lignée germinale hermaphrodite de c. elegans est presque identique à celui publié par Gervaise et Arur (2016)22, sauf que les tubes de verre de 1 mL peuvent être centrifugés pour accélérer le processus lavage des marches et un verre d’interminables pipette Pasteur peut être utilisé pour évacuer le liquide de tubes de verre de 1 mL plus efficacement.

  1. Laver et disséquer germlines de c. elegans .
    1. Que les animaux puissent se déposent au fond du plat dissection, tourbillon à recueillir les animaux dans le centre et utilisez une pipette Pasteur longue pour supprimer les PBS. Laver 1 à 2 fois avec environ 2 mL de PBS.
    2. Ajouter 2 mL de PBS et 4 μL de levamisole 100 mM pour immobiliser les animaux. Agiter le plat pour recueillir les animaux dans le centre du plat.
      Remarque : L’immobilisation peut prendre quelques secondes à quelques minutes. Immobilisation complète n’est pas nécessaire pour la dissection réussie. Certaines personnes ont plus de succès lorsque la dissection incomplètement immobilisé des animaux.
    3. Disséquer les animaux avec une paire d’aiguilles 25 5/8" par une coupe à la tête (environ entre les deux ampoules pharyngées) ou la queue. Prendre soin de ne pas pour couper la boucle de la lignée germinale. Intestin et la lignée germinale devraient « sortir » de la cavité du corps en raison de la pression interne, mais restent attachées. Ce protocole est similaire à déjà publiées de Gervaise et de Arur (2016)22.
      NOTE : Garder le temps de la dissection à ~ 5 min, certainement pas plus de 15 min. temps de dissection plus longs peuvent entraîner la perte du signal de coloration anticorps (Sudhir Nayak, communication personnelle) et famine dans du PBS peut influer sur la physiologie des animaux. Apprendre à décortiquer avec rapidité et précision peut prendre peu de pratique.
    4. Si nécessaire, agiter pour recueillir les animaux disséqués dans le centre et utilisez une pipette Pasteur longue pour enlever autant PBS que possible.
  2. Difficulté et mettre en attente les tissus
    1. Ajouter 2 mL de paraformaldéhyde à 3 % (PFA) dans une solution de PBS. Couvrir le plat d’un film de laboratoire et de magasin sur un banc ou dans un tiroir pendant 10 min sans serrer.
      NOTE : Décongeler solution PFA dans un 37 ° C, bain d’eau et ensuite refroidir à température ambiante avant la dissection germlines.
      ATTENTION : La solution de la PFA est modérément toxique et probablement cancérogène et tératogène. Émettant des solutions de paraformaldéhyde les vapeurs sont inflammables. Porter des gants de nitrile. Diluer le PFA de 16 % à 3 % dans une hotte chimique. Lorsque vous travaillez à l’extérieur de la hotte aspirante, garder tous les contenants visés.
    2. Transférer les gonades avec soin dans un tube à centrifuger verre propre de 5 mL.
    3. Ajouter environ 3 mL de PBSTw (PBS avec 0,1 % Tween-20) au plat qui contenait les gonades pour aider à récupérer des gonades restants et pour diluer la solution de la PFA.
    4. Centrifuger dans une centrifugeuse clinique à 870 x g pendant environ 1 min. jeune ou plus petits animaux nécessitent plus longs que les animaux plus âgés ou plus spin.
    5. À l’aide d’une pipette de verre longues, transférer le surnageant indésirable bécher matérielle pour jeter finalement dans une bouteille matériaux indésirable dans la hotte chimique.
    6. Ajouter 2 mL de méthanol à haute teneur préalablement refroidie à-20 ° C. Couvrir le tube à centrifuger hermétiquement avec un film de laboratoire.
      Remarque : Utilisation de méthanol frais de haute qualité « gold label » est essentielle pour la bonne morphologie avec certains anticorps.
      ATTENTION : Le méthanol est un liquide très inflammable et vapeur, qui est toxique en cas d’ingestion, inhalation ou autorisés à communiquer avec la peau. Porter des gants et équipements de protection individuelle appropriés. Utiliser un congélateur approprié pour de petites quantités de produits inflammables.
    7. Magasin dans le congélateur-20 ° C pendant 1 h, même pendant la nuit ou même plusieurs mois.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.

4. réhydrater Germlines

  1. Remplir le tube à centrifuger verre haut avec PBSTw pour diluer le méthanol et réhydrater les gonades. Tournez en bas dans une centrifugeuse clinique à 870 x g pendant environ 1 min.
  2. À l’aide d’une longue pipette Pasteur en verre, transférer le surnageant indésirable bécher matérielle pour jeter finalement dans une bouteille matériaux indésirable dans la hotte chimique.
  3. Laver les gonades 3 fois avec environ 5 mL de PBSTw, filer vers le bas dans une centrifugeuse clinique à 870 x g pendant environ 1 min chaque fois. Retirez le surnageant.
  4. Rincer un tube en verre borosilicate mL 1 petite et une longue pipette Pasteur en verre avec PBSTw.
  5. Ajouter ~ 700 μL de PBSTw et utiliser la longue pipette Pasteur en verre pour transférer les gonades sur le petit tube. Utiliser quelques gouttes supplémentaires de PBSTw pour s’assurer que tous les gonades sont transférées.
  6. Tournez en bas dans une centrifugeuse clinique à 870 x g ~ 1 min. à l’aide d’un verre de longue haleine pipette Pasteur, retirer autant de liquide que possible sans déranger les gonades. Laissez pas plus de 50 μL.
    Remarque : Si la détection d’anticorps n’est pas nécessaire, passez à l’étape 6.

5. détecter les antigènes anticorps

  1. Diluer l’anticorps primaires dans le sérum de 30 % dans du PBS. Dans l’exemple présent, anticorps anti-WAPL-1 est 1:2,000 dilué et anticorps anti-pH3 dilué 1/500. Centrifuger le sérum fraîchement décongelée pendant 10 min dans un microtube à 20 000 x g à 4 ° C pour éliminer les particules. Utilisez le surnageant, qui peut être conservé à 4 ° C pendant plusieurs jours. Utilisez le sérum approprié pour correspondre à l’organisme hôte d’anticorps secondaires (sérum de chèvre est utilisé ici). Une étape facultative de blocage peut être ajoutée avant l’ajout des anticorps primaires.
  2. Appliquer 100 μL d’anticorps primaire dilué à chaque petit tube en verre. Incuber à température ambiante pendant 4 h.
    Remarque : Le temps d’Incubation varient par anticorps. Pour certains anticorps, 2 h à température ambiante est suffisante. Des incubations plus longues (p. ex.., toute la nuit) sont possibles, mais peut augmenter le fond.
  3. Remplir les tubes pour garnir de PBSTw et de filer vers le bas dans une centrifugeuse clinique à 870 x g pendant environ 1 min.
  4. Laver les gonades 3 fois à l’aide de ~ 1 mL de PBSTw. Incuber pendant ~ 5 min / cycle de lavage pour permettre des excès d’anticorps primaire de diffuser dans le lavage. En utilisant un interminables longue pipette Pasteur en verre, enlever autant de liquide que possible sans déranger les gonades. Laissez pas plus de 50 μL.
  5. Diluer l’anticorps secondaires dans le sérum de chèvre de 30 % dans du PBS. Dans l’exemple présent, chèvre-anti-lapin-594 et chèvre-anti-souris-647 sont chacun dilués à 1 : 400.
    Remarque : Sélectionnez des anticorps secondaires avec soin pour s’assurer que colorants sont distinguent par la teinture dans le kit de EdU. Dans l’exemple présent, le kit EdU contenue un colorant d’excitation 488 nm.
  6. Appliquer 100 μL d’anticorps secondaire dilué à chaque petit tube en verre. Incuber dans l’obscurité à température ambiante 2 h.
    Remarque : Le temps d’Incubation varient par anticorps. Pour certains Anticorps secondaires, 1 h à température ambiante est suffisante. Des incubations plus longues (p. ex.., toute la nuit) sont possibles, mais peut augmenter le fond.
  7. Laver les gonades 3 fois à l’aide de ~ 1 mL de PBSTw. Incuber pendant ~ 5 min / cycle de lavage pour permettre des excès anticorps secondaire de diffuser dans le lavage. En utilisant un interminables longue pipette Pasteur en verre, enlever autant de liquide que possible sans déranger les gonades. Laissez pas plus de 50 μL.
    Remarque : Les gonades peuvent être stockés dans 100 μl de PBS après cette étape, si nécessaire, même si cela peut réduire le signal. Supprimer les PBS avant de procéder.

6. effectuer la réaction de EdU cliquez pour détecter les EdU

Remarque : Exécuter l’UDE clic réaction avant l’anticorps coloration étapes (effectuer l’étape 6 avant l’étape 5) est possible, en fonction de l' anticorps utilisés7. Toutefois, les réactifs de clic peuvent interférer avec certains antigènes (e.g., REC-8 anticorps est sensible à la fixation et la perméabilisation). L’ordre présenté ici donne des anticorps brillante coloration avec le REC-8, WAPL-1, 3-HIM, pH3, drapeau et CYE-1 anticorps utilisés, entre autres.

  1. Préparer le clic EdU cocktail8 frais en ajoutant ce qui suit dans un tube propre de 1,5 mL. L’ordre des additions est important. Protéger de la lumière et préserver tous les réactifs sur la glace. Cette recette donne assez pour un échantillon (100 μl) ; multiplier la recette selon les besoins.
    1. Ajouter 2 mL d’eau ultrapure additif dans la mémoire tampon. Cela fait 10 x additif de tampon, qui doit être dilué à 1 x immédiatement avant leur utilisation.
    2. Ajouter 8,5 μL de tampon de x 10 à 76,5 μL d’eau ultrapure. Bien mélanger.
    3. Ajouter 4 μL de 100 mM de CuSO4 (peut être étiqueté comme composant E). Bien mélanger.
    4. Ajouter 0,25 μL du colorant 488 nm azoture. Il doit être décongelé à température ambiante, comme son solvant, le diméthylsulfoxyde, est solide à 4 ° C. Bien mélanger et protéger de la lumière.
    5. 9 Mix μL d’eau ultrapure avec 1 μL de la mémoire tampon d’additive dans le capuchon du tube. Pipette de la PAC pour ajouter au cocktail restant et bien mélanger en pipetage de haut en bas.
  2. Effectuer la réaction de clic EdU.
    1. Ajouter ~ 100 μL de clic EdU cocktail dans les gonades dans le petit tube. Couvrir d’un film de laboratoire et incuber pendant 30 à 60 minutes à température ambiante.
    2. Laver une fois avec 100 μL de tampon de rinçage de réaction.
    3. Laver les gonades 4 fois à l’aide de ~ 1 mL de PBSTw. Incuber pendant environ 15 min par lavage afin de permettre des excès EdU cocktails composants de diffuser dans le lavage. En utilisant un interminables longue pipette Pasteur en verre, enlever autant de liquide que possible sans déranger les gonades. Laissez pas plus de 50 μL.

7. taches d’ADN et de préparer des diapositives

  1. Verser 1 goutte (~ 25 μL) de milieu de montage antifade avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, permettant de visualiser l’ADN) dans les gonades. Attendez quelques minutes pour qu’il peut s’installer et se mêlent les gonades.
    Remarque : En alternance, une dilution de 1 : 1 000 de DAPI (provenant d’un stock de 0,1 mg/mL) dans du PBS peut être appliquée pendant 5 min, suivie de 20 μL de 1, 4-diazabicyclo [2.2.2] octane (DABCO) à 90 % de glycérol, ou un autre produit de montage antifade.
  2. Préparer un grand tampon de gel d’agarose 2.5 % sur une lame de microscope de verre standard.
  3. Utiliser un nouveau propre et sans poussière longue pipette Pasteur en verre pour transférer les gonades sur le tampon de gel d’agarose. Garder tous les liquides et les gonades en bas étroit de la pipette pour minimiser la perte des gonades.
    Remarque : Les gonades collé au petit tube en verre ou en verre longue pipette Pasteur peut être « sauvé » par rinçage avec PBSTw, recueillir le liquide dans un plat de dissection et cueillette des animaux sur la lame avec un cil.
  4. Utiliser une cils (ou une boucle de cheveux fins) collé sur un cure-dent pour répartir les gonades sur le coussinet de gel d’agarose et enlever les particules de poussière.
  5. Appliquer une lamelle de verre rectangulaire. Bas lentement d’un côté pour éviter les bulles d’air. Utiliser un mouchoir en papier pour enlever l’excédent de solution empêchant la lamelle de se déplacer librement.
    Remarque : Choisissez des lamelles couvre-objet qui correspondent au microscope qui sera utilisé. lamelles couvre-objet #1 et #1.5 fonctionne bien.
  6. Laisser les lames de régler et de sécher légèrement toute la nuit à température ambiante ou 4 ° C. Cela permet d’aplatir légèrement les gonades. Diapositives doivent être conservés à 4 ° C.
  7. En option : Sceller les bords de la diapositive avec vernis à ongles, ou une autre diapositive scellant. Sceller les coins tout d’abord, puis les côtés, empêche la lamelle de se déplacer.

8. analyse et imagerie confocal

  1. Image la gonade distale avec un microscope à fluorescence confocale tourne disque équipé d’une source de lumière de haute énergie, objectifs apochromatiques-plan et une caméra de haute efficacité. Capturer les images avec 1 μm ou un espacement plus serré entre z-piles. Prenez note de laser de puissance, sensibilité et l’exposition de temps pour tous les canaux.
    1. Utilisez la syntaxe suivante : excitation 405 nm laser de ligne avec un filtre d’émission nm (W60) 485 pour DAPI, excitation 488 nm laser, ligne avec un filtre d’émission nm (W55) 527 pour EdU, excitation de ligne de 561 nm laser avec un filtre d’émission 615 nm (W70) WAPL-1 et un 640 nm laser ligne excita tion avec un filtre d’émission nm (W90) 705 pour pH3.
      NOTE : Intensité du Signal et l’intensité de l’arrière-plan variera. De même, les temps d’exposition requis variera, peut-être jusqu'à 10 fois.
  2. Utiliser le plug-in de compteur de cellules23 dans Fidji24,25 pour compter manuellement chaque noyau. Étiquetez chaque noyau individuel selon la présence et l’absence de pH3, EdU et WAPL-1. Utilisez les classes des noyaux décrites dans le tableau 1 et Figure 2, car il permettra de faciliter tous les calculs décrits ci-dessous.
    NOTE : Expérimentateurs habiles comptez avec précision tous les noyaux dans une image 3D sans double comptage ou manque des noyaux. Alternativement, on peut compter chaque noyau dans chaque plan z, et les marques-à-cellules R script3 peut être utilisée pour retirer les noyaux de multiplier un décompte.
  3. Calculer le nombre de cellules et des fréquences de comtes ci-dessus selon le type de cycle de cellules de mesure nécessaire. Les types de noyaux sont définis dans le tableau 1 et Figure 2. Les calculs sont résumées dans le tableau 2.
    1. (Variation je) Pour identifier les noyaux en phase S, nourrir les animaux EdU pendant 30 min. N’importe quel affichage EdU étiquette les noyaux sont noyaux phase S. Pour calculer, prenez les noyaux somme de A et C, voir tableau 1 et Figure 2.
      Remarque : Dans une impulsion EdU dans les adultes hermaphrodites sauvage de 30 min, EdU tous étiquetés noyaux sont conjointement étiquetées avec le géniteur de marqueurs zone1.
    2. Pour mesurer la zone progénitrices, détachant avec un marqueur de zone de progéniteurs comme anticorps REC-8 ou WAPL-1. La zone de l’ancêtre est définie ici comme tous nucléoplasmique REC-818 ou de noyaux de cellules germinales immunoréactives WAPL-1. Pour calculer, en résumé tous les noyaux immunoréactives WAPL-1 (A + B + C + D, voir tableau 1 et Figure 2).
      Remarque : WAPL-1 étiquette également le DTC et les noyaux somatiques gonades qui ne devraient pas être comptées. Les noyaux somatiques sont faciles à identifier par signal extrêmement intense de WAPL-1, position légèrement à l’extérieur de la lignée germinale et une morphologie « œuf frit » des noyaux.
    3. Pour mesurer l’indice de la phase S, effectuer une expérience EdU de 30 min et l’étiquette conjointement avec anticorps REC-8 ou WAPL-1. L’index de la phase S est défini comme la proportion de la zone de l’ancêtre qui est en phase S. Pour calculer, compter tous les noyaux de la phase S et puis à diviser par le nombre total de noyaux zone progénitrices (A + C / A + B + C + D, voir tableau 1 et Figure 2).
    4. (Variation II) Pour identifier les noyaux en phase M, détachant avec anticorps pH3. Les noyaux immunoréactives pH3 sont les noyaux de phase M. Cette méthode fonctionne indépendamment de la durée de l’EdU se nourrissent. Pour calculer, prendre la somme de A et noyaux B, voir tableau 1 et Figure 2.
      Remarque : WAPL-1 étiquette également le DTC et les noyaux somatiques gonades qui ne devraient pas être comptées. Les noyaux somatiques sont faciles à identifier par signal extrêmement intense de WAPL-1, position légèrement à l’extérieur de la lignée germinale et une morphologie « œuf frit » des noyaux.
    5. Pour mesurer l’indice de la phase M, étiquette conjointement avec le pH3 et REC-8 ou WAPL-1. L’index de la phase M est défini comme la proportion de la zone de l’ancêtre qui est en phase M. Pour calculer, compter tous les noyaux de la phase M et ensuite diviser par le nombre total de noyaux zone progénitrices (A + B / A + B + C + D, voir tableau 1 et Figure 2).
    6. (Variation III) Noyaux en mitose et méiose S-phase deux étiquettes avec EdU. Pour dire les deux populations apart, déterminer si la phase S a été suivie par mitose ou méiose. Pour déterminer si les noyaux sont en phase S mitotique ou méiotique, nourrir EdU pendant 4 h et co label pour pH3 (un marqueur de la phase M) et HIM-3 (une protéine d’axe méiotique) par anticorps. Enregistrer les noyaux qui affichent les EdU et pH3 (type A, voir tableau 1 et Figure 2) comme phase mitotique S tandis que les noyaux qui affichent les EdU et HIM-3 (type E, voir tableau 1 et Figure 2) comme phase S méiotique.
    7. (Variation IV) Calculer la durée de la phase G2.
      NOTE : Phase G2 sépare phase S de la phase M. Bien qu’aucun marqueur n’a été signalée à étiquette G2 dans la lignée germinale de c. elegans , on peut calculer la durée de la phase G2 en combinant les données de plusieurs expériences qui M (au moment de la dissection) et S-phases (à partir de plusieurs heures avant de l’étiquette dissection). Une cellule qui affiche phase M et marqueurs de la phase S G2-phase terminée au cours de l’expérience. Une cellule qui affiche uniquement le marqueur de la phase M et pas le marqueur de la phase S n’était pas en phase S pendant l’expérience.
      1. Pour calculer la durée de la phase G2, nourrir EdU pendant 2 h et co étiquette avec anticorps pH3. Examiner des noyaux seuls qui pose avec pH3 (ceux-ci sont en phase M lors de la dissection) la présence d’EdU (ceux-ci étaient en phase S pendant l’étiquette de EdU 2 h avant la dissection). Calculer la fraction de noyaux de phase M qui a complété la phase G2 (A / A + B, voir tableau 1 et Figure 2).
      2. Réitérer cette expérience avec un marqueur de EdU 3 h et de nouveau avec une étiquette d’EdU 4 h (et éventuellement une étiquette de EdU 5 h). Tracer le pour cent de pH3 noyaux positifs qui sont EdU positif sur l’axe des ordonnées et la durée de EdU étiquettes sur l’axe des x, tel qu’illustré à la Figure 3 a.
      3. Calculer la durée médiane de la phase G2 en reliant les points sur le graphe et déterminer où la ligne traverse les 50 %, comme le montre la Figure 3 a.
      4. Calculer la durée maximale de la phase G2 en reliant les points sur le graphe et déterminer où la ligne croise à 99 %, comme le montre la Figure 3 a.
    8. (Variation V) Calculer la duraion de G2 + M + G1.
      Remarque : Dans la lignée germinale de c. elegans , phase G1 est inhabituellement courte. Bien qu’aucun marqueur n’a été signalée à intituler G1 dans la lignée germinale de c. elegans , on peut estimer la durée de la somme de la phase G1, G2 et M et puis comparer cette fois avec le temps de la phase G2 décrit ci-dessus. La durée maximale du G2 + M + G1 est estimée par le pourcentage de tous les noyaux de zone progénitrices (WAPL-1 immunoréactive) qui restent EdU négatif (n’a pas subi de phase S) après EdU marquage pendant plusieurs heures.
      1. Pour calculer la durée du G2 + M + G1, nourrir EdU pendant 2 h et co étiquette avec anticorps REC-8 ou WAPL-1. Déterminer la fraction de la zone de l’ancêtre qui subit la phase S pendant cette période (A + C / A + B + C + D, voir tableau 1 et Figure 2).
      2. Réitérer cette expérience avec un marqueur de EdU 3 h et de nouveau avec une étiquette d’EdU 4 h (et éventuellement une étiquette de EdU 5 h). Tracer le pour cent de REC-8 ou WAPL-1 noyaux positifs qui sont EdU positif sur l’axe des ordonnées et la durée de EdU étiquettes sur l’axe des abscisses, comme illustré à la Figure 3 b.
      3. Calculer la durée maximale du G2 + M + G1 en reliant les points sur le graphique et de trouver où la ligne croise à 99 %, comme le montre la Figure 3 b.
        Remarque : Il est possible de réaliser des expériences pour déterminer la durée du G2 et G2 + M + G1 comme un jeu unique de 2, 3, 4 et 5 h EdU expériences par co marquage avec des anticorps fois lapin-anti-WAPL-1 et anti-souris-pH3.
    9. (Variation VI) Pour identifier les noyaux répliqués dans la zone de géniteur, mais ont depuis la méiose est entrée, nourrir les animaux EdU pour 10 h de co étiquette avec anticorps REC-8 ou WAPL-1. N’importe quel affichage EdU étiquette les noyaux étaient en phase S durant ces 10 h. Les noyaux qui n’affichent pas la coloration nucléoplasmique REC-8 ou WAPL-1 ont été à la méiose. Tout simplement compter les noyaux avec étiquetage EdU qui n’affichent pas de marquage avec le marqueur de zone de progéniteurs (E, voir tableau 1).
      Remarque : À l’inverse, si les gonades sont colorées pour le marqueur de la prophase méiotique lui-les-3 avec des anticorps anti-HIM-3, compter le nombre de noyaux avec EdU libellés qui sont également positives pour lui-les-3.
    10. Pour calculer le taux d’entrée méiotique, réaliser l’expérience ci-dessus portant une étiquette 5 h, 10 h et 15 h de EdU. Tracer le nombre de noyaux qui inscrit la méiose sur l’axe des ordonnées et la durée de l’étiquette EdU sur l’axe des x, tel qu’illustré en Figure 3. Utilisez ensuite une régression linéaire simple pour calculer la pente (méiose noyaux entrés par h) de y = mx + b.
      Remarque : Il est essentiel d’utiliser une régression linéaire pour calculer le taux d’entrée méiotique. Il serait incorrect d’il suffit de diviser le nombre de noyaux qui inscrit la méiose par la durée de l’étiquette de EdU, parce que l’ordonnée à l’origine n’est pas nulle.
    11. (Variation VII) Mesurer le taux de progression de la méiose.
      Remarque : Étant donné que EdU est incorporée par liaison covalente à l’ADN, il peut être utilisé pour suivre une population de cellules par l’intermédiaire de différenciation. Les cellules qui ont subi la phase S dans la zone de progéniteurs conservent l’étiquette EdU qui entrent en méiose, progressez dans la méiose et subir l’ovogenèse. Une expérience de chasse avec EdU peut être utilisée pour mesurer le taux de progression de la méiose.
      1. Se nourrissent de bactéries EdU marquées aux animaux pendant 4 h (le « pouls »). Transférer les animaux sans étiquette OP50 bactéries pendant 48 h (la « chasse »), puis disséquer et étiqueter conjointement avec un marqueur de zone de progéniteurs comme REC-8 ou WAPL-1 (ou un marqueur de la prophase méiotique tels que HIM-3), si vous le souhaitez.
      2. En imagerie, recherchez la position du noyau EdU marquée plus proximale. Le taux de progression de la méiose est la distance (dans des diamètres de cellule de la fin de la zone de progéniteurs) parcouru par l’UDE plus proximale étiquetée noyau durant l’incubation de 48 h.

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Résultats

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Puisque la synthèse de l’ADN est nécessaire pour incorporer EdU, on peut conclure que noyaux marqués EdU a subi une phase S pendant la fenêtre de temps EdU-étiquetage. On peut interpréter les noyaux cette étiquette dans une alimentation de 30 min avec EdU étiqueté bactéries comme noyaux en phase S au moment de la dissection. Noyaux qui label en un plus EdU continu alimentation expérience peuvent ont marqué dès le début dans la fenêtre de temps et depuis la gauche phase S, ou peuvent ont m...

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Discussion

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Préparation de bactéries marquées EdU (étape 1) est essentielle à ce protocole et le premier point pour le dépannage. Étiquette de type sauvage jeunes adultes hermaphrodites très fiable dans un 4 h EdU-impulsion, ce qui en fait un contrôle utile pour chaque nouveau lot de bactéries marquées EdU. En outre, des bactéries intactes EdU marquées qui pénètrent dans l’intestin (chez les animaux âgés ou certains mutants défectueux du pharynx/rectifieuse) seront étiqueter avec la chimie de clic et apparaissent comme lumineux punc...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous sommes reconnaissants envers le centre de stock d’e. coli pour MG1693 ; Wormbase ; le centre de génétique de Caenorhabditis qui est financé par le National instituts de santé Bureau de recherche programmes d’Infrastructure (P40OD010440) pour les souches ; Zach Pincus pour conseils statistiques ; Aiping Feng pour réactifs ; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar et John Brenner pour formation, conseils, soutien et discussion utile ; et les labos Kornfeld et Schedl pour vos commentaires sur ce manuscrit. Ce travail a été soutenu en partie par le National Institutes of Health [R01 AG02656106A1 à KK, R01 GM100756 à TS] et une bourse prédoctorale National Science Foundation [DGE-1143954 et DGE-1745038 à ZK]. Le National Institutes of Health, ni la National Science Foundation a eu aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte, l’analyse et l’interprétation des données, ni par écrit le manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
E. coli MG1693Coli Genetic Stock Center6411se développe bien dans le LB
em>E. coli standard non supplémenté OP50Caenorhabditis Genetics CenterOP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging KitThermo Fisher ScientificC10337
5-Ethynyl-2&prime ;-deoxyuridineSigma900584-50MGou utilisez l’EdU fourni dans le kit
GlucoseSigmaD9434-500GD-(+)-Dextrose
Thiamine (Vitamine B1)SigmaT4625-5GRéactif Qualité
ThymidineSigmaT1895-1GBioRéacteur
Sulfate de magnésium heptahydratéSigmaM1880-1KGMgSO4, Phosphate
, dibasique, anhydreFisherBP332-500GNa2HPO4
Phosphate de potassium, monobasiqueSigmaP5379-500GKH2PO4
Chlorure d’ammoniumSigmaA4514-500GNH4Cl, réactif plus
gélose bactériologiqueUS BiologicalC13071058
Chlorure de calcium dihydratéSigmaC3881-500GCaCl
LB Bouillon (Miller)SigmaL3522-1KGUtilisé à 25g/L
LévamisoleSigmaL9756-5G0.241g/10ml
Saline tamponnée au phosphateCalbiochem Omnipur6506PBS maison fonctionne tout aussi bien
Tween-20SigmaP1379-500ML
16 % Paraformaldéhyde, ampoules de qualité EMMicroscopie électronique Sciences1571010ml
100 % méthanolThermo Fisher ScientificA454-1LLe méthanol Gold est essentiel à la bonne morphologie de certains anticorps
chèvreGibco16210-072Lot 1671330
lapin-anti-WAPL-1Novus biologicals49300002Lot G3048-179A02, utilisé au 1:2000
souris - clone anti-pH3 3H10Millipore05-806Lot#2680533, utilisé à 1:500
chèvre-anti-lapin IgG-conjugué Alexa Fluor 594InvitrogenA11012Lot 1256147, utilisé à 1:400
chèvre-anti-souris IgG conjugué Alexa Fluor 647InvitrogenA21236Lot 1511347, utilisé à 1:400
Milieu de montage anti-décoloration Vectashield contenant du dichlorhydrate de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)Vector LaboratoriesH-1200le support de montage sans DAPI peut être utilisé à la place, après une incubation DAPI distincte
vernis à onglesWet n WildDTC450Btout vernis à ongles transparent doit fonctionner
S-mediumdiversvoir wormbook.org pour le protocole
M9 tampondiversvoir wormbook.org pour le protocole
M9 agardiversmême recette que le tampon M9, mais ajouter 1,7 % de gélose
Nématode Croissance Milieudiversvoir wormbook.org pour le protocole
de dissection du verre de montreCarolina Biological42300
Parafilm film de laboratoirePechiney Plastic PackagingPM-996Film de laboratoire de 4 pouces de large
boîtes60 mm de diamètre
Pipettes
Tubes à centrifuger1ml MidSci Avant2926
Embouts
Pipettes
500 mL Fiole
Feuille d’aluminium
25G Aiguilles 5/8"BD PrecisionGlide  ;
tube à centrifuger en verre de 5 mlPyrex.
Tubes en verre borosilicaté 1ml
lames de
n° 1 lamelles 22 x 40 mmn° 1,5 peuvent fonctionner, également
37 ° ; C Incubateur à secousses Centrifugeuse
de
Centrifugeuse cliniqueIEC428avec rotor à godets oscillants
Mini Centrifuge
20 ° ; C incubateur
4 ° ; C réfrigérateur-20
° ; C congélateur
Microscope Observer Z1 ObjectifZeiss
Plan Apo 63X 1.4Zeiss
Ultraview VoxPerkinElmer  ;système confocal à disque rotatif Nikon fonctionne également très bien, comme décrit ici : http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy  ;
< de sodium de qualité réactif ampoules Sérum de de Pétri Pasteur en verre longsérologiquesErlenmyer305122verretable à immersion dans l’huile Système confocal à disque rotatif Le

Références

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