Analyse du Cycle cellulaire dans la lignée germinale de c. elegans avec la Thymidine Analog EdU

Résumé

On décrit une méthode axée sur l’imagerie qui peut être utilisé pour identifier la phase S et analyser la dynamique du cycle cellulaire dans le c. elegans de germline hermaphrodite à l’aide de la thymidine EdU analogique. Cette méthode ne nécessite aucun transgènes et est compatible avec la coloration par immunofluorescence.

Résumé

Analyse du cycle cellulaire chez les eucaryotes utilise fréquemment la morphologie des chromosomes, expression et/ou la localisation des produits des gènes requis pour les différentes phases du cycle cellulaire, ou l’incorporation d’analogues nucléosidiques. Au cours de la phase S, ADN polymérases incorporent analogues de la thymidine par exemple EdU ou BrdU dans l’ADN chromosomique, marquage des cellules pour l’analyse. Pour c. elegans, le nucléoside EdU analogique est alimenté à la worms durant la culture ordinaire et est compatible avec les techniques d’immunofluorescence. La lignée germinale de c. elegans est un système puissant modèle pour les études de la signalisation des voies, cellules souches, la méiose et cycle cellulaire parce qu’il est transparent, génétiquement facile, et la prophase méiotique et différenciation cellulaire/gamétogenèse se produisent dans un Assemblée-comme la mode linéaire. Ces caractéristiques font de EdU un excellent outil pour étudier les aspects dynamiques des cellules mitotiquement cyclisme et développement de la lignée germinale. Ce protocole décrit comment correctement préparer EdU bactéries, nourrissez-les à sauvage c. elegans hermaphrodites, disséquer la gonade hermaphrodite, détachant pour EdU incorporation dans l’ADN, détachant avec les anticorps pour détecter différents cycle cellulaire et les marqueurs du développement, l’image de la gonade et analyser les résultats. Le protocole décrit les variations dans la méthode et l’analyse pour la mesure de phase S index, phase M index, G2 durée, durée du cycle cellulaire, taux d’entrée méiotique et taux de progression de la prophase méiotique. Cette méthode peut être adaptée à l’étude du cycle cellulaire ou l’histoire de la cellule dans d’autres tissus, stades, antécédents génétiques et des conditions physiologiques.

Introduction

En développement animal, centaines, milliers, millions, milliards ou même des trillions de divisions cellulaires sont nécessaires pour former l’organisme adulte. Le cycle cellulaire, composé de l’ensemble des événements cellulaires de G1 (gap), S (synthèse), G2 (gap), et M (mitose) définissent la série d’événements qui sont exécutées à chaque division cellulaire. Le cycle cellulaire est dynamique et mieux appréciée en temps réel, qui peut être techniquement difficile. Les techniques présentées dans le présent protocole permettent d’effectuer les mesures des phases et le calendrier du cycle cellulaire des images fixes.

Marquage avec des anal....

Protocole

1. préparation de bactéries marquées EdU

1. Développer une culture de départ de MG1693. Escherichia coli MG1693 (e. coli) porte une mutation en thyA.
   1. Strie à MG1693 d’e. coli provenant d’un stock de glycérol congelé sur une gélose de bouillon (LB) de lysogénie 120 mm boîte de Pétri. Culture à 37 ° C pendant la nuit.
   2. Ensemencer de deux individuels e. coli MG1693 colonies en deux en double 4 tubes mL de liquide lb Culture à 37 ° C pendant environ 16 h.
      Remarque : MG1693 pousse très bien dans LB sans complétant avec thymine ou thymidine.
2. Croissance MG1693 ....

Résultats

Puisque la synthèse de l’ADN est nécessaire pour incorporer EdU, on peut conclure que noyaux marqués EdU a subi une phase S pendant la fenêtre de temps EdU-étiquetage. On peut interpréter les noyaux cette étiquette dans une alimentation de 30 min avec EdU étiqueté bactéries comme noyaux en phase S au moment de la dissection. Noyaux qui label en un plus EdU continu alimentation expérience peuvent ont marqué dès le début dans la fenêtre de temps et depuis la gauche phase S, ou peuvent ont m.......

Discussion

Préparation de bactéries marquées EdU (étape 1) est essentielle à ce protocole et le premier point pour le dépannage. Étiquette de type sauvage jeunes adultes hermaphrodites très fiable dans un 4 h EdU-impulsion, ce qui en fait un contrôle utile pour chaque nouveau lot de bactéries marquées EdU. En outre, des bactéries intactes EdU marquées qui pénètrent dans l’intestin (chez les animaux âgés ou certains mutants défectueux du pharynx/rectifieuse) seront étiqueter avec la chimie de clic et apparaissent comme lumineux punc.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
E. coli MG1693	Coli Genetic Stock Center	6411	se développe bien dans le LB
em>E. coli standard non supplémenté OP50	Caenorhabditis Genetics Center	OP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit	Thermo Fisher Scientific	C10337
5-Ethynyl-2&prime ;-deoxyuridine	Sigma	900584-50MG	ou utilisez l’EdU fourni dans le kit
Glucose	Sigma	D9434-500G	D-(+)-Dextrose
Thiamine (Vitamine B1)	Sigma	T4625-5G	Réactif Qualité
Thymidine	Sigma	T1895-1G	BioRéacteur
Sulfate de magnésium heptahydraté	Sigma	M1880-1KG	MgSO4, Phosphate
, dibasique, anhydre	Fisher	BP332-500G	Na2HPO4
Phosphate de potassium, monobasique	Sigma	P5379-500G	KH2PO4
Chlorure d’ammonium	Sigma	A4514-500G	NH4Cl, réactif plus
gélose bactériologique	US Biological	C13071058
Chlorure de calcium dihydraté	Sigma	C3881-500G	CaCl
LB Bouillon (Miller)	Sigma	L3522-1KG	Utilisé à 25g/L
Lévamisole	Sigma	L9756-5G	0.241g/10ml
Saline tamponnée au phosphate	Calbiochem Omnipur	6506	PBS maison fonctionne tout aussi bien
Tween-20	Sigma	P1379-500ML
16 % Paraformaldéhyde, ampoules de qualité EM	Microscopie électronique Sciences	15710	10ml
100 % méthanol	Thermo Fisher Scientific	A454-1L	Le méthanol Gold est essentiel à la bonne morphologie de certains anticorps
chèvre	Gibco	16210-072	Lot 1671330
lapin-anti-WAPL-1	Novus biologicals	49300002	Lot G3048-179A02, utilisé au 1:2000
souris - clone anti-pH3 3H10	Millipore	05-806	Lot#2680533, utilisé à 1:500
chèvre-anti-lapin IgG-conjugué Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11012	Lot 1256147, utilisé à 1:400
chèvre-anti-souris IgG conjugué Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Lot 1511347, utilisé à 1:400
Milieu de montage anti-décoloration Vectashield contenant du dichlorhydrate de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	le support de montage sans DAPI peut être utilisé à la place, après une incubation DAPI distincte
vernis à ongles	Wet n Wild	DTC450B	tout vernis à ongles transparent doit fonctionner
S-medium	divers		voir wormbook.org pour le protocole
M9 tampon	divers		voir wormbook.org pour le protocole
M9 agar	divers		même recette que le tampon M9, mais ajouter 1,7 % de gélose
Nématode Croissance Milieu	divers		voir wormbook.org pour le protocole
de dissection du verre de montre	Carolina Biological	42300
Parafilm film de laboratoire	Pechiney Plastic Packaging	PM-996	Film de laboratoire de 4 pouces de large
boîtes			60 mm de diamètre
Pipettes
Tubes à centrifuger	1ml MidSci Avant	2926
Embouts
Pipettes
500 mL Fiole
Feuille d’aluminium
25G Aiguilles 5/8"	BD PrecisionGlide  ;
tube à centrifuger en verre de 5 ml	Pyrex.
Tubes en verre borosilicaté 1ml
lames de
n° 1 lamelles 22 x 40 mm			n° 1,5 peuvent fonctionner, également
37 ° ; C Incubateur à secousses Centrifugeuse
de
Centrifugeuse clinique	IEC	428	avec rotor à godets oscillants
Mini Centrifuge
20 ° ; C incubateur
4 ° ; C réfrigérateur-20
° ; C congélateur
Microscope Observer Z1 Objectif	Zeiss
Plan Apo 63X 1.4	Zeiss
Ultraview Vox	PerkinElmer  ;		système confocal à disque rotatif Nikon fonctionne également très bien, comme décrit ici : http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy  ;

< de sodium de qualité réactif ampoules Sérum de de Pétri Pasteur en verre longsérologiquesErlenmyer305122verretable à immersion dans l’huile Système confocal à disque rotatif Le