Nous présentons ici un protocole visant à isoler les noyaux de cerveau dans le cerveau de rats néonatals en conjonction avec la première prise de nourriture de colostrum. Cette technique permet l’étude du stress de l’insuffisance des éléments nutritifs dans le cerveau comme modulée par l’entérocyte de signalisation.
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Article de méthode
Évaluer le Stress cellulaire et l’Inflammation dans les noyaux en cerveau sécrétant ocytocine discrète chez le Rat néonatal avant et après la première tétée de Colostrum
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le but du présent protocole est d’isoler les nucléi riches de récepteurs de l’ocytocine dans le cerveau néonatal avant et après la première tétée de colostrum. L’expression des protéines connues pour répondre aux stress métabolique a été mesurée dans le cerveau-noyaux isolats à l’aide de Western Blot. Ceci permet de déterminer si l’insuffisance nutritive induite par le stress métabolique dans le corps déclenche stress neuronale. Nous avons déjà démontré que l’insuffisance nutritive chez les nouveau-nés provoque un stress métabolique dans le tube digestif. En outre, l’ocytocine colostrum module marqueurs de réponse, l’inflammation et autophagie cellulaire au stress dans les villosités gut rat nouveau-né avant et après la tétée première. Signalisation des marqueurs de protéines associées au stress du réticulum endoplasmique [protéine chaperon binding immunoglobulin ER (BiP), traduction eucaryote initiation factor 2 a (eIF2a) et l’eIF2a kinase protéine kinase R (p-PKR)], ainsi que deux inflammation-signalisation protéines [facteur nucléaire-κB (NF-kB) et inhibiteur κB (IkB)], ont été mesurées dans les nucléi nouveau-né [noyau du faisceau solitaire (NFS), noyau paraventriculaire (PVN), noyau supra optique (NSO), cortex (CX), striatum noyaux (STR), et noyau préoptique médian (FTU)] avant le premier flux (désamorcé par le colostrum) et après le départ des soins infirmiers (amorcée par le colostrum). Expression de BiP/GRP78 et p-eIF2a ont été positivement en désamorce et réprimés dans le tissu du SNRC apprêté. NF-kB est maintenu (élevé) dans le cytoplasme de la CX, STR et MPO, alors que le NF-kB est plus faible et inchangé en NTS, PVN et fils dans les deux conditions. Le collectif BiP et p-eIF2 conclusions concordent avec une réponse au stress. eIf2a est phosphorylée par dsRNA dependent kinase (p-PKR) dans le fils, CX, STR et MPO. Toutefois, dans le NTS (et dans une moindre mesure en PVN), eIf2a est phosphorylée par une autre kinase, contrôle général nonderepressible-2 kinase (GCN2). Les mécanismes de modulation de stress précédemment observés dans les entérocytes de l’intestin nouveau-né semblent être reflétés dans certaines régions du cerveau OTR-rich. La RNT et PVN peuvent utiliser un mécanisme de phosphorylation différents (sous des carences nutritives) provenant d’autres régions et être réfractaire à l’incidence de l’insuffisance des éléments nutritifs. Ensemble, ces données suggèrent que les réponses cérébrales au stress de l’insuffisance des éléments nutritifs sont décalés de signalisation de colostrum-amorcé des entérocytes.
Introduction
Contrairement à notre compréhension du développement du cerveau qui se produisent au cours des jours à semaines post-partum, relativement peu est connu sur la myriade de changements dynamiques qui se produisent dans les premières heures de vie chez les rats. Un défi important a été la petite taille du cerveau rat néonatal et une exigence pour les outils de pointe isoler les régions cérébrales discrètes ou des cellules isolées. Études évaluent souvent les gènes transcription et la traduction pas1,2, qui ne donne pas une bonne compréhension des niveaux fonctionnels des molécules de signalisation activées. D’autr....
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Protocole
Cette étude a été approuvée par les commissions d’utilisation de Columbia University et le New York State Psychiatric Institute et d’animalier institutionnel.
1. préparation du tissu
- Commander des rates gravides chronométrés de vendeur.
- Suivre des rates gravides chronométrés en observant leur abdomen de plus en plus dans les semaines qui suivent leur arrivée et par la suite à la recherche de chiots à la date de livraison prévue en inspectant la cage toutes les 2 h jusqu'à ce que la livraison commence.
- Supprimez les chiots avec une main gantée par leur queue avant leur première nourriture pour chiots désamorcés ....
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Résultats
Les bandes représentatives d’immunoréactivité par rapport aux protéines totales montrent qu’il y a des nucléi avec récoltés très pauvre en protéines. Ceci nécessite l’utilisation de la technique automatisée de Western blot, qui est très sensible par rapport à la tache occidentale canonique. Cette approche peut être exécutée avec sino-européen moins de protéines par capillaire par rapport à la voie par dans les transferts Western.
E.......
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Discussion
Une technique pour microdissection Discrete, noyaux de cerveau OTR-riches dans le cerveau de rat néonatal est présentée dans cet article. Il est bien établi que les neurones sont très spécialisés, même à l’intérieur des noyaux bien caractérisés dans le cerveau. Cette approche hautement reproductible pour isoler les noyaux riches en OTR spécifiques permet des tests d’hypothèse robuste. L’utilisation automatisée Éponger occidental, l’uniformité et la reproductibilité des résultats ont été encore améliorées. Alors qu’une li.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient Manon Ranger et Alexandra Schulz pour leur aide dans la préparation de ce protocole.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Bradford solution | Bio Rad | ||
| Kit de lyse des protéines | Protein simple | CBS403 | Bicine/CHAPS |
| WES Protein | simple | WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07) | |
| anti-souris IgG HRP conjuguate | Protein simple | ||
| Rabbit anti-phospho-eIF2a | Technologie de signalisation cellulaire | SER51, 9721 | |
| Anticorps monoclonal de souris anti-PKR | Technologie de signalisation cellulaire | 2103 | |
| Lapin anti-phospho-PKR | Millipore | Thr451, 07-886 | |
| Anticorps monoclonal de lapin anti-PKR | de signalisation cellulaire | 12297 | |
| Anticorps monoclonal de lapin anti-GAPDH | Technologie de signalisation cellulaire | 2118 | |
| mAb de souris anti-phospho-IKB | de signalisation cellulaire | 9246 | |
| mAb de souris anti-IKB | Technologie de signalisation cellulaire | 4814 | |
| lapin anti-BiP | de signalisation cellulaire | 3183 | |
| Lapin anti GCN2 | Technologie de signalisation cellulaire | 3302 | |
| Lapin mAb anti-phospho-GCN2 | BIORBYT | T899 | |
| gestante Rats Sprague-Dawley | Charles River Laboratories | ||
| Dispositif de poinçonnage | WellTech Rapid Core ou Harris Uni-Core | 0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50 |
Références
- Hietaniemi, M., et al. Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams. Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).
- Okabe, A., et al.
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Réimpressions et autorisations
