Nous présentons ici un protocole au calcium image de signalisation dans les populations de types de cellules individuelles à la jonction neuromusculaire murine.
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Article de méthode
Ex Vivo Imagerie du Calcium cellulaire spécifique de signalisation à la Synapse Tripartite du diaphragme souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’activité électrique des cellules dans les tissus peut être surveillée par des techniques électrophysiologiques, mais ceux-ci sont généralement limités à l’analyse des cellules individuelles. Puisqu’une augmentation du calcium intracellulaire (Ca2 +) dans le cytosol se produit souvent en raison de l’activité électrique, ou en réponse à une myriade d’autres stimuli, ce processus peut être surveillé par l’imagerie de cellules chargé avec fluorescentes sensibles au calcium colorants. Toutefois, il est difficile d’imager cette réponse en un type de cellule individuelle au sein de tissus entiers parce que ces colorants sont repris par tous les types de cellules dans les tissus. En revanche, les indicateurs de calcium génétiquement encodé (GECIs) peuvent être exprimées par un type de cellule individuelle et sont fluorescents en réponse à une augmentation du Ca intracellulaire2 +, ce qui permet l’imagerie de Ca2 + signalisation des populations entières de types de cellules individuelles. Ici, nous appliquons l’utilisation du GECIs GCaMP3/6 à la jonction neuromusculaire de la souris, une synapse tripartite entre les motoneurones du muscle squelettique et terminal/périsynaptique les cellules de Schwann. Nous démontrent l’utilité de cette technique dans les préparations de tissu classique ex vivo . À l’aide d’un diviseur optique, nous réalisons l’imagerie double longueur d’onde des signaux dynamiques de Ca2 + et une étiquette statique de la jonction neuromusculaire (NMJ) dans une approche qui pourrait être facilement adaptée pour surveiller deux GECI spécifiques des cellules ou tension génétiquement encodée indicateurs (GEVI) simultanément. Finalement, nous discutons les routines utilisées pour capturer des cartes spatiales de l’intensité de la fluorescence. Ensemble, ces techniques optiques, transgéniques et analytiques peuvent être utilisées pour étudier l’activité biologique des sous-populations de cellules distinctes à la NMJ dans une grande variété de contextes.
Introduction
Le NMJ, comme toutes les synapses, se compose de trois éléments : une terminaison présynaptique dérivé d’un neurone, une cellule de neurone postsynaptique/effecteurs, et un périsynaptique glial cell1,2. Alors que les aspects fondamentaux de la transmission synaptique étaient tout d’abord montrés à cette synapse3, beaucoup d’aspects de ce processus demeure inconnus, en partie en raison de l’expression des molécules de mêmes par les éléments cellulaires distincts de cette synapse. Par exemple, des récepteurs pour les séquences de nucléotides puriques adénine ATP et l’acétylcholine (ACh), ....
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Protocole
L’élevage et les expériences ont été effectuées conformément au instituts nationaux de santé Guide pour les soins et utilisation des animaux de laboratoire et l’IACUC à l’Université du Nevada.
1. préparation des diaphragmes et des nerfs phréniques chez des souris transgéniques
- Acheter souris transgéniques et des amorces au génotype de ces souris.
Remarque : Les amorces sont répertoriés sur la page « Informations » pour chacun de ces souris.- Reproduire une souris 3 - to 6-month-old exprimant une copie de l’approprié transgéniques/knock-in allèle de Cre-pilote et zéro copies de l’allèle de GCaMP3/6 conditionnelle....
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Résultats
Plusieurs exemples de changements d’intensité de fluorescence, médiées par l’augmentation du Ca intracellulaire2 + dans les types de cellules déterminées de la NMJ, montrent l’utilité de cette approche. Ces résultats sont présentés sous forme de cartes d’intensité spatiale de fluorescence, qui fournissent la localisation des cellules ayant répondu au questionnaire, ainsi que l’intensité de leurs réponses, ce qui permet l’évaluation de combien les cellules réagissent et combien .......
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Discussion
Nous fournissons ici quelques exemples de mesure Ca2 + réponses dans certaines cellules dans le tissu neuromusculaire intact, à l’aide de souris exprimant le GECI. Pour réaliser ces expériences, il est impératif de ne pas blesser le nerf phrénique au cours de la dissection. Pour image réponses Ca2 + dans les cellules de Schwann à haute ou basse puissance (c'est-à-dire, 20 X ou 60 X), il est nécessaire d’utiliser le BHC ou µ-conotoxine au mouvement du bloc. Pour l’imagerie de la faible puiss.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu avec des fonds des National Institutes of Health (NIH) GM103554 et GM110767 à (T.W.G.) et le National Center for Research Resources 5P20RR018751 et le National Institute of General Medical Sciences 8P 20 GM103513 (pour G.W.H.).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Souris Myf5-Cre | Jax | #007893 | Stimule l’expression des cellules musculaires dès E136 |
| Wnt1-Cre | souris Jax | #003829 | Stimule l’expression dans toutes ; Cellules de Schwann à E13 mais pas à P209 |
| Sox10-Cre | souris Jax | #025807 | Stimule l’expression des cellules de Schwann à des âges plus avancés |
| Souris GCaMP3 conditionnelles | Jax | #029043 | Exprime GCaMP3 de manière spécifique à la cellule |
| Souris GCaMP6f conditionnelles | Jax | #024105 | Exprime GCaMP6f de manière spécifique à la cellule |
| BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one) | Hit2Lead | #5102862 | Bloque la myosine musculaire squelettique mais pas la neurotransmission6 |
| CF594-&alpha ;-BTX | Biotium | #00007 | Marque les grappes de récepteurs de l’acétylcholine aux |
| peptides | µ ;-conotoxine GIIIb | #CONO20-01000 | Blocs Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8 |
| Gel diélectrique de silicone ; alias Sylgard | Ellswoth Adhesives | # Sil Dielec Gel .9KG ; | Permet l’immobilisation du diaphragme par des broches minutiennes |
| Broches minutieuses (0,1 mm de diamètre) | Fine Science Tools | 26002-10 | Immobilise le diaphragme sur le gel diélectrique de silicone |
| Microscope droit Eclipse FN1 ; | Nikon | MBA74100 | Permet la mise en scène et l’observation de l’échantillon |
| Plate-forme de microscope fixe de base avec traducteur manuel de microscope XY ; | Autom8 | MXMScr | Permet le déplacement de l’échantillon |
| Micromanipulateur manuel. | Narishige | M-152 | Contient des électrodes d’enregistrement et de stimulation |
| Amplificateur à microélectrodes ; | Molecular Devices | Axoclamp 900A | Permet l’enregistrement électrophysiologique intracellulaire à électrodes pointues |
| Système d’acquisition de données à faible bruit | Molecular Devices | Digidata 1550 ; | Permet l’acquisition de données électrophysiologiques |
| Système d’analyse de données à microélectrodes | Dispositifs moléculaires | PCLAMP 10 Standard | Effectue une analyse de données électrophysiologiques |
| Stimulateur à ondes carrées | Herbe | S48 | Stimule le nerf pour exciter le muscle |
| Unité d’isolation de stimulus | Herbe | PSIU6 | Réduit les artefacts de stimulation |
| Filaments borosilicatés, diamètre extérieur de 1,0 mm, diamètre intérieur de 0,5 mm. | Sutter | FG-GBF100-50-15 | Empale et enregistre les potentiels musculaires évoqués par les nerfs Filaments |
| borosilicatés, diamètre extérieur de 1,5 mm, diamètre intérieur de 1,17 mm ; | Sutter | BF150-117-15 | Allongé et utilisé pour l’électrode d’aspiration |
| Extracteur de micropipette | Sutter | P-97 ; | Tire et prépare les électrodes d’enregistrement |
| Caméra cMOS rétroéclairée de 1200 x 1200 pixels ; | Photometrics | Prime 95b | Caméra sensible qui permet une imagerie haute résolution et haute vitesse |
| Source lumineuse | Lumencor | Spectra X | Fournit un éclairage à partir de LED pour l’observation de la fluorescence |
| . Objectifs fluorescents à immersion dans l’eau corrigés à l’infini, D.E. 2 mm | Nikon | CFI60 | Fournit de longues distances de travail pour la visualisation de l’échantillon |
| Illuminateur à fibre optique avec lampe halogène | Sumita | LS-DWL-N | Fournit un éclairage pour l’observation en fond clair |
| W-View Gemini Image Splitter ; | Hamamatsu | A12801-01 | projette 1 paire d’images à double longueur d’onde séparées par un dichroïque à une seule caméra |
| Filtres passe-bande monobande ; (512/25-25 et 630/92-25) ; | SemRock | FF01-512/25-25 ; FF01-630/92-25 | Permet l’imagerie bi-bande |
| 560 nm Séparateur de faisceau dichroïque à bord unique | Sem Rock | FF560-FDi01-25x36 | Miroir dichroïque qui sépare les faisceaux de lumière pour permettre une imagerie à double longueur d’onde |
| Système d’acquisition de données d’imagerie | Nikon | NIS Elements - MQS31000 | Permet l’acquisition de données d’imagerie |
| Module de contrôle de longueur d’onde | Module MQS41220 | Nikon pour les données d’imagerie acqusiition | |
| Module matériel de répartiteur d’émissions ; | Nikon | MQS41410 | Module pour l’acquisition de données d’imagerie |
| Système d’analyse de données d’imagerie | NA | Volumétrie 8D5, Fiji | Permet l’analyse de l’intensité de fluorescence et d’autres données d’imagerie |
Références
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple func....
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Réimpressions et autorisations
