Ex Vivo Imagerie du Calcium cellulaire spécifique de signalisation à la Synapse Tripartite du diaphragme souris

Le NMJ, comme toutes les synapses, se compose de trois éléments : une terminaison présynaptique dérivé d’un neurone, une cellule de neurone postsynaptique/effecteurs, et un périsynaptique glial cell^1,2. Alors que les aspects fondamentaux de la transmission synaptique étaient tout d’abord montrés à cette synapse³, beaucoup d’aspects de ce processus demeure inconnus, en partie en raison de l’expression des molécules de mêmes par les éléments cellulaires distincts de cette synapse. Par exemple, des récepteurs pour les séquences de nucléotides puriques adénine ATP et l’acétylcholine (ACh), qui sont conjointement libérées par les neurones moteurs à la NMJ vertébré, sont exprimés par muscle, les cellules de Schwann et les neurones moteurs, ce qui complique l’interprétation de le quelconque effet fonctionnel exercée par ces substances (p. ex., libération des transmetteurs ou réponse, génération de la force musculaire)⁴. En outre, bien que les composants tripartites de la NMJ sont simples par rapport à, par exemple, les neurones du système nerveux central qui présentent souvent des entrées synaptiques multiples, si les motoneurones, les cellules musculaires ou des cellules de Schwann varient en réponse à des stimuli basé sur leur intrinsèque hétérogénéité (p. ex., dérivation embryonnaire, sous-type de fibre, morphologie) n’est pas claire. Afin de répondre à chacune de ces questions, il serait avantageux de suivre simultanément la réponse de plusieurs cellules dans un seul élément synaptique, ainsi que piste, en même temps, une telle réponse dans un des autres éléments distincts. Les stratégies conventionnelles utilisant des teintures chimiques pour mesurer la signalisation calcique ne peut pas atteindre ces deux buts, car appliqué au bain de teinture est repris par plusieurs types de cellules après application sur tissu, et utilisable uniquement dans les cellules chargées de colorant pour visualiser individuels ou de petites cohortes de cellules. Ici, utilisant des souris transgéniques exprimant GECIs conçu pour mesurer la signalisation calcique spécifique des cellules, ainsi que l’imagerie spécifique et logiciels outils⁵, nous montrer la première de ces deux objectifs généraux et discuter comment l’ajout de nouveaux outils transgéniques permettrait d’atteindre le second. Cette technique sera utile pour tous ceux intéressés par le suivi dynamique du calcium ou autres cellulaires observables d’événements de signalisation par l’intermédiaire de capteurs optiques gène codé dans plusieurs populations de cellules en même temps.

L’élevage et les expériences ont été effectuées conformément au instituts nationaux de santé Guide pour les soins et utilisation des animaux de laboratoire et l’IACUC à l’Université du Nevada.

1. préparation des diaphragmes et des nerfs phréniques chez des souris transgéniques

1. Acheter souris transgéniques et des amorces au génotype de ces souris.
   Remarque : Les amorces sont répertoriés sur la page « Informations » pour chacun de ces souris.
   1. Reproduire une souris 3 - to 6-month-old exprimant une copie de l’approprié transgéniques/knock-in allèle de Cre-pilote et zéro copies de l’allèle de GCaMP3/6 conditionnelle avec une deuxième souris du même âge exprimant un ou deux exemplaires de conditionnel GCaMP3 / 6 allèle et zéro copies de l’allèle de Cre-pilote.
   2. Génotype les chiots et marque ceux qui ont des Cre et conditionnelle GCaMP3/6 allèles — ceux-ci seront appellera dorénavant des souris double-transgéniques (p. ex., Myf5-Cre, GCaMP3 conditionnelle)⁶.
      Remarque : De cette façon, toutes les données dérivent de souris exprimant une seule copie du Cre et conditionnelle GCaMP3/6 allèles. Ceci est particulièrement important lors de l’ajout dans les autres souris mutantes (p. ex., coups de grâce) à ces croisements.
2. Quand les souris double-transgéniques sont de l’âge approprié (par exemple, un jour après la naissance 0 ou 5 [P0 ou P5] ou adultes), euthanasier les souris en les décapitant avec des ciseaux (pour les souris plus jeunes que P10) ou en les plaçant dans une chambre d’inhalation isoflurane — lorsqu’ils sont n’est plus recevable à pincer la queue avec une paire de pinces, ils sont prêts pour le sacrifice.
3. Sacrifier l’animal par décapitation avec une paire de ciseaux.
4. Section transversalement à travers l’animal entier juste en dessous du foie et juste au-dessus du cœur et des poumons avec des ciseaux iridectomie.
5. Loin de disséquer le foie, le cœur et les poumons, en prenant soin de maintenir une longueur du nerf phrénique qui est suffisamment long pour être aspiré par une électrode d’aspiration (c.-à-d., 1-2 cm).
   Remarque : Le nerf phrénique gauche peut être identifié comme un morceau blanc de tissu qui s’introduit dans la partie médiale du diaphragme gauche. Il ne doit pas être coupé lorsque vous retirez les poumons. Le nerf phrénique droit s’exécute dans un morceau de carénage qui contient la veine cave supérieure et est plus mince et plus blanc que la veine cave. Ensemble, ils ont tous deux pénètrent le diaphragme droit médial.
6. Plus loin, enlever la cage thoracique et la colonne vertébrale, à l’exception de la crête mince autour de la membrane.
7. Placer le diaphragme et l’échantillon du nerf phrénique dans un tube à centrifuger avec une solution de Krebs-Ringer avec 594-αBTX de 1 µg/mL pendant 10 min dans l’obscurité.
   Note : Cette concentration de 594-αBTX étiquettes récepteurs ACh (ACHaRS) sans bloquer leur fonction (observation personnelle).

2. la stimulation et l’enregistrement des potentiels d’Action musculaires

1. À l’aide d’épingles à minutien, immobiliser le diaphragme en épinglant sur un plat de 6 cm recouvertes de silicone gel diélectrique et rempli de ~ 8 mL de solution de Ringer-Krebs oxygénée et placez-la sur la platine du microscope. Perfuse le diaphragme avec une solution plus Krebs-Ringer (8 mL/min) pendant 30 min.
   Remarque : Il rince l’indépendant 594-αBTX, ainsi que s’équilibre les tissus après dissection.
2. Faire une électrode d’aspiration selon les méthodes établies⁷.
   1. Un grossissement X 4, à l’aide d’un micromanipulateur, déplacez l’électrode d’aspiration sur le nerf phrénique gauche et appliquer la succion en tirant le Canon d’une seringue de 5 mL relié à la tuyauterie qui est attachée à l’électrode d’aspiration.
      Remarque : Lorsqu’il est dessiné avec succès dans l’électrode d’aspiration, le nerf phrénique est bien tendu. Allumez le stimulateur et stimuler le phrénique nerf en faisant basculer le Manuel commutateur 1 x.
   2. Veiller à ce que le diaphragme se contracte en réponse à la stimulation de 1 Hz en examinant visuellement il avec éclairage de fond clair. Si ce n’est pas le cas, ajuster la tension en tournant le bouton de tension progressivement pour atteindre une impulsion supramaximal, qui peut être vérifiée par un examen visuel de la contraction musculaire. Si elle est toujours pas visible, souffler le nerf avec la seringue et tenter d’établir nouveau en appliquant d’aspiration.
3. Arrêter la perfusion et ajoutez la myosine du muscle spécifique inhibiteur BHC⁶ ou canal sodique voltage-dépendant antagoniste µ-conotoxine⁸ à une concentration finale de 100 µM.
   1. Pour faire 100 µM BHC, distribuer 4 µL de stock de 200 mM dans le DMSO et il predilute dans 1 mL de solution de Ringer-Krebs.
   2. Retirer le plat de 1 mL de solution de Ringer-Krebs.
   3. Ajouter le BHC dilué, au plat.
      Remarque : Cette dilution permet d’éviter l’induction par le DMSO non dilué de réponse fluorescente non transitoires dans les cellules exprimant le GCaMP3.
   4. Attendre 30 min, puis, tournez sur la perfusion de solution fraîche de Krebs-sonnerie pendant 20-30 min.
4. Préparer l’électrode d’enregistrement.
   1. Porter des gants, placer un verre de borosilicate l’avec un diamètre extérieur (OD) de 1 mm et 0,4 mm de diamètre intérieur (ID) dans une de micropipettes et serrer les cadrans pour bloquer en position. Fermer la porte de l’extracteur.
   2. À l’aide d’un extracteur P-97, programmer le paramètre suivant : chaleur à 900, tirez à 120, vitesse à 75 fois à 250, pression à 500 et pas de boucles supplémentaires.
      Remarque : Resistance (R) est mesurée à l’aide de contrôles de logiciels de l’amplificateur : le logiciel d’acquisition de données confirme la résistance en résolvant la formule V = IR Le contrôleur logiciel passe un courant connu (I) (typiquement 1 nA) par le biais de l’électrode et mesure la variation de tension (V), nous permettant ainsi de résoudre pour R.
   3. Pour les membranes embryonnaires, veiller à ce que la résistance est près de 60 MΩ et pour les plus âgés membranes, 10-20 MΩ. Charger l’électrode d’enregistrement avec 3M KCl.
5. À un grossissement de 10 X, abaisser l’électrode dans le muscle, à l’aide d’un micromanipulateur deuxième sur le côté opposé de la scène comme une électrode de stimulation.
6. À l’aide de logiciels d’acquisition de données électrophysiologiques, attendez jusqu'à ce que le potentiel membranaire de repos varie de 0 à -65 mV ou ci-dessous.
7. Stimuler à 1 Hz et vérifier la présence d’un potentiel d’action musculaire en recherchant un grand potentiel qui présente un dépassement modeste (potentiel qui s’élève au-dessus de 0 mV quand il commence à -65 mV ou ci-dessous). Ne confondez pas l’artefact de la stimulation avec un potentiel d’action.
   Remarque : Les potentiels sont beaucoup plus longues en durée (~ 5 ms) que les artefacts de stimulation.

3. imagerie de Fluorescence de l’échantillon

1. Grossissement de 20 X, repérez la plaque d’extrémité bande au centre du muscle en recherchant NMJ 594-αBTX – étiquetés sous excitation lumineuse vert/jaune (550 nm). Passer à l’excitation lumineuse bleue (470 nm) à l’image Ca^{2 +} réponses dans le muscle, neurone moteur ou les cellules de Schwann.
2. Si vous le souhaitez, mettre en place le séparateur d’image avec filtres passe-bande et un filtre dichroïque de single-edge pour l’imagerie à double longueur d’onde.
3. Afin de calculer la fluorescence maximale (Fmax) exposée par GCaMP3/6-exprimant le tissu, ajouter 12 µL 3M de chlorure de potassium (KCl) dans les préparations de diaphragme⁶.
   1. Réaliser des expériences avec la barre de luminosité sur la barre de recherche table fixée à 110 % du niveau auquel le tissu GCaMP3/6-exprimant pièces saturation au grossissement de 20 X, sans binning en réponse au KCl.
4. Enregistrer à 20 images par seconde pas manquer aucun événement rapide.
5. Stimuler avec 1-45 s de 20-40 Hz de stimulation nerveuse en livrant un train d’impulsions à l’aide de l’électrode d’aspiration ou ajouter agonistes pharmacologiques par application de bain ou en perfusion et recueillir fluorescent Ca^{2 +} réponses dynamiques dans le sous-type d’une cellule ainsi que le signal NMJ statique 594-αBTX.
   Remarque : Si souris tissu-spécifique de rouge ou rouge sombre GECI ou GEVI seront disponibles pour une utilisation à la NMJ, ils peuvent servir à recueillir deux signaux dynamiques reflétant deux éléments cellulaires distincts à la NMJ.
6. Lorsque les expériences d’imagerie ou électrophysiologiques sont finis parce que les résultats escomptés ont été atteints, perfuse l’eau à travers les lignes de perfusion et aspirer l’eau 2 x - 3 x par le biais de l’électrode d’aspiration pour s’assurer que les sels ne construisent pas vers le haut.

4. exportation et analyse des données par une carte d’intensité de Fluorescence de l’écart-type (SD_iu16)

1. Enregistrez des séquences d’images enregistrées comme piles TIFF 16 bits et de les charger dans le système d’analyse données d’imagerie désiré pour l’analyse.
2. Dans le menu du logiciel 8D fichier, sélectionnez Image pile d’intérêt et cliquez pour charger.
   1. Une fois que la vidéo se charge, parcourir le temps d’identifier une section qui n’exerce aucune activité cellulaire fluorescente.
      Remarque : Cette région servira à créer un échantillon de fond.
   2. Maintenez MAJ enfoncée et cliquez pour tirer une région de la zone d’intérêt (ROI) dans la zone identifiée comme la zone de prélèvement de fond.
   3. Après avoir créé la zone, appuyez sur la barre d’espace pour générer une parcelle du changement de l’activité de fond.
   4. Faites un clic droit de la trace et sélectionnez l’option assorties de présenter l’option Vider le ROI sous forme de texte pour faire la trace dans un fichier de texte coordonnées xy.
3. Pour en revenir à la vidéo d’intérêt, Renumériser pour identifier la zone de temps où l’activité d’intérêt se produit.
   1. En utilisant le bouton central de la souris, sélectionnez cette région de temps dans la boîte jaune.
   2. Faites un clic droit sur la vidéo et sélectionnez Pile OPS , puis Stat carte option 5.
      Remarque : Cela va générer une carte d’écart-type (carte SD) dans la fenêtre de gauche.
   3. Cliquez sur la carte SD et ensuite sur le ] la touche x 19 à appliquer le plan de chaleur de couleur appropriée.
   4. Faites un clic droit de la carte SD et sélectionnez STM charger et enregistrer, qui présentera l’option Enregistrer stm comme tiff pour enregistrer la carte SD.
   5. Ensuite, appuyez sur la [ clé 19 x pour revenir à une carte de couleur en niveaux de gris.
   6. Appuyez sur C , puis D à mettre en place des outils de cartographie de la densité. En utilisant le bouton gauche de la souris et le bouton de la souris du centre, ajustez le seuil pour y inclure toute activité fluorescente indiquée sur la carte SD.
   7. Appuyez sur C pour fermer les outils densité tout en conservant les paramètres de seuil.
   8. Avec le bouton droit de la carte SD et sélectionnez les particules STM , puis Trouver PTCLS.
      Remarque : Ceci permettra d’identifier des cellules individuelles exprimant l’activité fluorescente.
   9. Faites un clic droit de la carte SD une fois de plus, puis sélectionnez Créer des ROIs de particules.
      Remarque : Cela va superposer les cellules sélectionnées sur la vidéo originale d’intérêt.
   10. Tout en maintenant Shift, faites un clic droit sur l’un de la particule maintenant identifié ROIs sur la vidéo originale.
   11. Sélectionnez marqueur ROI et mesure Int au ROI.
       Remarque : Cela génèrera les parcelles individuelles activité fluorescent pour chaque ROI identifié dans la vidéo d’intérêt. Ceux-ci peuvent être sauvés par un clic droit sur l’un d'entre eux et sélectionnant assortis, suivies d’un ROI Dump sous forme de texte.
4. Pour logique détaillée de ces opérations, veuillez consulter le fichier de code source⁹.

Plusieurs exemples de changements d’intensité de fluorescence, médiées par l’augmentation du Ca intracellulaire2 + dans les types de cellules déterminées de la NMJ, montrent l’utilité de cette approche. Ces résultats sont présentés sous forme de cartes d’intensité spatiale de fluorescence, qui fournissent la localisation des cellules ayant répondu au questionnaire, ainsi que l’intensité de leurs réponses, ce qui permet l’évaluation de combien les cellules réagissent et combien chaque cellule répond à un particulier stimulus. Par exemple, comme illustré à la Figure 1, nous avons pris vidéos des réponses2 + Ca chez une population de terminal/périsynaptique Schwann (TPSCs) des cellules à la NMJ du diaphragme d’un P7 Wnt1-Cre; GCaMP3 conditionnelle-exprimant la souris en réponse à la stimulation du nerf phrénique et identifié les sous-populations de cellules ayant répondu au questionnaire par des cartes d’intensité spatiale de fluorescence. Ces cartes d’intensité de fluorescence sont présentées comme chaleur cartes et code couleur selon une table de choix de couleur de feu (Fire CLUT). Nous avons enregistré ces vidéos avec et sans le découper l’image pour afficher simultanément les grappes de α-BTX-étiqueté ACHaRS au milieu de la membrane (vidéos 1 et 2), une approche qui pourrait être facilement adaptée pour capturer GECI dynamique ou GEVI réponses de deux distincts de cellules types, pourvu que chacun d’eux expose non-cumul spectres d’excitation et d’émission.

Dans la Figure 2, nous avons réalisé la même expérience de stimulation de nerf sur la membrane d’un P4 Myf5-Cre ; GCaMP3 conditionnelle-exprimant la souris et imagée les réponses du Ca2 + dans les cellules musculaires. Fait intéressant, lorsque nous avons utilisé le bloqueur de myosine BHC ou le spécifiques du muscle squelettique voltage-dépendants sodium channel blocker (Nav1.4) µ-conotoxine (Figure 2 a et 3 vidéo ou Figure 2 b et 4 vidéo, respectivement) , nous avons visualiséCa 2 + transitoires qui se déplacent le long de la fibre musculaire, ce qui représente l’action médiée par la libération de Ca2 + et potentielle du réticulum sarcoplasmique, ou simplement la longueur de la plaque d’extrémité de bande, ce qui représente la plaque de serrage médiée par des influx extracellulaire de Ca2 + grâce à l’ajout de AChR.In à identifier les sous-populations de cellules ayant répondants avec l’intensité de la fluorescence spatiale et potentiel des cartes (cartes SD), comme dans la Figure 1, nous avons aussi mesuré le changement en fluorescence au fil du temps dans une population de ces cellules musculaires avec spatio-temporelle (ST) des cartes. Chacune de ces expériences représente un type de cellule différente, une autre époque, un traitement différent (stimulation vs nerve stimulation nerveuse en présence de différentes drogues) et différents types d’analyse (spatiale et spatio-temporelle intensité de la fluorescence des cartes). Ces chiffres illustrent également une des fonctionnalités plus utiles des souris transgéniques exprimant le GCaMP, à savoir la capacité de stimuler à plusieurs reprises et le même échantillon d’image et, donc, tester l’effet des conditions de traitement différent.

Figure 1 : Mesure de l’activité-réponses induites par Schwann cell Ca2 + dans le diaphragme et le nerf phrénique de P7 Wnt1-Cre; souris GCaMP3 conditionnelle . (A) (à gauche) une image d’intensité de fluorescence moyenne, montrant un niveau de fluorescence en Schwann cellules le long des branches du nerf phrénique et à la jonction neuromusculaire (NMJ), a été capturée avant la stimulation nerveuse (Prestim). Les valeurs de cette fluorescence de fond ont été soustraites des valeurs de fluorescence obtenues après stimulation du nerf. (Droit) Une carte spatiale de la déviation standard des unités d’intensité de fluorescence de 16 bits (SDiu16) de Ca2 + réponses générées après 30 s de 40 Hz de la stimulation du nerf phrénique (Stim ou carte SD) montre une réponse robuste dans la borne/périsynaptique Schwann cellules (TPSCs) à la NMJ. Le feu CLUT heatmap est SDiu16 et la barre d’échelle est en microns. Toutes les images de panneaux B - E sont le même grossissement que ceux dans le groupe A. (B) (à gauche) le même diaphragme a été étiqueté avec 594 conjugué α-bungarotoxine (α-BTX), qui se lie aux étiquettes des récepteurs de l’acétylcholine (ACHaRS) et exciter avec vert/jaune pâle pour identifier la NMJ. (Droit) Ce panneau montre une image de fond clair de la membrane même, montrant l’extrémité d’une électrode d’enregistrement intracellulaire (flèche), qui peut être guidée vers un NMJ, issu des α-BTX étiquetage. (C), le Ca2 + transitoires caractéristiques (p. ex., intensité, survenue après la stimulation, durée) des cellules individuelles ou des groupes de cellules peuvent être évaluées en délimitant les différentes régions dans le plan de l’intensité spatiale sous forme de particules (à gauche), qui les représentent comme des régions d’intérêt (ROIs) et (D) traçant leurs intensités au fil du temps. (E), ce panneau montre des images de double longueur d’onde de GCaMP3 fluorescent Ca2 + réponses à médiation et NMJ 594-α-étiqueté de la membrane même en utilisant le séparateur d’image Gemini après une stimulation nerveuse. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1 : film sans image fractionnement de cellules de Schwann induite par l’activité Ca 2 + réponses à P7, tel que décrit en détail dans le Figure 1 légende. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Vidéo 2 : film avec image fractionnement de cellules de Schwann induite par l’activité Ca 2 + réponses et 594- Α-BTX-étiqueté ACHaRS à P7, tel que décrit en détail dans le Figure 1 légende. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Figure 2 : Mesure des réponses2 + Ca cellulaire induite par l’activité musculaire dans le diaphragme de P4 Myf5-Cre; souris GCaMP3 conditionnelle . (A) (gauche) CADH nicotiniques grappes de la bande de plaque de serrage situé au centre du diaphragme sont étiquetés avec 594-α-BTX. (Celle du milieu) Une carte spatiale de Ca2 + transitoires intensités (carte SD), obtenue après 30 s de 40 Hz de la stimulation du nerf phrénique en présence de l’inhibiteur de la myosine BHC, montre une réponse tout au long de l’ensemble de la région de toutes les cellules de muscle diaphragme. (Droit) En revanche, une carte SD, générée à partir de la membrane même après la stimulation même, mais en présence de la Nav1.4 antagoniste µ-conotoxine (µ-CTX), expose un plan spatial restreint réponse dans la région médiale du muscle de diaphragme tous les cellules qui correspond à la bande de plaque de serrage enrichie en cluster CADH. Le feu CLUT heatmap est SDiu16 et la barre d’échelle est en microns. (B), ce panneau affiche cartes spatio-temporelle de Ca2 + intensités transitoires au fil du temps (ST cartes) chez une population de cellules musculaires (y-axe) puis au fil du temps (x-axis). La barre d’échelle est en secondes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Vidéo 3 : film de cellulaire induite par l’activité musculaire Ca 2 + réponses en présence de l’inhibiteur de la myosine BHC à P4, tel que décrit en détail dans le Figure 2 a légende. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Vidéo 4 : film de cellulaire induite par l’activité musculaire Ca 2 + réponses en présence de la Na v 1.4 antagoniste µ-conotoxine à P4, tel que décrit en détail dans le Figure 2 b légende. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Les auteurs n’ont rien à divulguer.