Dit protocol beschrijft de verwijdering en de zuivering van de longslagader endotheliale cellen (PAECs), die aan de ballontips van Swan-Ganz katheters, voldoen terwijl ze worden ingeklemd in de longslagader tijdens het rechterdeel van het hart catheterisatie en blijven aanhangend aan de leeggelopen ballon na verwijdering van het lichaam van de patiënt.
Een verscheidenheid van pathologieën leiden tot pulmonale hypertensie (PH), die is gedefinieerd als een gemiddelde longslagader druk meer dan 25 mmHg onbeweeglijk. Om verder te diagnosticeren en beheren van PH, ondergaan patiënten herhaalde rechterdeel van het hart catheterizations (RHC) waarin een Swan-Ganz-katheter is gevorderd in een tak van de longslagader en een ballon is opgeblazen om de wig op het puntje van de katheter. Dit artikel illustreert een protocol waarbij longslagader endotheliale cellen (PAECs) kunnen worden geoogst uit de ballontips van Swan-Ganz katheters na RHC en gezuiverd met een anti-CD146 affiniteit kolom techniek voor het zuiveren van vermeende PAECs. Deze cellen kunnen worden gebruikt om een in situ momentopname van de biologische toestand van de pulmonaire therapieën endotheel ter aanvulling van hemodynamische metingen verkregen tijdens RHC. Geoogst en gezuiverde PAECs kunnen worden gebruikt voor beide celkweek of voor latere analytische testen zoals stroom cytometery.
Rechterdeel van het hart catheterisatie nodig huidige Amerikaanse en Europese richtsnoeren voor de diagnose van pulmonale hypertensie1. Artsen en wetenschappers proberen te begrijpen van deze ziekte verlangen biologische monsters van de pulmonaire therapieën als aanvulling op de hemodynamische gegevens die wordt verzameld tijdens RHC. Helaas, het risico van de pulmonaire vasculaire biopsie is zeer hoog, en daarom biologische monsters van de pulmonaire therapieën zijn zelden als ooit levende patiënten ondergaan RHC verkregen. Terwijl veel inzicht heeft opgedaan van pulmonaire vaatweefsel verkregen van dode foetussen of transplanteren longen, deze voorbeelden zijn niet in staat om na te denken van de biologie van het ziekteproces PH, zoals het in een levende patiënt ontvouwt zich. In 2013, we eerst gemeld dat longslagader endotheliale cellen (PAECs) zijn kale van de takken van de longslagader door fysiek contact met het topje van de ballon van de Swan-Ganz-katheter tijdens RHC, en in kleine aantallen van de katheter tips kunnen worden hersteld na de procedure2.
Dit artikel illustreert onze techniek voor de verwijdering en de zuivering van de longslagader endotheliale cellen (PAECs) van de ballontips van Swan-Ganz katheters na rechterdeel van het hart catheterisatie. Voorheen, de methodologie voor het uitvoeren van deze oogst techniek heeft zijn onvoldoende gedetailleerd beschreven in de literatuur voor uniforme resultaten tussen laboratoria voor het uitvoeren van de techniek. Dit artikel is bedoeld om het overwinnen van deze tekortkoming, het aanbieden van gevisualiseerde demonstratie van de techniek, uit bed collectie van katheter tips tot het definitieve product van gezuiverde CD146 + endotheliale cellen. Deze techniek moet steun ter bevordering van onderzoek in de pathobiology van verschillende etiologie van PH en eventueel leiden tot de ontwikkeling van nieuwe diagnostische tests ter aanvulling van hemodynamische gegevens verzameld tijdens RHC.
Het belang van deze techniek op het gebied van de pulmonaire vasculaire geneeskunde en onderzoek is dat het biedt toegang tot een momentopname van de biologie van de pulmonaire endotheel in situ, en in tegenstelling tot eerdere studies op transplanteren of dode foetussen longen, vormt geen een eindpunt voor de certificaathouder longkanker. Onlangs, hebben wij aangetoond dat een anti-apoptotic biomarker in deze cellen nut in nauwkeuriger fenotypering wellicht gerelateerde soorten pulmonale hypertensie3. De opbrengst van cellen verkregen is relatief klein, ~ 5, 000-25.000 PAECs per monster, en deze cellen zijn moeilijk (maar niet onmogelijk) aan cultuur. Wij zijn van mening dat slimme clinici en onderzoekers synergieën tussen deze metgezel technieken vindt om verder pulmonaire vasculaire onderzoek, diagnostiek en onderzoeksaanpak.
De techniek die in dit artikel beschreven wordt best gewaardeerd in het kader van eerdere experimentele paradigma’s voor de studie van de pulmonaire vasculaire endotheel. Eerdere pogingen om PAECs van de mens zijn beperkt tot transplanteren/dode foetussen longen5 en een korte poging om te ontwikkelen een katheter longslagader biopsie6staat. Zoals opgemerkt in een recente review7, is de huidige techniek Long weefsel oogst onderscheiden door haar vermogen om PAECs van een levend mens, en om dit te doen op meerdere tijdstippen in de progressie van de ziekte en/of therapie. Echter moet worden opgemerkt dat een metgezel techniek heeft onlangs gemeld waarbij geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPSCs) kunnen transdifferentiated in PAECs4,5. Deze techniek produceert overvloedige culturen van patiënt-specifieke PAECs en studie van de effecten van patiënt-specifieke genetische achtergrond op PAEC biologie staat. Ondanks deze voordelen biedt deze IPSC afkomstige PAECs geen inlichtingen over de interactie tussen lokale communicatie en patiënt-specifieke genetische achtergrond. Onze eigen groep heeft de opvatting dat de “cath tip” en de IPSC technieken waarschijnlijk synergie zijn bij het bevorderen van het veld8gepresenteerd.
In deze huidige en historische context, moeten de beperkingen van deze techniek worden opgemerkt. Ten eerste is het belangrijk op te merken dat de opbrengsten van PAECs die zijn afgeleid van deze methode kunnen aanzienlijk kunnen variëren. Vermoedelijk, patiënt-, ziekte staat – en arts-specifieke factoren bijdragen aan deze variabiliteit, zoals het protocol bevat geen stappen die zou leiden tot een groot verlies van het uitgangsmateriaal worden verwacht. Tabel 1 toont vertegenwoordiger die cd146 + opbrengsten uit een verscheidenheid van PAEC oogsten met behulp van tips van de katheter verkregen uit een verscheidenheid van patiënten met andere ziekte staten van pulmonale hypertensie en een breed scala operatoren van de arts. Ten tweede, de opbrengsten van de cel zijn algemene lage, en hun levensvatbaarheid voor cultuur heeft bewezen te zijn lager maar in onze handen. Terwijl eerder zijn we gegroeid culturen van PAECs met behulp van deze methode1, we nemen die resultaten vertegenwoordigen redding van een subset van voorlopercellen na die-off van de meeste van de steekproef en is alleen met tussenpozen succesvol in onze handen. Het is bijvoorbeeld niet ongebruikelijk om te vinden slechts een paar dozijn aanhanger PAECs in cultuur de ochtend na een oogst heeft zijn verguld. Deze micro-culturen overleven vaak niet tot uitbreiding. Verdere inspanningen vereist om dit protocol op een manier die zal blijven inspannen voor de levensvatbaarheid van de PAECs en hun omstandigheden in cultuur te bereiken van het gewenste doel van propagatie van patiënt-specifieke PAEC oogsten te optimaliseren. Tot slot uitsluiten de CD146 positieve selectie die hebben we aangepast niet verontreiniging met andere CD146 + cellen, zoals de circulerende endotheliale cellen4, pericytes, zachte spiercellen en zeldzame CD146 + T-cellen-9,10. Echter deze cellen worden geacht te zijn zeer gering in aantal in monsters die op deze manier, en CD146 is aanzienlijk meer specifiek voor dit protocol dan andere cel markers van endotheliale cellen zoals CD31 (die ook aanwezig zijn op een scala aan door bloed overgedragen cellen met inbegrip van bloedplaatjes11). Eventuele toekomstige verbeteringen ter verbetering van de specificiteit moeten worden afgewogen tegen hun potentieel negatief effect op de opbrengst.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs zou willen bedanken voor de artsen en ondersteunend personeel van de geavanceerde Heart Failure and pulmonale hypertensie service van Allegheny General Hospital voor de levering van honderden katheter monsters meerjarenaanpak die hebben vergemakkelijkt de optimalisatie van deze methodologie.
100mm culture dish | Fisher | NC9385690 | |
15 mL Centrifuge Tubes | Midsci | C15R | |
16% Formaldehyde | Fisher | PI28908 | |
50 mL centrifuge tubes | Midsci | C50R | |
Accutase | Thermo | A1110501 | cell detachment solution |
Cell Scraper | Fisher | 08-100-241 | |
Endothelial Cell Growth media | Cell Applications | 211-500 | |
Forceps | any | ||
Hemostat | any | ||
LoBind microfuge tube | Fisher | 13-698-794 | |
Miltenyi CD146 beads | Miltenyi | 130-093-596 | |
Miltenyi FCR blocker | Miltenyi | 130-059-901 | |
Miltenyi LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
Miltenyi magnet | Miltenyi | MidiMACS | |
Miltenyi RBC lysis buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
PBS | Fisher | BP2438-4 | |
Scissors | any | ||
Syringes | BD | 309597 |