Denne protokollen beskriver fjerning og rensing av lungearterien endotelceller (PAECs) som følger tipsballonger av Swan-Ganz katetre mens de er klemt fast i lungearterien under høyre hjerte catheterization og forbli tilhenger til den deflatert ballong etter fjerning fra pasientens kropp.
En rekke patologi føre til pulmonal hypertensjon (PH), som er definert som mener lungearterien presset overstiger 25 mmHg på resten. Videre diagnostisere og behandle PH, gjennomgår pasienter gjentatte høyre hjertet catheterizations (RHC) der en svane-Ganz kateter er rykket inn i en gren av lungearterien og en ballongen er oppblåst for å kile kateter spissen. Denne artikkelen beskriver en protokoll der lungearterien endotelceller (PAECs) kan være høstet fra tipsballonger av Swan-Ganz katetre etter RHC og renset med en anti-CD146 affinitet kolonnen teknikk å rense antatte PAECs. Disse cellene kan brukes til å gi en i situ øyeblikksbilde av biologiske lunge blodkar endotelet å utfylle hemodynamic mål oppnås under RHC. Høstes og renset PAECs kan brukes for enten cellekultur eller etterfølgende analytisk analyser som flyt cytometery.
Gjeldende amerikanske og europeiske retningslinjer krever riktig hjerte catheterization for diagnostisering av pulmonal hypertensjon1. Leger og forskere søker å forstå denne sykdommen ønsker biologiske prøver fra er lunge blodkar å utfylle hemodynamic dataene som er samlet under RHC. Dessverre risikoen forbundet med lunge vaskulær biopsi er svært høy, og derfor biologiske prøver av lunge blodkar er sjelden hvis noen gang fått fra levende pasienter som gjennomgår RHC. Mens mye innsikt har fått fra lunge vaskulær vev hentes fra cadaveric eller explanted lungene, disse prøvene er ikke reflektere biologi PH sykdommen prosessen som den utfolder seg i en levende pasient. I 2013 rapportert vi først at lungearterien endotelceller (PAECs) er blottet fra greinene av lungearterien fysisk kontakt med tipsboblen av Swan-Ganz kateter under RHC og kan gjenopprettes i små tall fra kateter tips etter prosedyren2.
Denne artikkelen illustrerer vår teknikk for fjerning og rensing av lungearterien endotelceller (PAECs) fra tipsballonger av Swan-Ganz katetre etter høyre hjerte catheterization. Hittil, har metodikk for å utføre denne harvest teknikken blitt beskrevet i tilstrekkelig detalj i litteraturen å sikre ensartet resultater mellom laboratorier utføre teknikken. Denne artikkelen er ment å overvinne denne mangel, tilbyr visualisert demonstrasjon av teknikken, fra sengen samling av kateter tips til det endelige produktet av renset CD146 + endotelceller. Denne teknikken bør hjelpe fremme forskning i pathobiology av ulike etiologies av PH, og muligens resultere i utviklingen av nye diagnostiske analyser å utfylle hemodynamic data samlet under RHC.
Betydningen av denne teknikken til lunge vaskulær medisin og forskning er at det gir tilgang til et øyeblikksbilde av biologi lunge endotelet i situ og i motsetning til tidligere studier på explanted eller cadaveric lungene, representerer ikke et sluttpunkt for emnet lunge. Nylig vi har vist at en anti-apoptotisk biomarkør i disse cellene kan ha nytte i mer presist phenotyping relaterte varianter av pulmonal hypertensjon3. Avkastningen av celler innhentet er relativt liten, ~ 5, 000-25,000 PAECs per prøve, og disse cellene er vanskelig (men ikke umulig) å kultur. Vi mener at smarte leger og forskere vil finne synergier mellom disse følgesvenn teknikker for å fremme lunge vaskulær forskning, diagnostikk og prognostics.
Teknikken er beskrevet i denne artikkelen er best verdsatt i sammenheng med tidligere eksperimentelle paradigmene for å studere lunge vaskulære endotelet. Tidligere forsøk på å hente PAECs fra mennesker har vært begrenset til explanted/cadaveric lungene5 og en kortvarig forsøk på å utvikle et kateter kan lungearterien biopsi6. Som nevnt i en fersk gjennomgang7, kjennetegnes stede teknikken fra lunge vev harvest av dens evne til å hente PAECs fra en levende menneske, og å gjøre det på flere tidspunkt i progresjon av sykdommen eller terapi. Det bør imidlertid bemerkes at en følgesvenn teknikk er nylig rapportert der indusert pluripotent stamceller (IPSCs) kan transdifferentiated i PAECs4,5. Denne teknikken gir rike kulturer av pasient-spesifikke PAECs og lar studie av virkningene av pasient-spesifikke genetisk bakgrunn på PAEC biologi. Til tross for disse fordelene gi disse IPSC-avledet PAECs ikke opplysninger om samspillet mellom lokale microenvironment og pasient-spesifikke genetisk bakgrunn. Vår egen gruppe har presentert den oppfatning at de “cath tips” og IPSC teknikker er vil være synergistisk fremme feltet8.
I denne nåværende og historiske sammenheng bemerkes begrensninger av denne teknikken. Først er det viktig å merke seg at rentene av PAECs fra denne metoden kan variere betraktelig. Antagelig pasient-, sykdom state – og lege-spesifikke faktorer bidrar til denne variasjon, som protokollen inneholder trinn som forventes å medføre store kildematerialet. Tabell 1 viser representant CD146 + gir en rekke PAEC avlinger utnytte kateter tips fra en rekke pasienter med ulike sykdom stater pulmonal hypertensjon og en rekke lege operatører. Andre cellen rentene er generelt lav, og sin levedyktighet for kultur har vist seg for å være lavere, men i våre hender. Mens tidligere har vi vokst kulturer av PAECs ved hjelp av denne metoden1, vi antar de resultatene representerer redningen av et delsett av progenitor celler etter die-off over det meste av prøven og er bare midlertidig vellykket i våre hender. For eksempel er det ikke uvanlig å finne bare noen få dusin tilhenger PAECs i kultur morgenen etter en avling er belagt. Ofte overleve disse mikro-kulturer ikke til utvidelse. Videre arbeid er nødvendig for å optimalisere denne protokollen på en måte som vil tåle levedyktigheten til PAECs og deres forhold i kultur å oppnå ønsket sikte på overføring av pasient-spesifikke PAEC avlinger. Til slutt, CD146 positive utvalget vi har tilpasset kan ikke utelate forurensning med andre CD146 + celler, som sirkulerer endotelceller4, pericytes, glatte muskelcellene og sjeldne CD146 + T celler9,10. Likevel, disse cellene antas å være svært få i prøver samlet på denne måten, og CD146 er betydelig mer spesifikt for denne protokollen enn andre cellen markører av endotelceller som CD31 (som er også til stede på en rekke blodbårne celler inkludert blodplater11). Alle fremtidige forbedringer å bedre spesifisitet bør balanseres mot deres potensielt negative innvirkning på avkastning.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke legene og støtte ansatte i tjenesten avansert hjertesvikt og pulmonal hypertensjon Allegheny General Hospital for levering av hundrevis av kateter prøver over flere år som lettet det optimalisering av denne metoden.
100mm culture dish | Fisher | NC9385690 | |
15 mL Centrifuge Tubes | Midsci | C15R | |
16% Formaldehyde | Fisher | PI28908 | |
50 mL centrifuge tubes | Midsci | C50R | |
Accutase | Thermo | A1110501 | cell detachment solution |
Cell Scraper | Fisher | 08-100-241 | |
Endothelial Cell Growth media | Cell Applications | 211-500 | |
Forceps | any | ||
Hemostat | any | ||
LoBind microfuge tube | Fisher | 13-698-794 | |
Miltenyi CD146 beads | Miltenyi | 130-093-596 | |
Miltenyi FCR blocker | Miltenyi | 130-059-901 | |
Miltenyi LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
Miltenyi magnet | Miltenyi | MidiMACS | |
Miltenyi RBC lysis buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
PBS | Fisher | BP2438-4 | |
Scissors | any | ||
Syringes | BD | 309597 |