Dans cette étude, nous présentons un protocole pour effectuer deux photons intravitale d’imagerie et de la cellule analyse des interactions dans la muqueuse trachéale murine après infection par le virus de la grippe. Ce protocole sera pertinent pour les chercheurs qui étudient la dynamique de cellules immunitaires lors d’infections respiratoires.
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Article de méthode
Imagerie cellulaire Interaction dans la muqueuse trachéale au cours de l’infection par le Virus grippal à l’aide de la microscopie intravitale biphotonique
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’analyse de cellule-cellule ou cellule-pathogen interactions in vivo est un outil important pour comprendre la dynamique de la réponse immunitaire à l’infection. Microscopie intravitale biphotonique (2p-IVM) permet l’observation des interactions entre les cellules dans les tissus profonds dans les animaux vivants, tout en minimisant le photoblanchiment généré lors de l’acquisition de l’image. A ce jour, différents modèles pour 2p-IVM des organes lymphoïdes et non lymphoïdes ont été décrits. Toutefois, l’imagerie des organes respiratoires reste un défi en raison de la circulation liée au cycle de respiration de l’animal.
Nous décrivons ici un protocole afin de visualiser in vivo des cellules immunitaires des interactions dans la trachée chez des souris infectées avec le virus de la grippe à l’aide de 2p-IVM. À cette fin, nous avons développé une plate-forme d’imagerie personnalisée, qui comprenait l’exposition chirurgicale et l’intubation de la trachée, suivie de l’acquisition des images dynamiques des neutrophiles et les cellules dendritiques (DC) dans l’épithélium muqueux. En outre, nous avons détaillé les étapes nécessaires à l’exercice de la grippe par voie nasale infection et flux analyse cytométrique des cellules immunitaires dans la trachée. Enfin, nous avons analysé les neutrophiles et la motilité DC ainsi que leurs interactions au cours d’un film. Ce protocole permet la génération d’images 4D stable et lumineux nécessaire pour l’évaluation des interactions cellule-cellule dans la trachée.
Introduction
La microscopie intravitale biphotonique (2p-IVM) est une technique efficace pour d’imagerie en temps réel des interactions cellule-cellule lorsqu’ils se produisent dans leur environnement naturel1. L’un des principaux avantages de cette méthode est qu’elle permet l’étude des processus cellulaires à une plus grande profondeur de l’échantillon (500 µm à 1 mm) par rapport aux autres de techniques d’imagerie traditionnelle2. Dans le même temps, l’utilisation de deux photons de faible énergie générée par le laser à deux photons minimise la photo-lésions tissulaires généralement associées à l’image acquisition processus
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Protocole
Toutes les procédures animales portant sur des souris ont été effectuées conformément aux directives de l’Office vétérinaire fédéral suisse et protocoles animales ont été approuvées par les autorités de vétérinaire local.
1. influenza Infection des souris CD11c-YFP
- Prévention des risques biotechnologiques
Remarque : La souche de souris adaptée de la grippe H1N1 Rico/8/34 A/Puerto (PR8) a été cultivée dans des oeufs fécondés, purifiée et titrée comme décrit précédemment21. Toutes les opérations impliquant des animaux infectés ou des échantillons biologiques ont été effectuées sous une arm....
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Résultats
Dans cet ouvrage, nous décrit un protocole détaillé pour l’étude in vivo la motilité et les interactions entre les neutrophiles et DC au cours de l’infection grippale dans la trachée murine (Figure 3 a). À cette fin, nous avons isolé les neutrophiles CFP+ (92 % de pureté ; Figure 3 b) de CK6-ECFP souris et nous Moutschen transférés dans une souris CD11c-YFP contaminée par un virus. Après cela, nous avons réali.......
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Discussion
Cet ouvrage présente un protocole détaillé pour la génération d’images de 4D montrant la migration des neutrophiles Moutschen transférés et de leurs interactions avec les DC lors d’une infection grippale dans la trachée de souris. Le modèle décrit 2p-IVM sera pertinent d’étudier la dynamique de cellules immunitaires lors d’une infection des voies respiratoires.
Récemment, plusieurs modèles basés sur la visualisation dynamique de cellules dans les voies aériennes ont été développés
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par les subventions de la Fondation National Suisse (FNS) (176124, 145038 et 148183), la Commission européenne Marie Curie réinsertion Grant (612742) et le SystemsX.ch une subvention pour la D.U.P. (2013/124).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Gigasept instru AF | Schü ; lke & Mayr GmbH | Solution à 4 % | |
| Souris CD11c-YFP | Laboratories | 008829 | souris ont été élevées en interne |
| Souris CK6-ECFP | Laboratories | 004218 | souris ont été élevées en interne |
| 1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline modifié sans chlorure de calcium et chlorure de magnésium | Sigma | D8537-500ML | |
| 10x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline modifié sans chlorure de calcium et chlorure | de magnésium Sigma | D1408-500ML | |
| Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L | Stocker à 4° ; C |
| Ketamin Labatec Labatec | Pharma | 7680632310024 | Magasin à RT, magasin à 4 ° ; C en solution d’un mélange ket/xyl |
| Rompun 2 % (xylazine) | Bayer | 6293841.00.00 | Conserver à RT, conserver à 4 ° ; C en solution de mélange ket/xyl |
| 26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak 305501 | ||
| 30 g, 0,3 mL BD Seringues à insuline microfines | BD | 324826 | |
| Falcon 40 & micro ; m Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Seringues 2 mL | BD Plastipak | 300185 | |
| Microlance 3x 18 G aiguilles | BD | 304622 | |
| Introcan Safety 20 G (cathéter) | Braun | 4251652.01 | |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| RPMI medium 1640 + HEPES (1x) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | Magasin à 4° ; C |
| liberase TL Research Grade | Roche | 5401020001 | Se stocker à -20 ° ; Mélange C/collagénase (I et II) |
| DNAse I | Amresco (VWR) | 0649-50KU | Stocker à -20 ° ; C |
| CellTrace Coloration violette | ThermoFisher Scientific | C34557 | Conserver à -20 ° ; C |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| Sérum de Bovin Fœtal | Gibco | 10270-106 | Conserver à -20 ° ; C |
| PE-10 Micro Tube Médical | 2Biological Instruments SNC | #BB31695-PE/1 | |
| Ruban Plastique Chirurgical | M Plast | ||
| Viscotears | Bausch & Lomb | Store at RT | |
| Plasticine | Ohropax | ||
| High Tolerance Glass Coverslip 15 mm Round | Warner Instruments | 64-0733 | |
| SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
| Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
| MiniTag (anesthésie gazeuse et banc chauffant) | Tem Sega | ||
| SURGICAL BOARD | Université de Berne | ||
| TrimScope II Microscope à deux photons | LaVision Biotec | ||
| Chameleon Vision Ti :Sa lasers | Coherent Inc. | ||
| Objectif d’immersion dans l’eau 25X NA 1.05 | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| The Cube& La boîte Chambre d’incubation et régulateur de température | Life imaging Services | ||
| Imaris 9.1.0 | Bitplane | Logiciel d’imagerie | |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | Logiciel statistique |
Références
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Fein, M. R., Egeblad, M.....
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Réimpressions et autorisations
Mots-clés
Imagerie de la muqueuse trach aleInteraction entre neutrophiles et cellules dendritiquesAnalyse par cytom trie en fluxExposition chirurgicale de la trach eInfection intranasale par la grippeIsolation des neutrophiles de la moelle osseuseGradient de densit PercollAnalyse de la motilit des cellules immunitaires
