Surveillance non invasive de la taille de la lésion dans un modèle murin hétérologues d’endométriose

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour vivre-imagerie des fragments de l’endomètre humains fluorescent étiquetés greffés chez des souris. La méthode permet d’étudier les effets des médicaments de choix sur la taille de la lésion endometriotic grâce à la surveillance et la quantification de la fluorescence émise par le journaliste fluorescent en temps réel

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour la mise en œuvre d’un modèle de souris hétérologues dans lequel la progression de l’endométriose peut être évaluée en temps réel grâce à une surveillance non invasive de la fluorescence émise par le tissu endométrial humain ectopique implanté. À cette fin, biopsie de l’endomètre humain proviennent de don d’ovocytes en cours de donateurs femmes. Des fragments de l’endomètre humains sont cultivées en présence de l’adénovirus machinés pour cDNA express pour le mCherry de protéine fluorescente de journaliste. Après visualisation, étiqueté tissus avec un taux optimal de fluorescence après infection sont par la suite choisi pour l’implantation chez les bénéficiaires. Une semaine avant la chirurgie d’implantation, souris bénéficiaires sont chez et pastilles d’estradiol sont placés par voie sous-cutanée pour soutenir la survie et la croissance des lésions. Le jour de la chirurgie souris sont cavité péritonéale et anesthésiée, accédée via une incision de petite taille (1,5 cm) de la linea alba-. Les implants fluorescent étiquetés sont épilés, brièvement trempés dans la colle et attachées à la couche péritonéale. Incisions sont suturées et animaux à gauche pour récupérer pendant quelques jours. Fluorescence émise par les implants endometriotic est habituellement non invasive surveillé tous les 3 jours pendant 4 semaines avec un système d’imagerie in vivo. Variations de la taille des implants endometriotic peuvent être estimées en temps réel par quantification du signal mCherry et normalisation contre le temps-point initial indiquant l’intensité de la fluorescence maximale.

Les rongeurs précliniques traditionnelles des modèles de l’endométriose ne permettent pas la surveillance non invasive de la lésion en temps réel mais plutôt permettent une évaluation des effets des médicaments testés à la fin. Ce protocole permet de suivre en temps réel des lésions et est plus utile d’explorer le potentiel thérapeutique des médicaments dans les modèles précliniques de l’endométriose. La principale limitation du modèle ainsi produite est que surveillance non invasive n’est pas possible sur de longues périodes de temps en raison de l’expression épisomiques d’Ad-virus.

Introduction

L’endométriose est une affection gynécologique chronique initiée par l’implantation de l’endomètre fonctionnel en dehors de la cavité utérine. Les lésions ectopiques croissent et induisent des processus inflammatoires, conduisant à la chronique pelvienne douleur et l’infertilité¹. On estime que vers le haut à 10 – 15 % des femmes en âge de procréer sont influencés par endometriosis2, et elle est présente dans environ 40 – 50 % des femmes infertiles³. Les traitements pharmacologiques actuels pour l’endométriose sont incapables d’éradiquer complètement les lésions et pas sans effets secondaires⁴

Protocole

L’utilisation d’échantillons de tissus humains a été approuvée par l’Institutional Review Board et le Comité d’éthique de l’Hospital Universitario La Fe. Consentement éclairé a fourni tous les patients. L’étude impliquant des animaux a été approuvé par le Comité institutionnel de protection Animal au Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia, et toutes les procédures ont été réalisées suivant les directives pour le soin et l’utilisation des mammifères auprès des instituts nationaux de la santé.

1. pré-traitement et Collection de tissu endométrial

1. Obtenir une biopsie de bonne qualité d’aspiration l’endomètre humaine en ut....

Résultats

Nous décrivons ici le processus de création d’un modèle hétérologue d’endométriose dans lequel l’architecture des lésions est préservée par l’implantation de fluorescent étiquetés morceaux d’endomètre humain dans des souris immunodéficientes, permettant ainsi non invasif suivi de la progression de la lésion. Étiquetage des fragments de l’endomètre est réalisée par l’infection à adénovirus machinés pour express mCherry, une protéine à l’émission de fluorescence dans la région infrarouge pr.......

Discussion

Le protocole détaillé ci-après décrit la mise en œuvre d’un modèle animal de l’endométriose, dont l’architecture d’implantation architecture des lésions est préservée tout en permettant simultanément en temps réel de la fluorescence émise par mCherry marqués de tissu endométrial. Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation d’un appareil d’imagerie in vivo spécifique et des logiciels d’évaluation non invasive fluorescence émise par la lésion étiquetée. Chaque utilisateur doit adapter le protocole selon le périphérique.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Endosampler & commerce ;	Medgyn	22720	Canule pour le prélèvement de l’endomètre utérin
DMEM Medium	VWR	HYCLSH30285. FS	Medium
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767	Vecteur adénoviral exprimant mCherry
PBS, 1x solution, stérile, pH 7,4	VWR	E504-500ML	Tampon pour lavages
Granulés 17-B-Estradiol 18 mg/60 jours	Innovative Research of America	SE-121	Granulés d’hormones pour rongeurs
Vetbond&trade ; Adhésif tissulaire	3M	780-680	Adhésif tissulaire
Boîtes de Pétri en cristal de polystyrène	Levantina	367-P101VR20	Boîtes de
Pétri Pénicilline-Streptomicine	Sigma	P4333-100ML	Antibiotiques
Seringues médicales 10 mL 0,5 ml	VWR	CODA626616	Seringues
Gants en nitrile, non poudrés	Gants VWR	112-2754
Souris nues suisses douces	Charles River	SNUSSFE05S	Souris pour l’expérimentation animale
Ivis Spectrum Système d’imagerie In vivo	Perkin Elmer	124262	Équipement de surveillance In vivo
Living Image® ; (Logiciel Ivis)	Perkin Elmer	---	Logiciel de surveillance in vivo
Sérum de veau fœtal	Gibco	10082147	Sérum d’enrichissement
Plaques traitées pour culture cellulaire à 96 puits Technologies	de la vie 167008		Plaques de culture
Fioles d’urine	Summedical	4004-248-001	Fioles pour lavages Lames chirurgicales
stériles	(Division Aesculap) Sanycare	1609022-0008	Lames chirurgicales
Isovet 1 000 mg/g	B-BRAUN		Isoflurane (Anesthésique)
Buprex® ; 0,3 mg	Schering Plough S.A.	---	Buprénorphine (solution analgésique)
Solution de morphine injectable 10 mg/mL	B BRAUN		Morphine (solution analgésique)
Monofyl® ; Sutures résorbables	COVIDIEN		Sutures
Desinclor chlorhexidine	Promedic SA		Solution antiseptique
Microscopie DMi8	Leica Mycrosystems	---	fluorescence
Hera Cell 150 Incubateur	Thermo Scientific	51026282	Incubateur

------------microscope à