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Article de méthode

Nettoyage catalytique de plante oxygénées espèces In Vivo par des nanoparticules d’oxyde de cérium anioniques

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DOI :

10.3791/58373

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26 août 2018

 ,  ,  , 
1Department of Botany and Plant Sciences, University of California, 2Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour la synthèse et la caractérisation des nanoparticules d’oxyde de cérium (nanoceria) BR (espèces réactives de l’oxygène) nettoyage en vivo, nanoceria d’imagerie dans les tissus végétaux par microscopie confocale et in vivo surveillance de nanoceria ROS lessivage par microscopie confocale.

Résumé

Accumulation de réactives de l’oxygène (DRO) est une caractéristique de la réponse des plantes aux stress abiotiques. ROS jouer un double rôle chez les plantes en agissant comme des molécules à de faibles niveaux de signalisation et d’endommager les molécules à des niveaux élevés. Accumulation de ROS dans les plantes stressées peut endommager les métabolites, enzymes, les lipides et l’ADN, provoquant une diminution de la croissance des plantes et des rendements. La capacité des nanoparticules d’oxyde de cérium (nanoceria) pour piéger catalytiquement ROS en vivo fournit un outil unique pour comprendre et la tolérance au stress abiotique bioingénieur plante. Nous présentons ici un protocole pour synthétiser et caractériser les nanoceria enduit acide poly (acrylique) (PNC), interface des nanoparticules avec plantes par infiltration du limbe foliaire et surveiller leur distribution et ROS nettoyage in vivo à l’aide de confocal microscopie. Cours outils moléculaires pour manipuler les accumulation de ROS dans les plantes se limitent aux espèces modèles et nécessitent des méthodes de transformation laborieuse. Ce protocole pour in vivo ROS nettoyage a le potentiel pour être appliquée aux plantes de type sauvage avec des feuilles larges et structure de la feuille comme thaliana d’Arabidopsis.

Introduction

Nanoparticules d’oxyde de cérium (nanoceria) sont largement utilisés dans les organismes vivants, de la recherche fondamentale à la bio-ingénierie, en raison de leurs espèces distinctes catalytique réactives de l’oxygène (ROS) nettoyage capacité1,2,3. Nanoceria ai ROS nettoyage capacités en raison d’un grand nombre de places de surface d’oxygène qui alternent entre deux oxydation États (Ce3 + et Ce4 +) 4,5,6. Ce3 + ballants obligations piéger efficacement ROS, tandis que les souches de réseau à l’échelle nanométrique favoriser la régénération de ces sites de défaut via redox réactions7de cyclisme. Nanoceria ont également été récemment utilisé pour l’étude et ingénierie végétale fonction8,9. Plantes sous stress abiotique expérience accumulation de ROS, causant des dommages oxydatifs à lipides, protéines et ADN10. Chez les plantes Arabidopsis , nanoceria nettoyage catalytique des ROS dans vivo mène à la photosynthèse végétale améliorée sous forte luminosité, chaleur et froid souligne8. L’application nanoceria dans le sol aussi augmentations shoot de rendement biomasse et grain de blé (Triticum aestivum)11; des plants de canola (Brassica napus) traités par nanoceria ont une plus grande biomasse de plantes sous stress salin,12.

Nanoceria offrent des bioingénieurs et planter des biologistes un outil basés sur la nanotechnologie afin de comprendre les réactions au stress abiotique et améliorer la tolérance au stress abiotique plante. En vivo ROS nettoyage capacités de Nanoceria est indépendants des espèces de plantes, et la livraison facile dans les tissus de la plante a le potentiel pour permettre à une application générale en dehors des organismes modèles. Contrairement aux autres méthodes génétiquement, nanoceria ne nécessitent pas de générer les lignes de la plante avec la surexpression des enzymes antioxydantes supérieures br nettoyage capacité13. Infiltration de limbe foliaire de nanoceria aux plantes est une approche pratique pour la recherche en laboratoire.

L’objectif général du présent protocole est de décrire 1) la synthèse et la caractérisation de poly chargée négativement (acrylique) acide nanoceria (PNC), 2) la livraison et la suivi des PNC dans les cellules de la feuille et 3) le contrôle de PNC-activé ROS nettoyage en vivo. Dans ce protocole, poly chargée négativement (acrylique) acide nanoceria (PNC) sont synthétisés et caractérisés par leur spectre d’absorption, diamètre hydrodynamique et potentiel zêta. Nous décrivons une méthode d’infiltration lamina feuille simple pour livrer des PNC en usine de tissus foliaires. En vivo imagerie des nanoparticules de distribution dans les cellules du mésophylle, un colorant fluorescent (DiI) a été utilisé pour étiqueter les PNC (DiI-PNC) et observer les nanoparticules par microscopie confocal fluorescence. Enfin, nous expliquons comment surveiller en vivo PNC ROS fouillant dans la microscopie confocale.

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Protocole

1. la culture de plantes a. thaliana

  1. Semer les graines d’Arabidopsis en pots jetables de 5 cm x 5 cm remplis de mélange de terre standard. Mettre 32 de ces pots dans un bac en plastique rempli d’eau (~ 0,5 cm de profondeur) et transférer le plateau en plastique avec les plantes dans une chambre de croissance des plantes.
    1. Régler la croissance chambre comme suit : 200 µmol/ms photosynthétique active radiation (PAR), 24 ± 1 ° C jour et 21 ± 1 ° C la nuit, 60 % d’humidité et régime de lumière jour/nuit 14/10 h, respectivement.
  2. Mince de chaque pot pour laisser seule plante individuelle après une semaine de la germination. Prenez note de garder les plants ayant les mêmes taille dans chaque pot.
  3. Les pots d’eau de couler l’eau du robinet directement sur le plateau en plastique tous les deux jours. Cultiver les plantes pendant quatre semaines. A. thaliana plantes sont prêts pour une utilisation ultérieure.

2. synthèse et caractérisation de PNC

  1. Environ 1,08 g de nitrate de cérium (III) et dissoudre dans 2,5 mL d’eau de qualité biologie moléculaire dans un tube conique de 50 mL.
  2. Environ 4,5 g d’acide poly (acrylique) et dissoudre dans 5 mL d’eau de qualité biologie moléculaire dans un tube conique de 50 mL.
  3. Mélanger ces deux solutions soigneusement à 2 000 tr/min pendant 15 min à l’aide d’un mélangeur vortex numérique.
  4. Transfert de 15 mL de solution d’hydroxyde d’ammonium (7,2 M) dans un bécher de verre de 50 mL.
  5. Tout en remuant à 500 tr/min, ajouter le mélange de l’étape 2.3 goutte à goutte la solution d’hydroxyde d’ammonium et remuez à 500 tr/min à température ambiante pendant 24 heures dans une hotte de laboratoire.
  6. Couvrir le bécher avec un morceau de papier afin d’éviter la perte importante de la solution lors de la réaction pendant la nuit.
  7. Après 24h, transvaser la solution obtenue dans un tube conique de 50 mL et il centrifuger à 3 900 g pendant 1 h enlever tout débris possible et gros agglomérats.
  8. Transférer cette 22,5 mL de la solution surnageante dans trois filtres de 15 mL 10 kDa et remplir le reste du filtre avec l’eau de qualité moléculaire pour réaliser une dilution totale de 45 mL.
  9. Purifier la solution surnageante de polymères libres et autres réactifs avec une centrifugeuse de paillasse en ajoutant le surnageant dans un filtre de 15 mL 10 kDa et centrifuger à 3 900 x g pendant 15 min. Répétez cette étape au moins six fois.
  10. Mesurer l’absorbance de l’éluant à chaque cycle avec un spectrophotomètre UV-VIS de 220 à 700 nm pour n’assurer aucun libres polymères et autres réactifs sont présents dans la solution finale de la PNC.
  11. Tenir la seringue de 5 mL de la solution PNC recueillie et filtrez-le contre un filtre de seringue de taille de pore nm 20. Recueillir la solution filtrée de la PNC dans un tube conique de 50 mL.
  12. Prenez une solution diluée de PNC finale dans une cuvette en plastique et mesurer l’absorbance avec le spectrophotomètre UV-VIS de 220 à 700 nm. PIC d’absorbance PNC est à 271 nm.
  13. Calculer la concentration en utilisant la Loi de Beer-Lambert : A = εCL. A est l’absorbance de la valeur de crête pour un échantillon donné, ɛ est le coefficient d’absorption molaire du PNC (cm-1 M-1), L est la longueur du trajet optique (largeur de la cuvette, 1 cm de cette méthode), et C est la concentration molaire de nanoparticules mesurées.
  14. Mesurer le diamètre hydrodynamique et le potentiel zêta de la PNC synthétisée à l’aide d’un analyseur potentiel particules taille et zeta (Figure 1).
  15. Conserver la solution finale de la PNC dans un réfrigérateur (4 ° C) jusqu'à l’utilisation ultérieure.
    Remarque : Veuillez vous référer à Wu et al. 8 pour plus de détails sur la caractérisation de la PNC protocole.

3. étiquetage des PNC par DiI agent Fluorescent

  1. Mélanger 0,4 mL de 5 mM (58 mg/L) PNC avec 3,6 mL de biologie moléculaire, l’eau de qualité dans un flacon de verre de 20 mL et remuez à 500 tr/min.
  2. Ajouter 24 µL 1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tétraméthylindocarbocyanine solution de colorant perchlorate (DiI, 2,5 mg/mL ; diluées dans le DMSO) dans 176 µL de DMSO (diméthyl sulfoxyde) de faire la solution de colorant DiI.
  3. Ajouter le colorant DiI goutte à la solution de la PNC, en remuant à 1 000 tr/min pendant 1 min à température ambiante.
  4. Transférer ce mélange qui en résulte dans un filtre de 15 mL 10 kDa et de remplir le tube vers le haut avec l’eau de qualité biologie moléculaire pour réaliser la dilution au totale 15 mL.
  5. Purifier le DiI étiqueté solution PNC (DiI-PNC) de DMSO et n’importe quel colorant de DiI libre possible par une centrifugation de benchtop avec le filtre de kDa 15 mL 10 à 3 900 x g pendant 5 min.
    1. Répétez l’étape 3.5 au moins cinq fois.
  6. Les solutions de DiI-PNC finales filtrer sur un filtre de seringue de taille de pore nm 20.
  7. Mesurer l’absorbance de final DiI-PNC par spectrophotométrie UV-visible et calculer sa concentration selon la Loi de Beer-Lambert (Figure 2). Pour plus de détails, voir étape 2.13.
  8. Conserver au réfrigérateur à 4 ° C pour une utilisation ultérieure.

4. infiltration d’usine de feuilles avec des PNC

  1. Ajouter 0,1 mL d’infiltration tampon (100 mM TES, 100 mM MgCl2, pH 7.5, ajusté par HCl) dans 0,9 mL de solution PNC ou DiI-PNC de 0,5 mM et vortex il. Utilisez une solution de tampon de l’infiltration de TES 10 mM comme témoin négatif.
  2. Transférer 0,2 mL de la solution d’infiltration PNC ou DiI-PNC à une seringue sans aiguille stérile de 1 mL. Robinet pour enlever les bulles d’air possible.
  3. Récupérer l’usine de la chambre de croissance juste avant infiltration avec des nanoparticules pour éviter la fermeture des stomates possible en conditions de luminosité ambiante.
  4. Avant infiltration, mesurer la teneur en chlorophylle des feuilles d’a. thaliana avec une taille similaire à l’aide d’un compteur de chlorophylle. Mesurer chaque feuille avec trois répétitions (chaque réplicat composé d’au moins trois mesures)14. Choisissez que l' Arabidopsis quitte avec la teneur en chlorophylle similaire pour l’expérience de l’infiltration.
  5. Infiltrez les feuilles lentement avec la solution récemment préparée de PNC ou DiI-PNC en appuyant doucement sur l’embout de la seringue sans aiguille contre la partie inférieure du limbe foliaire (côté abaxial) et appuyer sur le poussoir (Figure 3A).
  6. Doucement essuyer l’excédent de solution qui reste sur la surface du limbe de la feuille (Figure 3B) à l’aide d’un essuie-glace de tâche délicate (Figure 3C) et l’étiquette de la plante. Utiliser nouvelle tâche délicate lingettes pour chaque groupe de feuilles.
  7. Gardez les infiltrés a. thaliana plantes sur le banc pour adaptation de feuilles et d’incubation avec le PNC ou DiI-PNC pendant 3 h.
    NOTE : Infiltrés a. thaliana plantes sont alors prêts pour une utilisation ultérieure (Figure 3D).

5. préparation des échantillons de feuilles pour la microscopie confocale

  1. Rouler une quantité de la grosseur d’un pois de l’observation de gel à un rayon de 1 cm (Figure 4A) et puis l’étaler jusqu'à ce qu’il est de 1 mm d’épaisseur sur une lame de verre (Figure 4B).
  2. Utiliser un perce-bouchon (diamètre 0,3 cm) découper une section circulaire au centre du gel d’observation sur la lame de verre (Figure 4C).
  3. Remplissez la coupe bien entièrement avec perfluorodecalin (VFI) pour plus profonde et mieux confocale résolution d’imagerie dans les tissus foliaires.
  4. Utiliser un perce-bouchon (diamètre 0,2 cm) pour recueillir des disques foliaires de la DiI-PNC adaptée infiltré chez a. thaliana plantes (Figure 4D).
  5. Monter le disque de feuille dans le PFD rempli bien ; relever le côté (abaxial) infiltré de la feuille.
  6. Mettre une lamelle carrée sur le dessus le disque de feuille et appuyez doucement sur la lamelle couvre-objet diapositive uniformément à sceller avec le puits du gel d’observation et d’assurer qu'aucune bulle d’air ne reste piégés (Figure 4E).

6. l’imagerie DiI-PNC dans les tissus foliaires par microscopie confocale

  1. Utilisez un objectif de 40 X à un microscope confocal à balayage laser inversé.
  2. Déposer deux à trois gouttes de ddH2O sur le dessus de l’objectif X 40.
  3. Placez la diapositive d’échantillon foliaire de DiI-PNC infiltré préparée sur le dessus de l’inversé 40 X objectif grand-angulaire.
    1. Assurez-vous que le côté de la lamelle couvre-objet, mais pas le verre glisser contact directement avec les ddH2O sur la lentille.
  4. Trouver une région d’intérêt dans l’échantillon au microscope avec lumière laser ou champ lumineux.
  5. Lancez le logiciel de microscope et allumer le laser Argon (fixé à 20 %).
  6. Définissez le sténopé pour recueillir une optique tranche inférieure à 2 µm et une moyenne de ligne de 4.
  7. L’image de l’échantillon avec les paramètres de microscope confocal : excitation de laser 514 nm (30 %) ; Épaisseur de coupe Z-pile : 2 µm ; PMT1 : 550-615 nm (pour l’imagerie DiI-PNC) ; PMT2 : 700 à 800 nm (pour l’imagerie des chloroplastes).
  8. Prendre des images confocales représentatifs d’échantillons de feuilles de différentes personnes, un minimum de trois réplicats biologiques.

7. l’imagerie PNC en vivo ROS lessivage par microscopie confocale

  1. Préparer 25 µM 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacétate (H2DCFDA, un colorant pour indiquer un ROS générales) et 10 µM dihydroethidium (DHE, un colorant pour indiquer l’anion superoxyde) colorants dans le tampon de l’infiltration de TES (pH 7.5) dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL, séparément.
  2. Utiliser un perce-bouchon (diamètre 0,2 cm) pour recueillir les feuilles disques de la PNC adaptée se sont infiltrés dans les plantes Arabidopsis .
    1. Le bout pointu de la pince permet d’effectuer trois ou quatre trous dans les disques foliaires pour accélérer le processus de chargement de colorant.
  3. Transfert la feuille disques à tubes de microcentrifuge avec H2DCFDA et DHE séparément et incuber pendant 30 minutes dans l’obscurité.
  4. Après incubation, rincer la feuille disques avec FD2O trois fois et Mont dans le verre glisser avec observation de gel (voir protocole Section 5).
  5. Mettre la lame sur la microscopie confocale et mise au point manuelle à une zone de cellules du mésophylle foliaire. Voir protocole Section 6 pour plus de détails.
  6. Exposer les disques foliaires pour les UV-A (405 nm) laser pendant 3 min générer les ROS et enregistrer le changement d’intensité de signal ROS en série chronologique (« xyt ») par disque de feuille.
  7. Image du disque de feuille avec des paramètres de microscope confocal : 40 X eau objectif ; excitation de laser 496 nm ; PMT1 : 500-600 nm (pour détection colorant DHE et DCFDA) ; PMT2 : 700 à 800 nm (pour la détection des chloroplastes). Utiliser une plante infiltrée avec seulement la solution tampon infiltration comme contrôle négatif.

8. PNC nettoyage de H2O2in vitro

  1. Exercer l’activité mimétique de CAT (catalase) du synthétisées PNC in vitro en suivant les méthodes précédentes publications3,8,15
  2. Ajouter 45,4 µL d’infiltration de x TES 1 tampon (10 mM TES, 10 mM MgCl2, pH 7.5, ajusté par HCl), PNC (60 nM, 3 µL) et H2O2 (2 µM, 1 µL) dans un puits (puits plaque de fond rond blanc 96) et le mélanger doucement en pipettant également.
  3. Ajouter 10-acétyl-3, 7-dihydroxyphenoxazine (travail concentration 100 µM, 0,5 µL) et la peroxydase de raifort (HRP ; travail concentration 0,2 U/mL, 0,1 µL) dans le puits, doucement mélangez-le en pipettant également et il incuber pendant 30 min. 10-acétyl-3, 7-dihydroxyphenoxazine réagit avec H2O2 et est convertie en résorufine en présence de la HRP.
    1. Enrouler la plaque avec du papier aluminium pour éviter la lumière durant l’incubation.
    2. Préparer un contrôle négatif en utilisant le tampon de réaction ou de l’eau en remplacement de H2O2.
    3. À l’exception de la solution mère, préparer toutes les autres solutions à température ambiante.
  4. Après l’incubation, avec un lecteur de plaque, surveiller l’absorbance à 560 nm à utiliser résorufine pour indiquer le niveau de H2O2. Régime de l’heure définie à 0, 2, 5, 10, 20 et 30 min.

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Résultats

Caractérisation et synthèse PNC .
PNC ont été synthétisés, purifié et caractérisé suivant la méthode décrite dans la Section 2 du protocole. Figure 1 A montre la coloration des solutions de nitrate de cérium, AAP, le mélange de nitrate de cérium et AAP et PNC. Un changement de couleur du blanc au jaune clair est vu après que PNC est synthétisé. Après purification avec un filtre de 10 kDa, PNC ont ...

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Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons les PNC synthèse, caractérisation, étiquetage de colorant fluorescent et imagerie confocale des nanoparticules dans les cellules du mésophylle plante à exposer leur en vivo ROS activité anti-radicalaire. PNC sont synthétisés à partir d’un mélange de nitrate de cérium et AAP solution hydroxyde d’ammonium. PNC sont caractérisés par la spectrophotomery de l’absorption et la concentration déterminée à l’aide de la Loi de Beer-Lambert. Mesures de potentiel zêta a confirmé la surface ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par l’Université de Californie à Riverside et USDA National Institute of Food et Agriculture, Hatch projet 1009710 à J.P.G. Ce matériel est basé sur le travail soutenu par la National Science Foundation sous Grant no 1817363 à J.P.G.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nitrate de cérium (III) hexahydratéSigma-Aldrich238538-100G
Eau de qualité biologie moléculaire, CorningVWR45001-044  ;
Falcon 50 mL Tubes de centrifugation coniquesVWR14-959-49A
Poly (acide acrylique) 1 800 MwSigma-Aldrich323667-100G
Fisherbrand Mélangeur Vortex NumériqueFisher Scientific02-215-370
Fisherbrand Mélangeur Vortex Numérique Accessoire, Dispositif de retenue d’insertFisher Scientific02-215-391
Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessoires : Kit d’inserts en mousseFisher Scientific02-215-395
Solution d’hydroxyde d’ammoniumSigma-Aldrich05002-1L
Béchers PYREX Griffin, Gradués, CorningVWR13912-149  ;
RCT basicIKA3810001
Eppendorf Microcentrifugeuse 5424VWR80094-126
Unités de filtre centrifuge Amicon Ultra-15Millipore-SigmaUFC901024
Allegra X-30 Series Centrifugeuse de paillasseBeckman CoulterB06314
UV-2600 SptecrophotometerShimadzuUV-2600 120V
Whatman Anotop 10 seringuefiltre Sigma-AldrichWHA68091102
BD Seringues jetables avec embouts Luer-LokFisher Scientific14-829-45
Zetasizer Nano SMalvern PanalyticalZen 1600
1,1&prime ;-Dioctadecyl-3,3,3&prime ;,3&prime ;-perchlorate de tétraméthylindocarbocyanineSigma-Aldrich42364-100MG
Diméthylsulfoxyde de sulfoxyde, ACSVWRBDH1115-1LP
Sunshine Mix #1 LC1Green Island Distributors, Inc5212601.CFL080P
Adaptis 1000ConvironA1000
TES, >99 % (titrageSigma-AldrichT1375-100G
Chlorure de magnésiumSigma-AldrichM8266-1KG
Seringue Air-Tite Norm-Ject entièrement en plastiqueFisher Scientific14-817-25
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task WipersFisher Scientific06-666A
Carolina Observation GelCarolina132700
Lames de microscope Corning, givrées d’un côté, d’une extrémitéSigma-AldrichCLS294875X25-72EA
Cork Borer Sets avec poignéesFisher ScientificS50166A
PerfluorodécalineSigma-AldrichP9900-25G
Micro Cover Glasses, carré, n° 1VWR48366-045
Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5Leica MicrosystemsTCS SP5
2&prime ;,7&prime ;-Diacétate de dichlorofluorescineSigma-AldrichD6883-250MG
DihydroethidiumSigma-AldrichD7008-10MG
Fisherbrand Premium Microcentrifugeuse Tubes : 1,5 mLFisher Scientific05-408-129
Eppendorf Uvette cuvettesSigma-AldrichZ605050-80EA
Compteur de chlorophylle.Konica MinoltaSPAD-502

Références

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