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Article de méthode

Un modèle de souris Hyperandrogenic d’étudier le Syndrome des ovaires polykystiques

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DOI :

10.3791/58379

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2 octobre 2018

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1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Health, Beijing Military General Hospital, 3Southern Medical University, 4Department of Molecular and Cellular Physiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Gynecology and Obstetrics, Johns Hopkins University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Les auteurs décrivent le développement d’un modèle de souris SOPK type maigre avec une boulette de dihydrotestostérone afin d’étudier la physiopathologie du SOPK et la progéniture de ces barrages de SOPK-like.

Résumé

Hyperandrogénie joue un rôle essentiel dans la fonction de reproduction et le métabolisme chez les femmes et est le signe distinctif du syndrome des ovaires polykystiques. Élaboration d’un modèle de souris de SOPK type maigre qui imite les femmes atteintes de SOPK est cliniquement significative. Dans ce protocole, nous décrivons un tel modèle. En insérant une longueur de 4 mm de pastille de poudre cristal DHT (dihydrotestostérone) (longueur totale de pellet est 8 mm), et remplacer tous les mois, nous sommes en mesure de produire un modèle de souris de SOPK type avec pli de niveaux 2 de DHT sérique plus élevé que les souris ne pas implantés avec DHT (no-DHT). Nous avons observé des dysfonctions métaboliques et reproduction sans changer le poids corporel et la composition corporelle. Bien que présentant un degré élevé de l’infertilité, un petit sous-ensemble de ces souris femelles de type SOPK peut tomber enceinte et leur progéniture montre la puberté retardée et une augmentation de testostérone en tant qu’adultes. Ce modèle de souris maigre SOPK-like est un outil utile pour étudier la physiopathologie du SOPK et la progéniture de ces barrages de SOPK-like.

Introduction

Hyperandrogénie est la marque distinctive du syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) selon des critères de NIH et de la société SOPK (AE-SOPK) et de l’excès d’androgènes. Les femmes atteintes de SOPK ont du mal à tomber enceinte et ont augmenté le risque de complications de grossesse1. Même si elles tombent enceintes, leur progéniture femelle aurait une santé résultats2,3. Des modèles animaux ont été développés en utilisant diverses stratégies4,5,6,7,8,9,10,11 , 12 et présentant de nombreuses caractéristiques de PCOS (anovulation, et/ou intolérance au glucose et d’insuline) avec augmentent du poids corporel et de l’obésité lié avec la taille de l’adipocyte élargie et une augmentation du poids adipocytaire. Il y a deux grandes stratégies pour produire des modèles animaux qui servent à étudier le SOPK. L’un est un traitement avec des niveaux élevés d’androgènes directement (androgènes exogènes injection/insertion) ou indirectement (par exemple de bloquer la conversion des androgènes en œstrogènes avec inhibiteur de l’aromatase) après naissance13. Une autre est de hyperexposure fœtale des androgènes au cours de la gestation14,15 pour étudier la descendance. Par exemple, la progéniture femelle de singe rhésus16,17, mouton18et les rongeurs exposés à des niveaux masculins d’androgène au cours de la période intra-utérine développer des traits de SOPK-comme plus tard dans la vie. Ces modèles a considérablement accru notre compréhension des effets élevés d’androgènes et programmation fœtale et effets sur l’environnement utérins. Cependant, ces modèles ont leurs propres limitations : 1) les animaux développent l’obésité et il est donc difficile de séparer les effets de l’hyperandrogénie de l’obésité induite par la reproduction et dysfonctionnement métabolique ; 2) avant la grossesse, les femmes atteintes de SOPK présentent déjà des niveaux élevés d’androgène, donc des ovocytes ont été exposés aux androgènes excès avant la fécondation ; 3) aux doses pharmacologiques de testostérone (T) ou de la dihydrotestostérone (DHT) utilisé après la naissance ou pendant la gestation peuvent ne pas refléter l’environnement androgènes du SOPK. Testostérone et DHT ont été mesurées dans le liquide folliculaire ovarien et/ou de sérum et de testostérone et les niveaux DHT sont 1,5 à 3,9 fois plus élevée chez les femmes atteintes de SOPK5,19,20,21 ,22,23 , comparée aux femmes affectées. Nous avons créé une souris adulte modèle23,24,25 qui développe des dysfonctions métaboliques et reproduction dans les deux semaines de l’ouverture d’une exposition chronique de DHT d’insertion d’une pastille de 4 mm de longueur de poudre DHT de cristal (longueur totale du pellet est 8mm). Ce modèle produit sériques DHT qui sont environ 2 fois plus élevé (appelés 2xDHT) que celle des souris témoins sans traitement de DHT. Les souris 2xDHT ne présentent pas d’altérations de l’estradiol sérique basale, testostérone, LH et do ne pas développer l’obésité et indique similaire poids ovarienne, les taux sériques de cholestérol, acides gras libres, leptine, TNFα et IL-623,24, 25 relatif à contrôle même jusqu'à 3,5 mois après insertion de DHT23,24,25. En outre, en s’accouplant les femelles qui ont déjà développé des caractéristiques du SOPK, nous pouvons étudier l’impact d’un environnement maternel de hyperandrogenic sur la santé génésique et métabolique de la progéniture15.

Ce nouveau paradigme (pertinent pour les critères de NIH et de la société AE-SOPK) modèles de la maladie en produisant des niveaux relativement similaires d’androgènes à ceux des femmes avec SOPK 2 - à 3 fois plus élevé de testostérone ou DHT comparée aux femmes affectées. Cependant, ce modèle est maintenu par la DHT exogène continuelle et non d’hyperandrogénie endogène programmé une fois que la DHT est retirée. L’objectif général du présent article est de mettre l’accent sur la 1) Comment faire pour que le diabolo DHT ; 2) Comment générer un maigre-SOPK comme modèle de souris ; 3) stratégies pour évaluer la progéniture femelle de ces barrages. Autres mesures et évaluation des phénotypes ne sont pas abordées dans ce manuscrit, mais peuvent être trouvées en5,15,23,24,25,26.

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Protocole

Nous présentons ici des protocoles détaillés pour une insertion et préparation de boulette DHT et pour tester les reproducteurs et métaboliques. Les souris utilisées dans cette étude ont un fond mixte (C57/B6, CD1, 129Sv) et ont été maintenues avec de la nourriture et eau ad libitum dans un cycle lumière/obscurité de 14/10 h à 24 ° C dans l’animalerie de Broadway Research Building à la Johns Hopkins University School of Médecine. Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de l’emploi et de Johns Hopkins University animalier.

1. Créez le modèle murin de SOPK-like

  1. Préparation de boulette DHT
    1. Silastiques autoclave pour stériliser. Couper des tubes de silastic sur une longueur de 15 mm avec une lame de rasoir ;
    2. Sceller un côté par l’injection de silicone adhésif médical dans le tube avec une aiguille atténuée de 20 G, attachée à une seringue de 3 mL. Plongeur doit être retirée de la seringue, puis adhésif inséré dans le réservoir. Le piston est réinséré et adhésif poussé vers le bas jusqu'à ce qu’il commence à émerger de l’aiguille. L’aiguille mitigée faite par le côté pointu de l’aiguille de 20 G en coupant avec des ciseaux forts. La longueur du silicium dans le tube doit être supérieure à 2 mm permettant de postproduction rasage ;
    3. Sécher pendant la nuit ; Recherchez les bulles d’air sur le côté scellé. Ceux qui ont aucune bulle d’air sont utilisés pour pastilles de DHT. D’autres peuvent être utilisés pour les no-DHT contrôle pastilles.
    4. Porter des gants, masque, lunettes et blouse de laboratoire avant d’effectuer la DHT-pellet sous une hotte pour éviter l’exposition DHT à la peau.
    5. Poudre DHT de verser dans un plastique pèsent bateau et appuyez sur le côté ouvert de l’adhésif plafonné tubes (produits en A1.1) dans la poudre DHT.
    6. Poudre DHT peut être enfoncé avec un grand trombone qui se redresse.  Continuez jusqu'à ce que la DHT atteint une hauteur de 4 mm (ou la longueur désirée). Vérifiez la longueur de la DHT avec une règle et joint le côté ouvert avec le silicium, sécher toute la nuit.
    7. Couper chaque côté scellé pour rendre la longueur du silicium 2 mm de long. La longueur totale du pellet sera de 8 mm.
    8. Sceller les deux côtés du vide silastiques comme la pastille de contrôle (no-DHT).
    9. Garder les granulés dans un tube conique de 50 mL enveloppé d’aluminium (afin d’éviter l’exposition à la lumière) à température ambiante jusqu'à utilisation. Les granules DHT maintiennent pleine efficacité pendant au moins 3 mois de stockage.
  2. Remplacement et insertion de DHT
    1. Jusqu'à 20 DHT pellets ou granulés de contrôle sont submergées séparément dans un tube conique de 50 mL avec la solution saline 0,9 % stérile 30 mL pendant 24 h à 37 °C pour l’équilibration juste avant l’insertion.
    2. Avant l’opération, les surfaces et les gants sont désinfectés avec clidox et les surfaces de travail sont recouverts de plastique propre papier absorbant sauvegardé (bloc chirurgical).  Tous les instruments qui entrent en contact avec des animaux sont décontaminés avant d’entrer dans l’animalerie par autoclavage.  Instruments pourront sec et frais avant utilisation.
    3. les souris femelles de 2 mois sont utilisés (4 – 5 souris/cage). Souris sont injectés par voie intrapéritonéale Xylazine (3,5 mg/kg p.c.) et la kétamine (78,8 mg/kg p.c.) à l’aide d’une seringue à insuline. Calculs pour l’anesthésie de dosage et de mélange est dans le tableau 1.
    4. Après que anesthésie adéquat est atteint, telle que mesurée par la perte des réflexes de l’orteil et ralentit la respiration, la souris va être préparée pour la chirurgie.
    5. Désinfecter la peau de la zone avec la bétadine à l’aide d’une gaze stérile et nettoyer avec de l’éthanol à 70 %.  La zone sera encore une fois peint avec betadine.
    6. Découpez un trou d’environ 5 mm de longueur avec ciseaux sous la peau près du cou. À l’aide d’un trocart de 10 G, faites un petit tunnel (15 mm) à la direction rostrale. Le culot est inséré sur le dos avec le trocart.
    7. L’ouverture est ensuite scellée avec de la colle chirurgicale. La plaie manuellement approximative des arêtes avec forceps et douces traits brossage à appliquer une mince couche d’adhésif liquide sur les bords de la plaie par approximation. 3 l’accumulation des couches minces d’adhésif pour s’assurer que la colle est répartie uniformément sur la plaie. L’adhésif doit dépasser de 1 cm de chaque côté des bords de la plaie apposées. Suture ou agrafes chirurgicales peuvent également servir pour fermer le trou. Remettez souris en cage, logé individuel, avec une bouillote pour la récupération. Remplacer les granulés toutes les 4 semaines afin de maintenir un niveau constant de l’exposition aux androgènes. Le granule d’origine sera supprimé et nouveau pellet sera insérée comme décrit dans A1.15 dans la même position.
    8. Éstrale d’essai après 3 jours d’insertion de la DHT. Stade du cycle oestral est évaluée par la cytologie vaginale.  Cellules vaginales sont prélevés par l’aide d’une pipette de p10 à injecter une solution saline stérile (environ 10 µL) dans la cavité vaginale et ensuite retirer la solution saline avec la même pipette stérile 16 jours consécutifs.  Les cellules vaginales entraînées de la paroi vaginale mélangent avec du sérum physiologique et sont collectés.
    9. Étaler une solution saline avec cellules sur une lame marquée. Chaque diapositive peut contenir six échantillons. Diapositives sont étiquetés de manière à noter quel échantillon est placé dans chacune des six emplacements.
    10. Après la solution saline a complètement asséchée dans la diapositive, mettre des diapositives dans un récipient avec de l’éthanol 100 % pour fixer les cellules. Diapositives doivent être fixés pendant au moins 5 min, mais peuvent rester dans le fixateur indéfiniment jusqu'à ce que d’une utilisation ultérieure.
    11. Mettre les diapositives dans des solutions de coloration de 1 min chacun, pour le tampon B et diapositives C. Wash avec l’eau du robinet et sécher à température ambiante.
    12. Examiner la morphologie cellulaire sous un microscope optique objective de 10 X.  La morphologie des cellules à distinguer le pro-oestrus (P), oestrus (E), métoestrus (M) et dioestrus (D) est décrite dans références27,28,29.
    13. Compter les jours dans chaque étape et divisé par le nombre total de jours pour calculer le pourcentage de temps à chaque étape.
    14. Tester la tolérance au glucose à 21 jours après l’insertion de DHT par le jeûne des souris pendant la nuit (16 h) et injection intrapéritonéale de 2 g/kg de poids corporel de 20 % de dextrose. Par exemple, si une souris corps pèse 25 g, cette souris sera injectée avec 250 µL de dextrose de 20 % avec une seringue à insuline 50 cc (0,5 mL). Taux de glucose est évalués par bandes glucomètre et test de prélèvement d’échantillons de sang de la veine caudale à 0, 15, 30, 60, 90, 120 min. Ceci est décrit en détail ailleurs30.
  3. Collecte de sang
    1. Prélever le sang à différents jours après l’insertion de DHT (nous limiter le volume de la collection de 100 µL de stéroïde et 30ul pour dosage de LH/FSH) entre le 9 et 10:00 par veine sous-maxillaire saignement avec lancette. Ceci est décrit dans le11.
    2. Centrifuger de sang à 6 000 x g à 4 ˚C pendant 10 min et recueillir la couche de sérum dans un autre tube de 1,5 mL qui peut être stocké à-80 °C jusqu'à l’analyse.

2. évaluer la reproduction profils de progéniture femelle de façon chronique de DHT inséré des barrages

  1. Accouplement
    1. La souris femelle à tester est déplacée dans la cage avec un mâle fertile éprouvée (qui a déjà eu des petits avec une souris femelle) 15 jours après insertion de pellet.
    2. Document du poids corporel du barrage chaque semaine afin de déterminer si la souris est enceinte. Barrage poids augmente de plus de 3 g en une semaine indique la grossesse.
    3. Recueillir le sang des barrages de la deuxième semaine après qu’on observe une augmentation de poids des barrages supérieure à 3 g à partir de la semaine précédente.
  2. Puberté évaluée par l’ouverture du vagin et premier oestrus
    1. Vérifier l’ouverture vaginale par une inspection visuelle tous les jours après que les petits sont sevrés à 21 jours après l’accouchement (PND), mesurer la distance ano-génitales et enregistrer l’âge d’ouverture du vagin.
    2. Une fois que le vagin s’ouvre, collecter tous les jours, cellules vaginales comme décrit dans 1.2.8–1.2.11 pour vérifier les Éstrale.
    3. Observer la morphologie cellulaire comme décrit 1.2.12, et le premier oestrus est défini comme la date que toutes les cellules sont des cellules épithéliales cornéocytaire.
  3. Corps poids et oreille punch
    1. Trempez la pointe de la lancette dans la pâte de tatouage et marquer chaque chiot avec tatouage sur l’orteil comme décrit dans référence12 à 7 PND et pèsent souris tous les 7 jours jusqu'à 70 jours d’âge.
    2. Souris de coup de poing oreille dénombrer System.* en Figure 1 entre 12 à 16 PND. Pour distinguer le sexe, examiner la face ventrale du corps, les femmes auront mamelons visibles.
    3. Recueillir le sang à 21, 26, 70 PND après la naissance, comme décrit ci-dessus à l’alinéa 1.3.1
  4. Dosage hormonal
    1. Les niveaux de DHT dans le sérum sanguin sont mesurés par les deux dosage immuno-enzymatique (ELISA) et par le tandem de chromatographie en phase liquide de la masse spectrométrie (LC-MS)23,24,31,32. T est mesuré par LC-MS, ou une rat/souris ELISA qui a été validée par l’Université de Virginie Ligand dosage Core dans le centre de recherche en Reproduction23,24.

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Résultats

Sérique de la DHT et test de tolérance au Glucose

Les niveaux de DHT sont mesurées de sérum prélevé par les deux ELISA et par LC-MS selon protocole 1,24 – 1,25 et 2.9, 3.0. Les valeurs absolues DHT sont différents entre la spectrométrie de masse et ELISA, cependant, le pli relative (environ 2 fois) de DHT vs insertion no-DHT est similaire de deux essais et à travers des expériences15,

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Discussion

Hyperandrogénie est une caractéristique essentielle du SOPK. Les niveaux DHT de sérum (deux fois supérieur chez les souris de la DHT que chez les souris no-DHT) utilisés dans le présent protocole sont inférieurs à ceux rapportés par d’autres chercheurs dans des études antérieures et sont étalonnés pour imiter proportionnellement les femmes atteintes de SOPK5,19, 20,21. Contrairement aux autres...

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Déclarations de divulgation

Rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (subventions R00-HD068130 à S.W.) et le centre de recherches de diabète Baltimore : pilotes et subvention de faisabilité (à S.W.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Poudre cristalline 5&alpha ;-DHTSigma-AldrichA8380-1G
Tube Silastic Dow CorningFisher Scientific11-189-15DDiamètre intérieur 0,04 po/1 mm x 0,085 po/2,15 mm diamètre extérieur
Adhésif médical siliconeFacteur II, InC.A-100
Lunettes de protection, blouses de laboratoire, gants et masques.
10 et micro ; Pointes de pipette L sans filtreUSA Scientific11113700
Lame de microscope pour frottisFisher Scientific12-550-003
Diff Quik pour coloration des cellulesFisher ScientificNC9979740
LancetFisher ScientificNC9416572
3 mL SeringueBecton, Dickinson and Company (BD),30985
aiguille attachée : 20 GBD305176
Règle : toute longueur supérieure à 10 cm avec échelle millimétrique.
XylazineVet one AnnSeA LA, MWI, BoiseNDC13985-704-10100 mg/mL
Chlorhydrate de kétamineHospira, IncNDC 0409-2051-05100 mg/mL
Agrafe chirurgicaleAutoClip® ; Système, outil scientifique fin12020-00
Seringue à insulineBD3294611/2 CC, faible dose Seringue à insuline U-100
TrocarInnovative Research of AmericaMP-182
MicroscopeCarl Zeiss Primo Star415500-0010-001Allemagne
Poinçon d’oreilleFisher Scientific13-812-201
Testostérone rat/souris ELISA kitIBLB79174
DHT Kit ELISAAlpha Diagnostic International1940
Ultra-glucomètre à une toucheLife Scan, Inc.
Bandes de test ultra à une toucheLife Scan, Inc.
Tube EppendorfFisher Scientific05-402-18
Lame de rasoirFisher Scientific12-640
ClidoxFisher ScientificNC0089321
coussin chirurgicalFisher Scientific50587953Fabricant : Andwin Scientific 56616018
Betadine Solution antiseptiqueWalgreens
3M Vetbond (cyanoacrylate de n-butyle)3M Science. Appliqué à la vie

Références

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Pr paration de pellets de DHTMod le de syndrome des ovaires polykystiquesNiveaux s riques de DHTAnalyse de la cyclicit straleTest de tol rance au glucosePr l vement sanguin via la veine sous mandibulairevaluation de l ouverture vaginaleMesure de la distance ano g nitalevaluation de la pubert des descendants
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