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Article de méthode

Constitution génétique biosynthétisée L-dihydroxyphénylalanine (DOPA) et son Application à la conjugaison de protéine

7.6K vues

⸱

DOI :

10.3791/58383

⸱

24 août 2018

 , 
1Department of Chemistry, Sogang University

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour la constitution génétique de L-dihydroxyphénylalanine biosynthétisée à partir de matières premières simples et son application à la conjugaison de la protéine.

Résumé

L-dihydroxyphénylalanine (DOPA) est un acide aminé présent dans la biosynthèse des catécholamines dans les animaux et les plantes. En raison de ses propriétés biochimiques particulières, l’acide aminé a des utilisations multiples applications biochimiques. Ce rapport décrit un protocole pour la constitution génétique de biosynthétisée DOPA et son application à la conjugaison de la protéine. DOPA est biosynthétisée par une tyrosine phénol-lyase (TPL) de catéchol, le pyruvate et l’ammoniac et l’acide aminé est incorporé directement dans des protéines par la méthode de constitution génétique utilisant un aminoacyl-tRNA évoluée et paire d’aminoacyl-tRNA synthétase. Ce système d’incorporation directe intègre efficacement DOPA avec peu d’incorporation d’autres acides aminés naturels et avec le meilleur rendement de protéine que le précédent système de constitution génétique pour DOPA. Conjugaison de protéine avec des protéines contenant de DOPA est efficace et spécifique au site et montre son utilité pour des applications diverses. Ce protocole prévoit scientifiques de protéine avec des procédures détaillées pour la biosynthèse efficace de protéines mutantes contenant DOPA aux sites désirés et leur conjugaison pour applications industrielles et pharmaceutiques.

Introduction

DOPA est un acide aminé impliqué dans la biosynthèse des catécholamines dans les animaux et les plantes. Cet acide aminé est synthétisé à partir de Tyr par la tyrosine hydroxylase et la molécule de dioxygène (O2)1. Parce que la DOPA est un précurseur de la dopamine et peut pénétrer la barrière hémato - encéphalique, il a été utilisé dans le traitement de la maladie de Parkinson,2. DOPA se trouve également dans les protéines d’adhérence moule (cartes), qui sont responsables des propriétés adhésives des moules dans des conditions humides3,4,5,6,7. Tyr est initialement codé dans les positions où la DOPA se trouve dans les cartes et est ensuite converti en DOPA par tyrosinases8,9. En raison de ses propriétés biochimiques intéressantes, DOPA a été utilisé dans une variété d’applications. Le groupe dicarbométhoxyl de DOPA est chimiquement sujets à l’oxydation, et l’acide aminé est facilement transformé en L-dopaquinone, un précurseur des mélanines. En raison de son caractère électrophile haut, L-dopaquinone et ses dérivés ont été utilisés pour la réticulation et conjugaison avec les thiols et amines10,11,12,13. 1, 2-quinones peuvent également fonctionner comme un diène pour les réactions de cycloaddition et ont été utilisés pour bioconjugaison par contrainte-favorisé oxydation contrôlée cyclooctyne-1,2-quinone (SPOCQ) cycloaddition14. En outre, le groupe dicarbométhoxyl peut chélater les ions métalliques tels que Fe3 + et Cu2 +, et les protéines contenant DOPA ont été utilisés pour l’administration des médicaments et des ions métalliques détection15,16.

DOPA a été génétiquement incorporé dans les protéines en utilisant un orthogonal aminoacyl-ARNt (aa-ARNt) et aminoacyl-ARNt synthétase (RAA) paire17 et utilisé pour la protéine conjugaison et réticulation10,11, 12,,13. Dans le présent rapport, les résultats expérimentaux et des protocoles pour la constitution génétique de DOPA biosynthétisée à partir de matières premières bon marchés et de ses applications à bioconjugaison sont décrits. DOPA est biosynthétisée à l’aide d’un TPL et à partir de catéchol, le pyruvate et l’ammoniac chez Escherichia coli. La biosynthèse DOPA est directement incorporée dans les protéines en exprimant une paire aa-ARNt et aaRS évoluée pour DOPA. En outre, la protéine biosynthétisée contenant la DOPA est relativement conjuguée avec une sonde fluorescente et réticulé pour produire des oligomères de protéine. Ce protocole sera utile pour les scientifiques de protéine, à biosynthétiser les protéines mutantes contenant DOPA et conjuguer les protéines avec sondes biochimiques ou de médicaments destinés à des applications industrielles et pharmaceutiques.

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Protocole

1. Construction de plasmide

  1. Construire un plasmide d’expression (pBAD-double-TPL-GFP-WT) qui exprime le gène TPL de Citrobacter freundii , sous le contrôle d’un promoteur constitutif et le gène de la protéine fluorescente verte (GFP) avec un son6-tag sous le contrôle de la araBAD promoteur. Pour pBAD-double-TPL-GFP-E90TAG, remplacer le codon pour le site (E90) de DOPA avec un codon ambre (TAG), à l’aide d’un protocole de mutagénèse dirigée. Les détails pour la construction de ce plasmide a été décrit dans notre précédent rapport18.
  2. Construire un ARNt/RAA-exprimant plasmide (pEVOL-DHPRS2)18,19 de la constitution génétique de DOPA. pEVOL est un vecteur plasmidique spécial exprimant deux copies des gènes de l’aaRS avec promoteurs indépendants, et les informations détaillées du plasmide sont décrite dans un précédent rapport19.
  3. Trousses de préparation de plasmide disponibles dans le commerce permet d’obtenir haute pureté plasmide DNAs. Vérifier la pureté de l’ADN préparés à l’aide de gel d’agarose, si nécessaire.

2. préparation de la culture

  1. Électroporation
    1. Utilisation de l’electro-compétente DH10β souche d’e. coli pour cette expérience. Ajouter 1 µL de chaque plasmide d’ADN (pEVOL-DHPRS2 et pBAD-double-TPL-GFP-E90TAG) à 20 µL de cellules compétentes. Mélanger doucement pour faire un mélange homogène, à l’aide d’une pipette.
    2. Transvaser le mélange dans les cuvettes d’électroporation. Placez la cuve dans le compartiment d’électroporation. Pousser la cuvette dans la chambre faire cuvette-chambre ferme contacter.
    3. Choquer la cuvette, à l’aide de 25 µF et 2,5 kV pour cuvettes de 0,1 cm.
    4. Ajouter 1 mL de bouillon super optimale préchauffée (SOC), contenant 2 % (p/v) tryptone, 0,5 % (p/v), extrait de levure, 10 mM NaCl, KCl 2,5 mM, 10 mM MgCl2et 20 mM de glucose, de la cuvette et transférer les cellules dans un tube de culture. Sauver les cellules en les incubant pendant 1 h à 37 ° C sous agitation.
    5. Diffuser 10-100 µL de cellules sauvées sur une gélose de bouillon (LB) de lysogénie contenant 35 µg/mL chloramphénicol et 100 ampicilline µg/mL. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 16 h.
  2. Préparation de la culture de démarreur
    1. Ensemencer une seule colonie transformée dans 5 mL de milieu LB contenant des antibiotiques. Incuber la colonie pendant 12 h à 37 ° C sous agitation.

3. expression et Purification de GFP-E90DOPA par un système de biosynthèse

  1. Expression de GFP-E90DOPA par un système de biosynthèse
    1. Transférer la culture starter (2 mL) pour 100 mL de PA-5052 moyenne20 (50 mM Na2HPO4, 50 mM KH2PO4, 25 mM [NH4]2pour métaux, 0,5 % [p/v] glycérol, traces de4, 2 mM MgSO4, 0,1 % [p/v] 0.05 % [p/v] glucose et des acides aminés 5 % [p/v] [pH 7.25]) contenant 35 µg/mL chloramphénicol, ampicilline de µg/mL 100, pyruvate de 100 mM, catéchol 10 mM, ammoniaque 25 mM et 300 µM le dithiothréitol (DTT) suivie d’une incubation à 30 ° C sous agitation.
    2. Ajouter 2 mL de 0,2 % (p/v) L-arabinose quand la densité optique (do) à 550 nm atteint 0,8. Incuber l’échantillon pendant 12 h à 30 ° C sous agitation.
    3. Tournez en bas les cellules à 11 000 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et geler le culot cellulaire à-80 ° C.
  2. Lyse cellulaire
    1. Décongeler le culot cellulaire sur la glace et remettre en suspension les cellules dans 10 mL de tampon de lyse contenant 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), imidazole de 10 mM et 300 mM NaCl.
    2. Laisser agir les cellules resuspendues sur glace pendant environ 10 minutes utilisation 80 % sonication amplitude avec une impulsion de 25 s sur et 35 s éteint.
    3. Tournez en bas le lysat à 18 000 x g à 4 ° C pendant 15 min. Transférez le surnageant dans un tube frais pour la purification cellulaire et jeter le culot.
  3. Chromatographie d’affinité ni-NTA
    1. Résine de Ni-NTA (acide nitrilotriacétique) (300 µL de suspension de résine pour une culture de 100 mL) s’ajoute le surnageant et lier les protéines à la résine de Ni-NTA à 4 ° C en le secouant doucement la suspension pendant 1 h.
    2. Transférer la suspension à une colonne en polypropylène et laver la résine 3 x 5 ml de tampon de lavage contenant 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), imidazole de 20 mM et 300 mM NaCl.
    3. Éluer les protéines 3 x 300 µl de tampon d’élution contenant 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), imidazole de 250 mM et 300 mM NaCl.
    4. Déterminer la concentration de la protéine en mesurant l’absorbance à 280 nm. Le coefficient d’extinction (24 630 M-1cm-1) pour GFP-E90DOPA à 280 nm a été évaluée par un calculateur de coefficient protéine extinction (p. ex., https://web.expasy.org/protparam/) et l’extinction mesurée indépendamment coefficiennt (2630 M-1cm-1) pour DOPA. Comme méthode alternative, utiliser la Bradford protéine test21 pour la détermination de la concentration de protéine.

4. l’oligomérisation de purifiée GFP-E90DOPA

  1. Ajouter 1 µL de sodium periodate H2O (6 mM) (1,0 équivalent à GFP-E90DOPA) à une solution de 20 µL de GFP-E90DOPA (300 µM) dans un tampon phosphate contenant 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) et 300 mM NaCl.
  2. Permettre la réaction de l’oligomérisation de rouler à 25 ° C pendant 48 h.
  3. Analyser le mélange réactionnel par électrophorèse sur gel sodium dodécyl sulfate polyacrylamide) (SDS-PAGE) tel que décrit à l’étape 6.

5. conjugaison de GFP-E90DOPA avec une sonde alcyne par SPOCQ

  1. Ajouter 1 µL de l’azadibenzocyclooctyne lié à Cy5.5 (Cy5.5-ONEMBOTEH)22 H2O (4,0 mM) (10 équivalent à GFP-E90DOPA) à une solution de 20 µL de GFP-E90DOPA (20 µM) dans un tampon phosphate contenant 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) et 300 mM NaCl.
  2. Ajouter 1 µL de sodium periodate H2O (400 µM) (1,0 équivalent à GFP-E90DOPA) au mélange réactionnel.
  3. Permettre la réaction SPOCQ de rouler à 25 ° C pendant 1 h. Si on utilise une sonde sensible à la lumière, couvrir la cuve de réaction avec du papier aluminium.

6. la purification de la GFP étiquetée

  1. Diluer le mélange réactionnel de SPOCQ en ajoutant un tampon phosphate, contenant 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) et 300 mM NaCl, jusqu'à 500 µL.
  2. Transférer la solution diluée dans une colonne filtre centrifuge. Centrifuger la colonne à centrifuger à 14 000 x g à 4 ° C pendant 15 min et éliminer les intermédiaires. Répétez cette opération 3 fois afin d’éliminer tout excès de Cy5.5-ONEMBOTEH.
  3. Transférer l’échantillon purifié de la colonne dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
  4. Vous pouvez également effectuer une purification par la dialyse contre le même tampon.
  5. Stocker la GFP purifiée à 4 ° C.

7. SDS-PAGE analyse et Gel de Fluorescence Scanning

  1. Préparer des échantillons de protéines pour l’analyse de SDS-PAGE en ajoutant 5 µL de tampon de protéine (voir la Table des matières) et 2 µL de la TNT (1,00 M) à 13 µL de purifiée, ou brut, l’étiquette GFP (13,6 µM ou 0,38 mg/mL). Pour une analyse des oligomère GFP, utiliser une concentration plus élevée de GFP (67,8 µM ou 1,9 mg/mL). Dénaturer les protéines en les incubant à 95 ° C pendant 10 min.
  2. Placer une cassette de gel Bis-Tris SDS-PAGE 4-12 % (cassettes achetées, premade gel) à la cellule de l’électrophorèse et ajouter une mémoire tampon en cours d’exécution (voir la Table des matières). Charger les échantillons de protéine et un marqueur de poids moléculaire. Exécutez l’électrophorèse pour 35-40 min à 200 V.
    Remarque : Évitez toute exposition des échantillons de protéines à la lumière en effectuant tous les processus dans l’obscurité, afin de minimiser la photo-blanchiment de la sonde fluorescente.
  3. Utiliser un scanner de fluorescence pour l’imagerie de fluorescence. Enveloppez un gel de la protéine de l’électrophorèse et placez-le sur un scanner de fluorescence. Scannez le gel à l’aide d’un paramètre de longueur d’onde appropriée. Pour Cy5.5, sélectionnez le mode de Cy5 fourni dans le logiciel de numérisation.
  4. Souillez le gel avec une protéine commerciale réactif de coloration.

8. MALDI-TOF MS analyse par Digestion trypsique

  1. Incuber à 100 µL de GFP-E90DOPA (2,2 mg/mL ou 80 µM) dans un tampon contenant 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 % (p/v) SDS purifiée et 25 mM TNT à 60 ° C pendant 1 h.
  2. Ajouter 1 µL d’iodoacétamide H2O (IAA, 4.0 M) (500 équivalent à GFP-E90DOPA) à la solution purifiée de GFP-E90DOPA (80 µM) dans le même tampon. Incuber le mélange à 25 ° C pendant 30 min avec protection contre la lumière.
  3. Digérer l’échantillon de GFP-E90DOPA en ajoutant la trypsine (rapport de protéase-à-substrat-protéine au 1/100 [w/o]) et incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 4 h.
  4. Purifier l’échantillon digéré peptide en utilisant une méthode standard de dessalement avec C18 colonnes à centrifuger.
  5. Analyser les peptides digérées par le protocole signalé pour laser assistée par matrice désorption-ionisation time-of-flight spectrométrie de masse (MALDI-TOF MS) à l’aide de l’acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique (ACSSD) comme une matrice23.

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Résultats

Le système d’expression pour l’incorporation directe de DOPA biosynthétisée à partir d’un TPL est illustré à la Figure 1. Les gènes codant pour la paire aa-ARNt et aaRS évoluée sont placés dans un plasmide, et le gène de la GFP (GFP-E90TAG) contenant un codon ambre à la position 90 se trouve dans un autre plasmide pour évaluer l’incorporation de DOPA par fluorescence GFP. Le gène TPL est placé dans le même plasmide d’expression contenant le gène de la GFP et ...

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Discussion

Dans ce protocole, la biosynthèse et l’incorporation directe de DOPA sont décrites. La cellule bactérienne utilisée dans cette méthode peut synthétiser un acide aminé supplémentaire et utilisez-le comme un bloc de construction artificiel pour la synthèse des protéines. La constitution génétique des acides aminés non naturels a été une technologie clé pour le développement de l’organisme contre nature avec un code génétique élargi. Toutefois, cette méthode a été techniquement incomplète et est modifiée pour améliorer l’ef...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été financée par le programme de recherche Global Frontier (FRO-2015M3A6A8065833), et le programme de recherche sciences fondamentales (2018R1A6A1A03024940) grâce à la Fondation de recherche National de Corée (NRF) financé par le gouvernement de la Corée.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1. Construction du plasmide
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAGcontient éventuellement le codon stop ambré (TAG) à une position souhaitée. Ko, W. et coll. Marquage efficace et spécifique du site par cycloaddition azide-alcyne promue par la souche. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi : 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmide pEvol-DHPRS21. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., et Schultz, P. G. Un système amélioré pour la mutagenèse non naturelle des acides aminés chez E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi : 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Incorporation génétique de la l-dihydroxyphénylalanine (DOPA) biosynthétisée par une tyrosine phénol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, DOI : 10.1039/C8CC00281A (2018).
DH10&bêta ;InvitrogenC6400-03Expression
Host Plasmid Mini-prep kitNucleogen5112200/paquet
AgaroseIntron biotechnology32034500 g
Bromure d’éthidiumAlfa AesarL074821 g
LB BouillonBD Difco244620500 g
2. Préparation de la culture
2.1) Électroporation
Micro pulseur  ;BIO-RAD165-2100
Micro cuvette à impulsionsBIO-RAD165-2089Espacement des électrodes de 0,1 cm, paquet de 50
Ampicilline sodiqueWako018-1037225 g
ChloramphénicolAlfa AesarB2084125 g
AgarSAMCHUN214230500 g
SOC moyenSigmaS1797100 mL
3. Expression et purification de la GFP-E90DOPA par le système biosynthétique
3.1 Expression de la GFP-E90DOPA par le système biosynthétique
L(+)-Arabinose, 99 %Acros104981000100 g
Pyrocatéchol, 99 %SAMCHUNP138725 g
Sulfate d’ammonium, 99 %SAMCHUNA0943500 grammes
acide pyruvique, 98 %Alfa AesarA13875100 g
Phosphate de sodium dibasique, anhydre, 99 %SAMCHUNS08911 kg
Phophate de potassium monobasique, 99 %SAMCHUNP11271 kg
Sulfate de magnésium anhydre, 99 %SAMCHUNM01461 kg
D(+)-Glucose, anhydre, 99 %SAMCHUND0092500 g
Glycérol, 99 %SAMCHUNG02691 kg
Mélange de métaux traces a5 avec coSigma9294925 mL
L-Proline, 99 %SAMCHUNP125725 g
de L-phénylalanine, 98,5 %SAMCHUNP198225 g
de L-TryptophaneJUNSEI49550-031025 g
de L-Arginine, 98 %SAMCHUNA114925 g
L-glutamine, 98 %JUNSEI27340-031025 g de
L-asparagine monohydratée, 99 %SAMCHUNA119825 g
de L-méthionineJUNSEI73190-041025 g
chlorhydrate de L-histidine monohydraté, 99 %SAMCHUNH060425 g
de L-thréonine, 99 %SAMCHUNT293825 g
de L-leucineJUNSEI87070-031025 g
de glycine, 99 %SAMCHUNG028625 g d’acide
L-glutamique, 99 %SAMCHUNG023325 g
de L-alanine, 99 %SAMCHUNA154325 g
de L-isoleucine, 99 %SAMCHUNI104925 g
de L-Valine, 99 %SAMCHUNV008825 g
de L-sérineSAMCHUNS244725 g
Acide L-aspartiqueSAMCHUNA120525 g
Monochlorhydrate de L-Lysine, 99SAMCHUNL059225 g
3.2 Lyse cellulaire
imidazole, 99 %SAMCHUNI05781kg
Phosphate de sodium monobasique, 98 %SAMCHUNS09191 kg
Chlorure de sodium, 99 %SAMCHUNS29071 kg
Processeur à ultrasons - 150 microlitres à 150 millilitresSONIC & MATÉRIAUXVCX130
3.3 Chromatographie d’affinité Ni-NTA
Résine Ni-NTAQIAGEN3021025 mL
Colonne en polypropylèneQIAGEN3492450/paquet, capacité de 1 mL
4. Oligomérisation de GFP-E90DOPA purifié
Periodate de sodium, 99.8&Acros4196100505 g
5. Conjugaison de la GFP-E90DOPA avec une sonde d’alcyne par cyclooctyne contrôlé par oxydation favorisée par déformation&ndash ; Cycloaddition de 1,2-quinone (SPOCQ)  ;
Cy5.5-ADIBO  ;FutureChemFC-61191mg
6. Purification des filtres centrifuges étiquetés GFP
Amicon Ultra 0,5 mLMILLIPOREUFC50039696/paquet, capacité 500ul
7. Analyse SDS-PAGE et balayage de gel de fluorescence
1,4-Dithio-DL-thréitol, DTT, 99,5 %Sigma1070898400110 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4XThermofisherNP000710 mL
MES running bufferThermofisherNP0002500 mL
Nupage Novex 4-12 % SDS PAGEgels ThermofisherNO032112 well
Coomassie Bleu Brillant R-250Wako031-1792225 g
G :BOX Chemi Fluorescent & Système d’imagerie chimiluminescenteSyngeneG BOX Chemi XT4
8. Analyse MALDI-TOF MS par digestion de la trypsine
8.1 Préparation de l’échantillon de peptide digéré par digestion de trypsine
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99 %SAMCHUNT1351500 g
Acide chlorhydrique, 35~37 %SAMCHUNH0256500 mL
Sel de sodium de dodécylsulfate, 85 %SAMCHUND1070250 g
IodoacétamideSigmaI61255 g
Protéase de trypsine, MS GradeThermofisher900575 x 20 & micro ; g/paquet
C-18 spin columnsThermofisher8987025/paquet, 200 & micro ; L capacité
8.2 Analyse du peptide digéré par MALDI-TOF
Acetonitirile, 99,5 %SAMCHUNA0125500 mL
&alpha ;-Cyano-4-hydroxycinnamicacid SigmaC202010 g
Acide trifluoroacétique, 99 %SAMCHUNT1666100 g
MTP 384 plaque cible en acier rectifié cibles BCBruker8280784
Bruker Spectromètre de masse MALDI-TOF AutoflexSpeed Bruker
de de  %

Références

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  11. Umeda, A., Thibodeux, G. N., Moncivais, K., Jiang, F., Zhang, Z. J. A versatile approach to transform low-affinity peptides into protein probes with cotranslationally expressed chemical cross-linker. Analytical Biochemistry. 405 (1), 82-88 (2010).
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