Ce protocole vise à décrire l’isolement et ex vivo livraison de gène porcin hépatocytes pour guérir des modèles de maladies métaboliques par autogreffe de cellules. Bien que ce modèle particulier bénéficie d’avantages uniques qui favorisent une thérapie réussie, l’application est une base pertinente pour traiter les indications et autres maladies.
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Article de méthode
Des gènes induite par le vecteur de la thérapie génique des hépatocytes Ex Vivo pour Transplantation autologue chez le porc
Dans cet article
Résumé
Résumé
La thérapie génique est un choix idéal pour soigner les nombreuses erreurs innées du métabolisme du foie. Ex vivo, vecteurs LENTIVIRAUX ont été utilisées avec succès dans le traitement de nombreuses maladies hématopoïétiques chez l’être humain, car leur utilisation offre l’expression TRANSGENIQUE stable en raison de la capacité du vecteur d’intégrer dans le génome hôte. Cette méthode illustre l’application de la thérapie génique ex vivo des hépatocytes à un grand modèle animal de la tyrosinémie héréditaire de type I. Ce processus se compose de 1) isolation des hépatocytes primaires de l’animal donneur/receveur autologue, 2) ex vivo la livraison de gène par l’intermédiaire de transduction d’hépatocytes avec un vecteur lentiviral et greffe 3) autologue des hépatocytes corrigés via portail injection de la veine. Succès de la méthode s’appuie généralement sur une suppression efficace et stérile de la résection hépatique, prudente, manipulation de l’échantillon excisé, isolation des hépatocytes viables permettant de re-après, le pourcentage élevé de transduction des cellules isolées, et procédures chirurgicales aseptiques partout pour prévenir l’infection. Une défaillance technique à n’importe lequel de ces étapes se traduira par le faible rendement des hépatocytes de transduite viables pour greffe autologue ou infection de l’animal donneur/receveur. Le modèle de cochon de tyrosinémie héréditaire de type humain 1 (HT-1) choisi pour cette approche est particulièrement favorable à une telle méthode, car même un faible pourcentage de prise de greffe de cellules corrigées conduira au repeuplement du foie avec des cellules saines, basés sur un puissant avantage sélectif sur les hépatocytes natif-malades. Bien que cette sélection de croissance ne sera pas vraie pour toutes les indications, cette approche est une Fondation pour l’expansion dans d’autres indications et permet pour la manipulation de cet environnement pour traiter des maladies supplémentaires, tant à l’intérieur du foie et au-delà, tout en contrôle d’exposition aux vecteurs viraux et possibilité de toxicité hors cible et de la tumorigénicité.
Introduction
Erreurs innées du métabolisme du foie sont une famille de maladies génétiques affectant collectivement autant que 1 dans 800 naissances vivantes1. Nombre de ces maladies sont monogéniques défauts2 et peuvent être fonctionnellement guéries en introduisant une seule copie corrigée du gène affecté dans un nombre suffisant d’hépatocytes3. Le pourcentage réel d’hépatocytes qui doit être corrigée varie selon la maladie4 et est largement tributaire de la nature de la protéine qu'il encode, par exemple, les protéines sécrétoires versus cytoplasmique. Dans la plupart des cas, l’effi....
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Protocole
Toutes les procédures d’animaux ont été effectuées conformément aux lignes directrices et ont été revus et approuvés par le Comité de l’emploi (IACUC) et d’institutionnels animalier avant étude conduite. Procédures décrites ici ont été réalisées sur des porcs mâles et femelles grande ferme blanche (bagage génétique de Piéride du chou Landrace/50% 50 %) vers le haut à 3 mois d’âge qui sont réputées être sain et adapté à la chirurgie. Animaux est logés socialement moins considérés comme incompatibles par le personnel de soins vétérinaires. Animaux sont nourris des niveaux appropriés de chow deux fois quotidienne et observé des signes cliniques par le personnel de soin....
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Résultats
La résection du foie et transplantation autologue sont représentés schématiquement à la Figure 1. Dans une cohorte représentative de 5 porcs qui a subi une résection hépatique, la plupart avaient des rendements de > 1 x 109 hépatocytes avec environ 80 % de viabilité (tableau 2), offrant beaucoup de cellules de n’importe quel type de désiré des manipulations, y compris le gène thérapie. Culture subséquente de la portion non trans.......
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Discussion
Le présent rapport décrit une approche ex vivo gène autologue thérapie pour guérir un modèle porcin de HT-1. Il s’agit d’une hépatectomie partielle, suivie par ex vivo d’isolement de l’hépatocyte et transduction d’hépatocytes isolés avec lenti virus transportant le transgène correctif. Corrigée des hépatocytes autologues sont alors transplantés vers l’animal déficient FAH par l’intermédiaire de la veine porte8. Bien que la méthode décrite est applicable à tous les grands modèles .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient Duane Meixner pour expertise dans l’exécution de l’injection de la veine porte, Steve Krage, Joanne Pederson et Lori Hillin soutien pendant les interventions chirurgicales. Ce travail a été soutenu par la Fondation de l’hôpital du Minnesota et la médecine régénérative Minnesota enfants. R.D.H. a été financé par un prix de NIH K01 DK106056 et un centre de clinique de Mayo pour la médecine régénérative Career Development Award.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 2-(2-nitro-4-trifluorométhylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocart | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocart | Covidien | B5SHF | |
| Endo Agrafeuse chirurgicale 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Agrafeuse chirurgicale 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Agrafeuse chirurgicale 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo sac de capture | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Pansement Stérile |
| Williams'-E Poudre ; | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 ; | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES ; | Fisher | BP310-1 | |
| Stylo/Strep ; | Gibco | 15140-122 | |
| Sérum de veau fœtal | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acétyl-L-cystéine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagénase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Facteur de croissance épidermique | Gibco | PHG0314 |
Références
- Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).
- Hansen, K., Horslen, S. Metabolic liver disease in childr....
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Réimpressions et autorisations
