Nous présentons ici un protocole à l’écran une protéine extracellulaire microarrays pour l’identification des interactions ligand-récepteur roman en haut débit. On décrit également une méthode pour améliorer la détection des interactions protéine-protéine transitoires en utilisant des complexes protéine-faisant.
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Article de méthode
Technologie des microréseaux protéine extracellulaire pour détection haut débit des Interactions Ligand-récepteur de faible affinité
Dans cet article
Résumé
Résumé
Facteurs sécrétés, attaché à la membrane des récepteurs et leurs partenaires d’interactions sont les principaux régulateurs de la communication cellulaire et l’initiation des cascades de signalisation au cours de l’homéostasie et la maladie et ainsi représentent des cibles thérapeutiques. Malgré leur pertinence, ces réseaux d’interactions reste nettement sous-représentées dans des bases de données courantes ; par conséquent, plus les protéines extracellulaires n’ont aucun partenaire de liaison documentée. Cet écart est principalement en raison de relever les défis associés à l’étude des protéines extracellulaires, notamment de l’expression des protéines fonctionnelles et l’affinité faible, faible, interactions protéine souvent établies entre les récepteurs de surface cellulaire. Le but de cette méthode consiste à décrire l’impression d’une bibliothèque de protéines extracellulaires dans un format « microarray » pour le dépistage des interactions protéine-protéine. Pour activer la détection des interactions faibles, on décrit une méthode basée sur la multimerization de la protéine de requête à l’étude. Couplé à cette approche axée sur les faisant multimerization de MULTIVALENCE accrue, le microarray de protéine permet une détection robuste d’interactions protéine-protéine transitoire en haut débit. Cette méthode offre une échantillon rapide et faible consommation-approche pour l’identification de nouvelles interactions applicables à n’importe quelle protéine extracellulaire. Impression de microarray de protéine et le protocole de dépistage sont décrits. Cette technologie sera utile pour les chercheurs qui cherchent une méthode robuste à la découverte des interactions de protéine dans l’espace extracellulaire.
Introduction
La méthode examinée ici décrit l’impression d’une collection de protéines extracellulaires dans un format « microarray », suivie d’une méthode de dépistage d’une cible d’intérêt contre cette bibliothèque. Nous avons identifié des protéines multimerization comme une étape cruciale pour la détection des interactions caractérisées par affinités de liaison faible. Pour améliorer la détection de ces interactions, les auteurs décrivent un protocole basé sur multimerization de la protéine de requête d’intérêt à l’aide de microbilles.
Sécrétée et cell surface protéines exprimées (collectivement appelées protéines extracellulaires) ainsi que leurs partenaires d’interactions sont des régulateurs clés de communication cellulaire, la signalisation et l’interaction avec le microenvironnement. Ils sont, par conséquent, essentiels dans la régulation de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Environ un quart du génome humain (≈5, 000 protéines) codant pour des protéines extracellulaires, qui, compte tenu de leur importance et leur accessibilité aux médicaments systématiquement livrées, représentent des cibles clés pour drogues développement1. En conséquence, les protéines extracellulaires représentent plus de 70 % des cibles protéiques avec action pharmacologique connue pour des médicaments homologués sur le marché, connu comme le « proteome thérapeutiques ». Malgré leur importance et leur abondance, les réseaux d’interaction (ePPI) extracellulaire protéines restent remarquablement sous-représentées dans les bases de données disponibles. Il s’agit fondamentalement en raison de la complexité biochimique des protéines extracellulaires, qui s’oppose à leur caractérisation à l’aide de technologies plus disponible2. Tout d’abord, les protéines membranaires sont difficiles à solubiliser, un processus qui comporte souvent des conditions de lavage dure et détergents ; Deuxièmement, protéines extracellulaires manquent souvent des modifications post-traductionnelles telles que glycosylation qui sont absents lorsque ces protéines sont exprimées en couramment utilisées systèmes hétérologues. Enfin, les interactions entre les récepteurs comme corécepteurs exprimées sur les cellules immunitaires, sont souvent transitoires et caractérisé par une très faible affinité (KD dans le ~ 1 μM à > 100 gamme μM). Au total, la nature de ces protéines et leur liaison partenaires rendent plus largement utilisé des technologies, telles que l’affinité purification/spectrométrie de masse (AP/MS) ou levure-double-hybride, impropre à la détection des interactions dans l’espace extracellulaire 2 , 3.
Dans le but de relever ces défis techniques et d’accélérer la découverte de nouvelles interactions des protéines extracellulaires, nous avons développé une couverture élevée protéines extracellulaires microarray4,5. Microarrays offrent l’avantage de générer des surfaces à haute densité avec de petites quantités d’échantillon et généralement se prêtent à des études de haut débit. Études de puces de protéine fournis précédemment pertinentes aperçus des interactions de protéine pour plusieurs organismes modèles, quoique se concentrant principalement sur les interactions cytosoliques ou protéine spécifique familles6,7, 8. En revanche, travail limité a été fait pour étudier les interactions de protéine extracellulaire à l’aide de cette technologie. Nous avons développé une méthode de microarray de protéine pour permettre des études d’ePPIs en construisant une bibliothèque complète et diversifiée de protéines sécrétées purifiées et unique transmembranaire (STM) récepteurs exprimés comme recombinants domaines extracellulaires (DPE), fusionnées à balises communes pour affinité purification4. Le succès des écrans microarray protéine dépend fortement de la mise en place d’une bibliothèque de protéine de haute qualité. Pour l’expression de la protéine de la bibliothèque et la requête, les cellules de mammifères ou des cellules d’insecte préférentiellement apparaissaient comme des systèmes d’expression hétérologue, afin d’assurer le bon ajout de modifications post-traductionnelles telles que liaisons disulfure de glycosylation. SDS-PAGE, chromatographie d’exclusion et de diffusion de la lumière laser multi-angle sont des techniques couramment utilisées pour évaluer la qualité des protéines recombinantes. La bibliothèque de la protéine est ensuite repérée sur des diapositives epoxysilane et conservée à-20 ° C pour une utilisation à long terme. Les concentrations de protéine au-dessus de 0,4 mg/mL sont recommandées pour le protocole décrit ci-dessous. Par conséquent, faible exprimant des protéines peuvent exiger une étape de concentration avant l’impression de l’échantillon et le stockage. Néanmoins, un principal avantage de cette technique est le faible volume de protéine nécessaire (50 μg de protéines est suffisante pour exécuter > 2 000 écrans), aux côtés de la consommation de protéines de requête minimale (20 à 25 μg par écran de doublons). Utilisant le protocole et les équipements décrits ici, et autant de bibliothèques sont disponibles, des résultats pour les protéines de requêtes individuelles peuvent être générés un jour ouvrable.
Un défi majeur dans la détection des interactions de protéine dans l’environnement extracellulaire découle de leur caractère typiquement faible ou transitoire, qui s’oppose à une identification par des méthodologies plus couramment utilisés. Accroître l’avidité de liaison grandement améliore la sensibilité pour la détection des protéines faibles interactions9,10,11. Basé sur ce principe que nous avons développé une méthode pour multimerize les protéines de la requête (exprimées en fusion Fc) à l’aide de protéine A-enduit perles4,5. Pour éviter toute éventuelle inactivation de la protéine de la requête par marquage aléatoire, nous plutôt étiqueter une immunoglobuline humaine hors de propos G avec Cy5 et ajoutez-le ainsi que de la protéine de requête pour les billes de protéine A, éliminant ainsi tous les artefacts en raison de la conjugaison directe d’un teindre à la protéine d’intérêt. Étant donné les affinités micromolaires de plusieurs paires de corécepteur, les complexes multivalents augmentent considérablement le rapport signal sur bruit, par rapport aux protéines de requête Fc-fusion projetés en protéines solubles4.
En résumé, le but du présent protocole est de décrire la préparation de lames microarray contenant une bibliothèque de protéines extracellulaires préexistant pour l’identification des interactions de récepteur-ligand. Nous passons en revue les étapes de la diapositive, impression, suivi d’un protocole de dépistage d’une protéine d’intérêt à la bibliothèque de protéines extracellulaires. De plus, on décrit une méthode pour la détection améliorée d’ePPIs issu des microbilles pour atteindre une avidité accrue de la protéine étudiée. La technologie de microarray de protéine extracellulaire décrite ici représente une approche rapide, robuste et efficace pour le dépistage et détection ePPI roman avec faible de faux positifs et en utilisant seulement microgramme par quantités de la protéine de la requête en vertu de enquête. Cette technologie a alimenté de nombreuses études qui ont fourni des renseignements pertinents sur jusque-là inconnues des fonctions cellulaires et voies de signalisation pour une variété de récepteurs12,13, dont14d’immunoregulators virale, et peut être utilisé pour désactiver orphanize toute protéine extracellulaire d’intérêt.
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Protocole
1. génération d’une bibliothèque d’extracellulaires protéines humaines
- Dresser une liste des récepteurs de surface cellulaire ou des protéines sécrétées d’intérêt pour générer la bibliothèque de microarray de protéine. Familles de protéines spécifiques (par exemple, la superfamille des immunoglobulines) ou protéines sélectivement exprimé en particulier cellules types peuvent être sélectionnés pour l’étude.
- Pour les récepteurs de surface cellulaire, déterminer les limites du domaine extracellulaire (DPE) en identifiant le peptide signal et régions transmembranaires à l’aide d’outils logiciels. Certains des outils librement accessibles en ligne, sont référencés dans la Table des matières16,15,17,18.
- Synthétiser la DPE pour les gènes d’intérêt et clone dans le vecteur pertinent. Protéines sécrétées ou les récepteurs de DPE de STM fusionnés à un certain nombre de balises d’affinités communes peuvent être purifiés des milieux conditionnés des cellules transfectées avec le vecteur approprié ou de systèmes d’expression baculovirus-insecte cellule.
Remarque : Les systèmes basés sur les cellules mammifères (comme HEK/293 ou cellules CHO) sont recommandés pour maximiser la probabilité de repliement des protéines correcte et ajout de modifications post-traductionnelles pertinentes comme la glycosylation. - Purifier les protéines en méthodes de purification d’affinité standard. Des efforts antérieurs ont décrit des procédures automatisées ou semi-automatisées appropriées pour la purification des centaines de protéines qui peuvent être redimensionnées pour générer l’ensemble des protéines d’intérêt9,19,20, 21.
Remarque : SDS-PAGE, chromatographie d’exclusion (S) ou multi-angle laser light scattering (centres commerciaux) sont recommandés pour évaluer toute agrégation non covalents et contrôle de la qualité globale de la préparation de la protéine. - Protéines à 200 ou 400 μg/mL si possible, de régler et de diluer les stocks avec 80 % de glycérol pour le stockage à long terme dans des flacons cryogéniques à-20 ° C. Ceux-ci représentent les stocks maîtres et doivent être accessible uniquement lorsque c’est nécessaire.
- Transférer des aliquotes de chaque protéine (100 μL) aux plaques de 96 puits (plaques de stock), sceller avec du papier adhésif et conserver à-20 ° C jusqu'à microarray préparation. Plaques de stock sont générés afin de minimiser les cycles de gel-dégel et assurer la stabilité des protéines.
2. impression de Microarray de protéine extracellulaire
- Utiliser un microarrayer standard pour l’impression de la diapositive. L’instrument utilisé pour le protocole décrit ici a une capacité de 57 diapositives/exécuter et utilise une tête d’impression holding 48 bornes de repérage. Ces broches générer des taches de ~ 100 μm de diamètre séparés par une distance de spot à repérer de ~ 350 μm et dessine 0,25 μL / charge. Dans cette configuration, jusqu'à 8 000 spots par lame peuvent être logées.
- Générer des plaques de travail (384 plats, 10 μL/puits) des plaques stocks. Effectuez cette étape manuellement avant l’impression de diapositives à l’aide de la microarrayer. Ensuite, repérez les protéines avec des épingles de détachage quill-type sur glissières epoxysilane à 60 % d’humidité (pour éviter la déshydratation des taches protéiques).
Remarque : Cy3 marqués d’albumine sérique Bovine (BSA) peut être repéré en doublons entre chaque échantillon de protéine (5 μg/mL en PBS/40% glycérol) pour visualiser le tableau pour masque raccord (voir section 4). Bien que recommandé, cette étape est facultative. - Après impression, supprimer les diapositives de microarray de protéine de l’environnement humidifié et bloquer du jour au lendemain avec 5 % de lait dans le PBST pour inactiver la surface.
Remarque : L’approche privilégiée consiste à utiliser un brumisateur à ultrasons pour générer une fine brume de bloquant la solution qui se dépose sur la surface de glissement. - Stocker les diapositives à-20 ° C à 50 % de glycérol pour éviter le gel.
3. préparation des appâts multivalents Complexes
Remarque : Les Interactions entre protéines extracellulaires sont souvent caractérisées par des affinités faibles. Pour activer la détection de ces interactions en augmentant l’avidité de liaison, une approche multivalente basée sur la capture de la protéine de la requête, exprimée en Fc-tag DPE, microbilles de protéine A-enduit a été développé4.
- Étiqueter le transporteur IgG utilisée pour la détection avec Cy5 monoreactive colorant et séparer le colorant libre à l’aide de colonnes de dessalement. Déterminer le colorant aux ratios protéines en mesurant l’absorbance UV à 280 et 650 nm.
Remarque : Les ratios protéines-colorant entre 2,0 et 4,0 sont normalement utilisés. Il est recommandé de faire tourner les conjugués Cy5 à 100 000 x g pendant 15 min enlever d’éventuels agrégats solubles en raison du processus de labellisation. - Déterminer le ratio optimal de faisant-à-protéine par titrage de la protéine A contre une quantité constante de la protéine de la requête. Le volume minimal saturante de perles où aucune protéine Fc-tag libre ne reste, telle que mesurée par dosage compétitif déterminé par interférométrie à biolayer, est utilisé pour le dépistage.
- Former les complexes de protéine faisant en incubant la requête Fc-le tag et le Cy5-IgG avec des microbilles de protéine A et mélanger sur un rotateur de tube en PBS pendant 30 min à température ambiante, Abrie de la lumière.
- Pour former ces complexes, utiliser la protéine de requête à une concentration finale de 20 μg/mL. Pour calculer le rapport molaire des protéines de la requête et Cy5-IgG, divisez le poids moléculaire de la protéine de la requête par le poids moléculaire de l’IgG (150 000 Da) et en multipliant par 40 μg/mL pour déterminer la concentration de Cy5-IgG nécessaire.
- Supplément des échantillons avec des protéines solubles A (1 mg/mL) immédiatement avant l’incubation avec la biopuce glisse (voir la section 4.2 ci-dessous) afin d’empêcher la liaison de toute protéine libre A perles pour les protéines de fusion de Fc qui peuvent être présents sur le tableau.
Remarque : Le volume réactionnel final peut varier selon la chambre de station ou incubation d’hybridation utilisée. L’appareillage décrit dans la Table des matières permet l’incubation échantillon utilisant des volumes relativement faibles (~ 200 μL / diapositive).
4. extracellulaire protéines Microarray de dépistage et de traitement.
Remarque : Il existe un certain nombre de fabricants qui offrent des plateformes de traitement automatique. Si une station d’hybridation n’est pas disponible, les étapes suivantes peuvent être effectuées manuellement, veillant à ce qu’il y a un volume suffisant de tampon de garder les lames immergées en permanence.
- Réchauffer les diapositives à la température ambiante et rincer avec PBS/0.1% Tween 20 (PBST) pour enlever le glycérol résiduelle avant le chargement de la station d’hybridation.
- Utiliser le protocole de dépistage suivants :
- Lavez-les avec PBST pendant 1 min.
- Charger 200 μL de la protéine A de 1 mg/mL dans le lait PBS/5% et incuber pendant 30 minutes afin d’empêcher la protéine non complexé un microbilles de se lier aux protéines Fc qui peuvent être présents dans la biopuce.
- Laver cinq fois avec PBST pendant 1 min.
- Charger 200 μL de la requête : microbilles complexe en présence de la protéine A de 1 mg/mL et incuber pendant 30 minutes.
- Lavez-les avec PBST pendant 1 min.
- Après hybridation, rincer les lames avec de l’eau, placer en individuels 50 mL tubes coniques et sécher par rotation à 900 x g pendant 5 min.
- Enfin, scanner les diapositives avec un scanner de microarray appropriée détecter Cy3 (si BSA-Cy3 a été imprimé) et la fluorescence Cy5 en excitant à 532 et 635 nm, respectivement.
- Effectuer une analyse de données en utilisant l’analyse de données microarray qui l’accompagne. La liste des baies concernées (comme un fichier .gal) est chargée dans le logiciel d’extraction de données. À ce stade, utiliser les spots de Cy3-BSA pour trouver des blocs et utiliser les options d’ajustement automatique dans le logiciel, suivi d’un alignement manuel des fonctionnalités lorsque cela est nécessaire. Enregistrer les fichiers sous forme de fichiers .gpr pour une analyse ultérieure.
5. analyse
- Enregistrer les données dans les fichiers GPR et processus de R en utilisant le paquet Leduc, couramment utilisé pour l’analyse de microarray data4,5.
- Pour le prétraitement, fond de correction et normalisation au sein de la diapositive. Étant donné que chaque protéine est imprimé en taches dupliqués, combiner les deux mesures répétées pour créer une partition unique pour cette protéine dans la bibliothèque.
- Calculer les scores pour chaque diapositive et analyser les résultats de l’intersection des scores élevés des candidats entre les diapositives.
- Utilisez microarrays en double de tirages distincts au contrôle de la variabilité de la diapositive et intersection parcelles représentant des données de deux écrans appeler finales hits.
- Enfin, effectuer un niveau supplémentaire de filtrage afin d’exclure des protéines promiscuités dans le tableau. Ces liants non spécifiques sont identifiés comme protéines dépassant un seuil spécifique frappé fréquence tel que défini par l’utilisateur à travers les écrans indépendants.
Remarque : Ce protocole est décrit en détail dans Tom et coll. 20135. Dans notre cas le liant non-spécifiques appelant repose sur la détermination de la cumulative de la proie des taux de succès, et un seuil d’élimination pilotés par les données de 5 % est utilisé.
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Résultats
Un schéma du flux de travail pour la technologie des microréseaux protéine extracellulaire est illustré à la Figure 1. Une fois les lames microarray contenant la bibliothèque de protéines extracellulaires sont disponibles, la projection de la protéine d’intérêt et des données d’analyse peut être complétée en un jour. Nombreuses interactions physiologiquement pertinentes entre les récepteurs membranaires incorporées sont caractérisées par la forces de liaison ...
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Discussion
Un nombre important de récepteurs orphelins demeure dans le génome humain, et nouveaux partenaires interdépendants continuent d’émerger des protéines extracellulaires avec des ligands précédemment caractérisées. Définir les interactions de récepteur-ligand dans l’homme et les organismes modèles est essentielle pour comprendre les mécanismes qui régissent la communication cellulaire lors de l’homéostasie, comme dérèglement conduisant à la maladie et par conséquent informer nouveaux ou améliorés options thérapeutiques. Néa...
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Déclarations de divulgation
B.H., Sahm-R et M-N.M. sont employés de Genentech et actions propres effectuées dans le groupe de Genentech Inc. / Roche.
Remerciements
Nous remercions Philamer Calses et Kobe Yuen pour la lecture critique du manuscrit. Nous sommes reconnaissants à Randy yens pour les excellents conseils techniques.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Glycérol Ultra Pur MB Grade | USB Corporation | 56-81-5 | Stockage des protéines |
| Tampon bloquant SeptoMark ; | Zeptosens | BB1, 90-40 | Tampon bloquant lames de microréseaux Albumine |
| sérique bovine | Roche | 03-117-957-001 | Commande de lames pour l’ajustement du masque (en option) |
| Plaques multipuits en polypropylène | Greiner Bio One | 82050-678 | Stockage des protéines |
| Plaques multipuits en polypropylène | Arrayit | MMP384 | Impression sur lames |
| NanoPrint LM60, ou contact similaire microarrayer | Arrayit NanoPrint | LM60, ou un microarrayer de contact similaire | Impression de diapositives |
| Micro broches d’observation | Arrayit | Micro broches d’observation | Impression de diapositives |
| Station de blocage ZeptoFOG | Zeptosens | Station de blocage ZeptoFOG, 1210 | Bloc de lames après impression |
| Lait écrémé en poudre | Thermo Fisher | LP0031 | Solution de blocage |
| Lame en verre revêtue d’époxysilane | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray |
| Slide Set de supports en verre et de supports de diapositives | Wheaton | 900303 | Stockage de lames |
| Cy5 colorant monoréactif | GE Healthcare | PA23031 | Marquage de l’albumine |
| Cy5 Colorant monoréactif | GE Healthcare | PA25001 | Human Étiquetage IgG |
| Colonne de dessalage Pro-spin | Princeton Séparations | CS-800 | Enlever le colorant libre |
| Joint d’étanchéité en feuille d’aluminium | AlumaSeal | F-384-100 | Plaques de stock d’étanchéité |
| Flacons cryogéniques en polypropylène | Corning | 430658 | Master pour le stockage |
| Microbilles de protéine A | Miltenyi | 120-000-396 | Interroger la multimérisation des protéines |
| IgG humaines | Jackson Immunoresearch | & nbsp ; 009-000-003 | IgG non pertinentes pour l’étiquetage de |
| la protéine A | Sigma | ; P7837 | Blocage de lames de microréseaux |
| Station d’hybridation, a-Hyb ou similaire | Miltenyi | Station d’hybridation, a-Hyb ou similaire | Traitement automatisé des microréseaux (en option) |
| Scanner GenePix 4000B ou similaire | Dispositifs moléculaires | Scanner GenePix 4000B ou similaire | Balayage de lames |
| GenePix Pro ou logiciel d’extraction de données équivalent | Dispositifs moléculaires | GenePix Pro ou logiciel d’extraction de données équivalent | Traitement des données |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Logiciel en ligne de l’Université technique du Danemark Outil de | prédiction pour déterminer la présence et l’emplacement des sites de clivage des peptides du signal | |
| Serveur TMHMM 2.0 | DTU Bioinformatics, Logiciel en ligne de l’Université technique du Danemark | Prédiction des hélices transmembranaires dans les protéines | |
| Phobius | Logiciel en ligne du Centre de bioinformatique de Stockholm | Une topologie transmembranaire combinée et un prédicteur de peptides de signal | |
| TOPCONS Logiciel en ligne de l’Université de | Stockholm | Prédiction de la topologie membranaire et des peptides de signal |
Références
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Réimpressions et autorisations
