Technologie des microréseaux protéine extracellulaire pour détection haut débit des Interactions Ligand-récepteur de faible affinité

Summary

Nous présentons ici un protocole à l’écran une protéine extracellulaire microarrays pour l’identification des interactions ligand-récepteur roman en haut débit. On décrit également une méthode pour améliorer la détection des interactions protéine-protéine transitoires en utilisant des complexes protéine-faisant.

Abstract

Facteurs sécrétés, attaché à la membrane des récepteurs et leurs partenaires d’interactions sont les principaux régulateurs de la communication cellulaire et l’initiation des cascades de signalisation au cours de l’homéostasie et la maladie et ainsi représentent des cibles thérapeutiques. Malgré leur pertinence, ces réseaux d’interactions reste nettement sous-représentées dans des bases de données courantes ; par conséquent, plus les protéines extracellulaires n’ont aucun partenaire de liaison documentée. Cet écart est principalement en raison de relever les défis associés à l’étude des protéines extracellulaires, notamment de l’expression des protéines fonctionnelles et l’affinité faible, faible, interactions protéine souvent établies entre les récepteurs de surface cellulaire. Le but de cette méthode consiste à décrire l’impression d’une bibliothèque de protéines extracellulaires dans un format « microarray » pour le dépistage des interactions protéine-protéine. Pour activer la détection des interactions faibles, on décrit une méthode basée sur la multimerization de la protéine de requête à l’étude. Couplé à cette approche axée sur les faisant multimerization de MULTIVALENCE accrue, le microarray de protéine permet une détection robuste d’interactions protéine-protéine transitoire en haut débit. Cette méthode offre une échantillon rapide et faible consommation-approche pour l’identification de nouvelles interactions applicables à n’importe quelle protéine extracellulaire. Impression de microarray de protéine et le protocole de dépistage sont décrits. Cette technologie sera utile pour les chercheurs qui cherchent une méthode robuste à la découverte des interactions de protéine dans l’espace extracellulaire.

Introduction

La méthode examinée ici décrit l’impression d’une collection de protéines extracellulaires dans un format « microarray », suivie d’une méthode de dépistage d’une cible d’intérêt contre cette bibliothèque. Nous avons identifié des protéines multimerization comme une étape cruciale pour la détection des interactions caractérisées par affinités de liaison faible. Pour améliorer la détection de ces interactions, les auteurs décrivent un protocole basé sur multimerization de la protéine de requête d’intérêt à l’aide de microbilles.

Sécrétée et cell surface protéines exprimées (collectivement appelées protéines extracellulaires) ainsi que leurs p....

Protocol

1. génération d’une bibliothèque d’extracellulaires protéines humaines

1. Dresser une liste des récepteurs de surface cellulaire ou des protéines sécrétées d’intérêt pour générer la bibliothèque de microarray de protéine. Familles de protéines spécifiques (par exemple, la superfamille des immunoglobulines) ou protéines sélectivement exprimé en particulier cellules types peuvent être sélectionnés pour l’étude.
2. Pour les récepteurs de surface cellulaire, déterminer les limites du domaine extracellulaire (DPE) en identifiant le peptide signal et régions transmembranaires à l’aide d’outils logiciels. Certains des outils librement accessibles en ligne, sont....

Results

Un schéma du flux de travail pour la technologie des microréseaux protéine extracellulaire est illustré à la Figure 1. Une fois les lames microarray contenant la bibliothèque de protéines extracellulaires sont disponibles, la projection de la protéine d’intérêt et des données d’analyse peut être complétée en un jour. Nombreuses interactions physiologiquement pertinentes entre les récepteurs membranaires incorporées sont caractérisées par la forces de liaison .......

Discussion

Un nombre important de récepteurs orphelins demeure dans le génome humain, et nouveaux partenaires interdépendants continuent d’émerger des protéines extracellulaires avec des ligands précédemment caractérisées. Définir les interactions de récepteur-ligand dans l’homme et les organismes modèles est essentielle pour comprendre les mécanismes qui régissent la communication cellulaire lors de l’homéostasie, comme dérèglement conduisant à la maladie et par conséquent informer nouveaux ou améliorés options thérapeutiques. Néa.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycérol Ultra Pur MB Grade	USB Corporation	56-81-5	Stockage des protéines
Tampon bloquant SeptoMark  ;	Zeptosens	BB1, 90-40	Tampon bloquant lames de microréseaux Albumine
sérique bovine	Roche	03-117-957-001	Commande de lames pour l’ajustement du masque (en option)
Plaques multipuits en polypropylène	Greiner Bio One	82050-678	Stockage des protéines
Plaques multipuits en polypropylène	Arrayit	MMP384	Impression sur lames
NanoPrint LM60, ou contact similaire microarrayer	Arrayit NanoPrint	LM60, ou un microarrayer de contact similaire	Impression de diapositives
Micro broches d’observation	Arrayit	Micro broches d’observation	Impression de diapositives
Station de blocage ZeptoFOG	Zeptosens	Station de blocage ZeptoFOG, 1210	Bloc de lames après impression
Lait écrémé en poudre	Thermo Fisher	LP0031	Solution de blocage
Lame en verre revêtue d’époxysilane	Nextrion Slide E	1064016	Microarray
Slide Set de supports en verre et de supports de diapositives	Wheaton	900303	Stockage de lames
Cy5 colorant monoréactif	GE Healthcare	PA23031	Marquage de l’albumine
Cy5 Colorant monoréactif	GE Healthcare	PA25001	Human Étiquetage IgG
Colonne de dessalage Pro-spin	Princeton Séparations	CS-800	Enlever le colorant libre
Joint d’étanchéité en feuille d’aluminium	AlumaSeal	F-384-100	Plaques de stock d’étanchéité
Flacons cryogéniques en polypropylène	Corning	430658	Master pour le stockage
Microbilles de protéine A	Miltenyi	120-000-396	Interroger la multimérisation des protéines
IgG humaines	Jackson Immunoresearch	& nbsp ; 009-000-003	IgG non pertinentes pour l’étiquetage de
la protéine A	Sigma	; P7837	Blocage de lames de microréseaux
Station d’hybridation, a-Hyb ou similaire	Miltenyi	Station d’hybridation, a-Hyb ou similaire	Traitement automatisé des microréseaux (en option)
Scanner GenePix 4000B ou similaire	Dispositifs moléculaires	Scanner GenePix 4000B ou similaire	Balayage de lames
GenePix Pro ou logiciel d’extraction de données équivalent	Dispositifs moléculaires	GenePix Pro ou logiciel d’extraction de données équivalent	Traitement des données
Signal P4.1	DTU Bioinformatics, Logiciel en ligne de l’Université technique du Danemark Outil de		prédiction pour déterminer la présence et l’emplacement des sites de clivage des peptides du signal
Serveur TMHMM 2.0	DTU Bioinformatics, Logiciel en ligne de l’Université technique du Danemark		Prédiction des hélices transmembranaires dans les protéines
Phobius	Logiciel en ligne du Centre de bioinformatique de Stockholm		Une topologie transmembranaire combinée et un prédicteur de peptides de signal
TOPCONS Logiciel en ligne de l’Université de	Stockholm		Prédiction de la topologie membranaire et des peptides de signal