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Article de méthode

Microdialyse d’acides aminés excitateurs durant les enregistrements EEG en se déplaçant librement des Rats

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DOI :

10.3791/58455

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8 novembre 2018

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1Department of Medical Sciences, Section of Pharmacology, Neuroscience Center, University of Ferrara and National Institute of Neuroscience

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici une méthode pour en vivo microdialyse analyser le communiqué de l’aspartate et du glutamate dans l’hippocampe ventral de rats épileptiques et non-épilepsie, en combinaison avec des enregistrements EEG. Les concentrations extracellulaires de l’aspartate et le glutamate peuvent être corrélées avec les différentes phases de la maladie.

Résumé

Microdialyse est une technique bien établie neuroscience qui met en corrélation les changements de neurologiquement actives substances diffusant dans l’espace interstitiel du cerveau avec le comportement et/ou des résultats spécifiques d’une pathologie (par exemple, saisies pour l’épilepsie). Lors de l’étude de l’épilepsie, la technique de la microdialyse est souvent associée à court terme ou même à long terme vidéo-électroencéphalographie (EEG suivi afin d’évaluer la fréquence des crises spontanées, de gravité, de progression et de regroupement). La microdialyse-EEG combiné repose sur l’utilisation de plusieurs méthodes et instruments. Ici, nous avons réalisé en vivo microdialyse et continue vidéo-EEG, enregistrement de moniteur glutamate et aspartate l’écoulement au fil du temps, dans les différentes phases de l’histoire naturelle de l’épilepsie dans un modèle de rat. Cette approche combinée permet l’appariement des changements dans la libération des neurotransmetteurs, avec des étapes spécifiques de l’évolution de la maladie et la progression. La concentration d’acides aminés dans le dialysat est déterminée par chromatographie liquide. Nous décrivons ici les méthodes et les grandes lignes les principales mesures de précaution un devraient prendre pendant en vivo microdialyse-EEG, avec une attention particulière à la chirurgie stéréotaxique, stimulation basale et élevé de potassium au cours de la microdialyse, profondeur enregistrement de l’électrode EEG et analyse de chromatographie liquide à haute performance de l’aspartate et du glutamate dans le dialysat. Cette approche peut être adaptée pour tester une variété de médicaments ou d’une maladie induite par les changements des concentrations physiologiques de l’aspartate et du glutamate dans le cerveau. Selon la disponibilité d’un test analytique approprié, il peut servir de plus pour tester différentes molécules solubles lorsque vous employez des enregistrement EEG en même temps.

Introduction

Pour donner un aperçu de la déficience fonctionnelle d’induite par le glutamate excitateur et la neurotransmission inhibitrice GABAergique, ayant pour résultat des saisies spontanées dans l’épilepsie du lobe temporal (TLE), nous avons systématiquement suivi des concentrations extracellulaires de GABA1 et plus tard les niveaux de glutamate et l’aspartate2 par microdialyse dans l’hippocampe ventral de rats à divers moments de la maladie naturelle du cours, c'est-à-dirependant le développement et la progression de l’épilepsie. Nous avons profité du modèle TLE, pilocarpine chez les rats, qui imite la maladie très précisément en termes de changements comportementaux, électrophysiologique et histopathologiques3,4 et nous avons une corrélation entre la concentration dialyse aminés acides à ses différentes phases : la phase aiguë après l’insulte épileptogène, la phase de latence, le temps de la première saisie spontanée et la chronique phass5,6,7. Encadrant les phases de la maladie a été activée par la surveillance à long terme de vidéo-EEG et l’EEG précis et caractérisation clinique des crises spontanées. Application de la technique de la microdialyse associées au contrôle de vidéo-EEG à long terme nous a permis de proposer des hypothèses mécanistiques de neuropathologie TLE. En résumé, la technique décrite dans ce manuscrit permet l’appariement des altérations neurochimiques dans une zone du cerveau définie avec le développement et la progression de l’épilepsie chez un modèle animal.

Couplés, constituées d’une électrode de profondeur juxtaposée à une canule microdialyse, sont souvent employés dans des études de recherche de l’épilepsie où les changements dans les neurotransmetteurs, métabolites ou des substrats énergétiques doivent être corrélée à l’activité neuronale. Dans la grande majorité des cas, il est utilisé en comportement librement les animaux, mais il peut être également effectuée d’une manière similaire à des êtres humains, par exemple, chez des patients épileptiques pharmaco-résistante, objet d’une enquête d’électrode profondeur avant la chirurgie,8. Les enregistrement EEG et dialyse collection peuvent être effectués séparément (par exemple, l’implantation de l’électrode dans un hémisphère et la microdialyse sonde dans l’autre hémisphère ou même effectuer la microdialyse dans un groupe d’animaux lors de l’exécution l’EEG seule dans un autre groupe d’animaux). Toutefois, les électrodes de couplage aux sondes peut présenter des avantages multiples : il simplifie la chirurgie stéréotaxique, limite les dommages aux tissus d’un seul hémisphère (tout en laissant l’autre, intact, comme un contrôle pour des études histologiques) et homogénéiser les résultats que ces proviennent de la même région du cerveau et le même animal.

En revanche, la préparation de l’appareil de sonde-électrode microdialyse couplés exige des compétences et le temps si c’est fait maison. On pourrait passer des quantités relativement élevées d’argent si acheté sur le marché. En outre, quand des sondes microdialyse (pointes de test sont généralement de 200 à 400 µm de diamètre et de 7 à 12 mm de long)9et des électrodes EEG (extrémités des électrodes sont généralement de 300 à 500 µm de diamètre et assez longtemps pour atteindre la structure du cerveau d’intérêt10) sont couplé, cet appareil monté représente un objet relativement lourd et encombrant sur un côté de la tête, ce qui est gênant pour les animaux et sujette à être perdu surtout quand il est connecté à la pompe de dialyse et le système d’enregistrement EEG fil dur. Cet aspect est plus pertinent chez les animaux épileptiques qui sont difficiles à manipuler et moins adaptative pour les sessions de microdialysis. Les techniques chirurgicales adéquates et des soins postopératoires appropriés peuvent entraîner des implants de longue durée qui incommode animaux minime et devraient être poursuivis pour des expériences de combinatoire microdialyse-EEG10,11, 12.

Les avantages et les limites de la technique de la microdialyse ont été examinées en détail par de nombreux chercheurs en neurosciences. Son principal avantage sur les autres en vivo perfusion techniques (p. ex., débit rapide push pull ou perfusion corticale coupe) est un petit diamètre de la sonde qui couvre une superficie relativement précise des intérêts13,14, 15. Deuxièmement, la membrane de la microdialyse crée une barrière physique entre le tissu et le perfusat ; par conséquent, les substances de poids moléculaire élevé ne se croisent pas et n’interfèrent pas avec l’analyse16,17. En outre, le tissu est protégé contre l’écoulement turbulent du perfusat18. Un autre avantage important est la possibilité de modifier le flux du perfusat pour maximiser la concentration de l’analyte dans le perfusat (c'est-à-dire, le processus de microdialyse peut être bien défini mathématiquement et peuvent être modifié pour le rendement élevé concentration de l’analyte dans l’échantillon)19. Enfin, la technique peut servir pour infuser les drogues ou les substances pharmacologiquement actives dans les tissus d’intérêt et de déterminer leur effet sur le site de l’intervention20. En revanche, microdialyse a un temps de résolution limitée (généralement plus de 1 min à cause du temps nécessaire pour le prélèvement d’échantillons) par rapport aux capteurs électrochimiques ou biologiques ; C’est une technique invasive qui provoque des lésions tissulaires ; elle compromet l’équilibre neurochimique au sein de l’espace autour de la membrane en raison du gradient de concentration continue de toutes les substances solubles qui pénètre dans le milieu de perfusion avec l’analyte d’intérêt. Enfin, la technique de la microdialyse est fortement influencée par les limites des techniques analytiques utilisées pour la quantification des rejets de substances dans le milieu de perfusion9,21,22,23 . La chromatographie liquide haute performance (HPLC) après que dérivatisation avec orthophthaldialdehyde pour l’analyse de glutamate et l’aspartate dans des échantillons biologiques a été bien validé24,25,26 , 27 et sa discussion approfondie est hors de la portée de ce manuscrit, mais les données produites à l’aide de cette méthode seront décrite en détail.

Lorsqu’effectué correctement et sans modification de la composition du perfusat, microdialyse peut fournir des informations fiables sur les taux de base de la libération des neurotransmetteurs. La plus grande partie des niveaux basales est probablement le résultat de l’effet d’entraînement émetteur du synapses9. Car dans bien des cas l’échantillonnage simple du neurotransmetteur dans l’espace synaptique supplémentaire n’est pas suffisant pour poursuivre les objectifs d’une enquête, la microdialyse technique peut être également employée pour stimuler les neurones ou à les priver d’importants ions physiologiques tels que K+ ou Ca2 +, afin d’évoquer ou d’empêcher la libération du neurotransmetteur.

Forte stimulation de K+ est souvent utilisée en neurobiologie pour stimuler l’activité neuronale non seulement chez les animaux éveillés, mais aussi dans des cultures primaires et organotypique. L’exposition d’un système nerveux sain à des solutions contenant de fortes concentrations de K+ (40-100 mM) évoque l’efflux de neurotransmetteurs28. Cette capacité des neurones à fournir une version supplémentaire en réponse à K haute+ peut être compromise aux animaux épileptiques1 et aux autres de29,de maladies neurodégénératives30. De même, le Ca2 + la privation (obtenue en perfusant les solutions gratuites Ca2 + ) est utilisée pour établir le calcium-dépendante libèrent des neurotransmetteurs plus mesurées par microdialyse. On croit généralement que libération de Ca2 + dépendante est d’origine neuronale, considérant que la libération de Ca2 + indépendante originaire de glia, mais de nombreuses études a soulevé une polémique sur la signification du Ca2 +-mesures sensibles de par exemple glutamate ou GABA9: ainsi, si possible, il est conseillé d’appuyer les études microdialyse microcapteur études, car ces derniers ont une résolution spatiale supérieure et les électrodes permet de se rapprocher de synapses31.

Concernant microdialysis études chez l’animal épileptique, il est important de souligner que les données obtenues de la plupart d'entre eux comptent sur la surveillance vidéo ou vidéo-EEG des saisies, c'est-à-direde la présence transitoire des signes et/ou symptômes anormaux excessive ou synchrone l’activité neuronale dans le cerveau32. Il y a quelques détails d’électrographiques saisies chez les animaux traité de pilocarpine qui devraient être examiné lors de la préparation de l’expérience. Les crises spontanées sont suivis d’activité déprimée avec fréquentes EEG intercritiques pointes3 et se produisent dans les clusters33,34. Sham opéré non-épilepsie animaux peut-être présenter des activité de saisie type35 et donc les paramètres pour l’évaluation des enregistrements EEG devraient être normalisés36 et, si possible, le calendrier des sessions de la microdialyse doit être bien défini. Enfin, nous recommandons fortement conformément aux principes et normes méthodologiques pour la surveillance de vidéo-EEG chez les rongeurs adultes de contrôle décrits par les experts de la Ligue internationale contre l’épilepsie et l’American Epilepsy Society dans leurs rapports très récents37 ,,38.

Nous décrivons ici la microdialyse du glutamate et aspartate en parallèle avec les enregistrements de vidéo-EEG à long terme chez les animaux épileptiques et leur analyse dans le dialysat par HPLC. On mettra l’accent sur les étapes critiques du protocole qu’on devrait prendre soin de, pour un meilleur résultat.

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Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvés par l’Université de Ferrare animalier institutionnel et Comité d’urbanisme et par le ministère italien de la santé (autorisation : D.M. 246/2012-B) conformément aux lignes directrices énoncées dans les communautés européennes Directive du Conseil du 24 novembre 1986 (86/609/CEE). Ce protocole est réglé spécifiquement pour la détermination de glutamate et l’aspartate dans dialysats de cerveau de rat obtenus dans le cadre de contrôle de l’EEG des sessions microdialyse chez des rats épileptiques et non-épilepsie. D'entre les matériaux décrits ici peuvent être facilement remplacés par ceux que l'on utilise dans son laboratoire pour enregistrements EEG ou microdialyse.

1. assemblage du dispositif microdialyse sonde-électrode

  1. Utiliser une électrode de deux-twisted 3 canaux (avec au moins un 20 mm couper la longueur de l’électrode d’enregistrement et une électrode de terre longue de 10 cm) et le coupler à une canule guide pour préparer l’appareil. Voir exemples de canule guide et électrode de 3 canaux pour la dialyse dans la Figure 1 a-1 b.
  2. Supprimer (Figure 1) et l’insérer (Figure 1), la canule guide métallique dans la canule factice en plastique plusieurs fois avant l’utilisation afin de faciliter son retrait au moment de son commutateur de sonde de microdialyse dans animal.
  3. Plier les fils torsadés d’enregistrement deux fois d’électrode (Figure 1E-1F) afin d’aligner les fils avec la canule factice du guide et couper la pointe de l’électrode (Figure 1) pour être de 0,5 mm de plus que l’extrémité de la canule guide (Figure 1 H) en utilisant le pied à coulisse numérique.
  4. Être prêt le diadème de silicium long de 1 mm (ø 2 mm, épaisseur 0. 3 mm ; Figure 1I) puis insérez l’extrémité de la canule guide et la pointe des électrodes tordus dans l’anneau de silicium à l’aide de la pince à épiler (Figure 1J). Fixez-le sur le pied du guide piédestal canule avec de la colle polymère d’action rapide ou de résine (Figure 1 K). Voir l’exemple des dispositifs dûment remplis dans la Figure 1 L et Figure 2 a.
  5. Stériliser l’appareil sous une lumière UV germicide pour 4 h. Retournez l’appareil quatre fois alors que chaque de ses côtés est exposée à la lumière pendant 1 h.
    Remarque : Nombreuses sondes électrodes et microdialyse artisanales peuvent être assemblés de façon similaire. La tête de ci-dessus décrit implant chez le rat a les dimensions suivantes : largeur 7 mm x 5 mm profondeur x longueur 10 mm du haut vers le piédestal orteil ; la pointe de l’implant est environ 11 mm de long, 600 µm de diamètre et tout le dispositif pèse environ 330-360 mg. L’appareil peut être réutilisé deux ou trois fois si (i) une longueur suffisante de l’électrode de terre est laissée sur le crâne pendant la chirurgie pour la prochaine utilisation et (ii) lorsque l’animal est tué, et l’appareil récupéré ainsi que le ciment dentaire, il est laissé dans l’acétone overnigh t, telle que le ciment peut être ventilé mécaniquement, et le dispositif lavés et stérilisés à nouveau.

2. stéréotaxique chirurgie

  1. Utilisez un support clip stéréotaxique appareil et sonde (Figure 2 b) pour l’implantation de l’appareil suivant les normes contemporaines pour interventions chirurgicales aseptiques et indolore39,40,41.
    1. Anesthésier les rats Sprague-Dawley adultes avec mélange de kétamine/xylazine (43 mg/kg et 7 mg/kg, i.p.) et le fixer sur le cadre stéréotaxique. Ajouter anesthésie isoflurane (1,4 % dans l’air ; 1,2 mL/min) à injection de kétamine/xylazine initiale car elle permet de contrôler la profondeur de l’anesthésie dans le temps. Raser la fourrure sur la tête de l’animal.
  2. Tamponner la surface de la peau tête de solution à base d’iode suivie d’éthanol à 70 % pour le préparer à la chirurgie aseptique39.
    1. Implanter le dispositif de canule-électrode de guide préparé en priorité (1,1 à 1,5) dans l’hippocampe ventral droit en utilisant les coordonnées suivantes : bar nez + 5,0 mm, A – 3,4 mm, L + 4,5 mm, P + 6,5 mm à bregma1,2. Suivez les techniques standard pour la chirurgie stéréotaxique10,11,12.
    2. S’assurer qu’il ne couvre pas les vis d’ancrage. Lors du montage sur l’appareil stéréotaxique, saisir l’appareil pour la tête de canule guide comme cela peut être facilement alignée sur le titulaire de la sonde.
  3. Ancrer l’appareil sur le crâne au moins quatre vis en acier inoxydable vissant dans l’os du crâne (1 vis sur la vis de gauche et 1 dans les plaques de droite os frontal, 1 vis dans la pariétale gauche et 1 vis dans les plaques d’os interpariétal). Ajouter une goutte de colle tissu plus fixer chaque vis à l’os du crâne.
    1. Couvrir la moitié des filetages avec ciment méthacrylique. Promouvoir la liaison du ciment en faisant des sillons peu profonds dans l’OS pour augmenter l’adhérence.
  4. Une fois que l’extrémité de l’appareil est placée dans le tissu cérébral, Torsadez le fil de l’électrode de terre environ 3 vis d’ancrage. Couvrir vis montés et l’appareil avec du ciment dentaire12,42,43.
  5. Surveiller les animaux pendant la chirurgie et pendant environ 1 h puis jusqu'à la verticale et se déplaçant autour de la cage. Conservez-les sur un coussin chauffant pour éviter l’hypothermie. Laissez les rats de récupérer au moins 7 jours après l’implantation de l’appareil.
  6. Surveillez les animaux au moins une fois par jour pendant 3 jours après la chirurgie pour des signes de douleur ou de détresse. Donner les animaux avec la crème antibiotique (gentamicine 0,1 %) à proximité du site incisé pour prévenir l’infection et un analgésique (tramadol 5 mg/kg, i.p.) pendant 3 jours pour prévenir la douleur post-opératoire.

3. Lobe Temporal épilepsie Induction de Pilocarpine et cession d’animaux de groupes expérimentaux

  1. Après une semaine de récupération post-chirurgicale, affecter les animaux au hasard aux groupes : (i) contrôle animaux recevant animaux véhicule et (ii) l’épilepsie qui recevront la pilocarpine. Utilisation un nombre proportionnellement plus élevé d’animaux pour épileptique groupe puisque pas tous de la pilocarpine administré à des rats se développera la maladie.
  2. Injecter une dose de méthylscopolamine (1 mg/kg, s.c.) et 30 min après, une injection unique de pilocarpine (350 mg/kg, i.p.) pour induire l’état de mal épileptique (SE). Injecter le méthylscopolamine et le véhicule (saline) pour les rats témoins. Utilisez la seringue de 1 mL avec aiguille 25G pour toutes les administrations i.p..
    1. Vérifier visuellement les animaux pour commencer à avoir des crises comportementales (déplacement vibrissa moins de 5 min, hochant la tête, clonage des extrémités des membres) et moins de 25 min pour cloner en permanence tout le corps (SE).
  3. Arrêter les SE 2 h après le début d’avoir un taux de mortalité environ de 25 % et une période de latence moyenne d’environ 10 jours par l’administration de diazépam (20 mg/kg, i.p.). Observer et enregistrer n’importe quel début de comportement saisie immédiatement après l’injection de pilocarpine et continuer pendant au moins 6 h par la suite.
  4. Donner la saline d’animaux (1 mL, i.p.) avec seringue de 1 mL de solution d’aiguille et de saccharose 25G (1 mL, p.o.) en utilisant la seringue de 1 mL et une aiguille de 17G alimentation flexible pendant 2-3 jours après SE à promouvoir la récupération de perte de poids de corps.
    1. Exclure les animaux qui n’atteignent pas le poids corporel initial au sein de la première semaine après la pilocarpine SE de l’étude (à l’exception du groupe aiguë tué 24h après SE, où le poids de corps suivi n’est pas possible).
  5. Affecter des animaux post-SE au hasard vers différents groupes expérimentaux (Figure 3) : aiguë de phase (où la microdialyse lieu 24h après SE), latence (7-9 jours après SE), première saisie spontanée (environ 11 jours après SE) et chroniques (période) commence environ 22 à 24 jours après SE, soit environ 10 jours après la première prise). Surveiller les animaux pour la survenue de crises spontanées.
    Remarque : Utiliser les critères d’inclusion / d’exclusion suivants pour d’autres expériences chez des rats épileptiques : développement de convulsif SE moins de 1 h après l’administration de pilocarpine ; le gain de poids durant la première semaine après SE et un positionnement optimal de la microdialyse sonde et l’électrode.

4. épileptique comportement suivi et l’analyse

  1. Une surveillance à long terme du comportement de l’épilepsie
    1. Environ 6 h après l’administration de pilocarpine (c'est-à-direà la fin de l’observation directe par les chercheurs), placer les animaux dans des cages propres maison et commencer la surveillance vidéo 24h.
    2. Continuer la vidéo 24h surveillance jusqu’au jour 5, à l’aide d’un système de vidéosurveillance numérique.
    3. Dès le jour 5, raccorder les rats dans leurs cages rectangulaires maison à captif système d’enregistrement de l’EEG et poursuivre la surveillance vidéo 24h.
    4. Les paramètres de l’amplificateur positionné à l’extérieur de la cage de Faraday (coefficient d’amplification fixe sur chaque voie selon la spécificité du signal EEG de chaque animal unique) et l’acquisition de démarrer l’EEG observer le signal EEG produit par non-connectés câbles. Utilisation d’échantillonnage taux de 200 Hz et passe-bas filtre ensemble à 0,5 Hz.
    5. Connectez l’animal aux câbles tenant la tête de l’animal entre deux doigts étirés d’une main et visser les raccords sur le socle de l’électrode à l’aide de l’autre main libre. Lancer l’acquisition.
      Mise en garde : Assurez-vous que le signal est exempt d’artefacts. Artefacts communs sont les pointes dépassant largement l’échelle.
    6. Un jour avant la microdialyse expérimenter, transférer les animaux dans le système d’EEG captif équipé de vérins de plexiglass pour microdialyse. Débranchez les animaux de l’EEG attacher le système de cage maison vissage les connecteurs de l’électrode sans retenue de l’animal. Placer l’animal dans les cylindres de plexiglass haute.
  2. Surveillance du comportement épileptique par jour avant et Pendant la session de la microdialyse
    1. Allumez l’amplificateur positionné à l’extérieur de la cage de Faraday. Ouvrez le logiciel de l’EEG. Démarrer l’acquisition EEG observer le signal EEG produite par câbles non-connectés.
    2. Connectez l’animal pour le système d’enregistrement EEG captif tenant la tête de l’animal entre deux doigts étirés d’une main et visser les raccords sur le socle de l’électrode à l’aide de l’autre main libre. Définir un coefficient d’amplification (gain) sur chaque canal d’amplificateur fonction signal d’électrode d’animal unique donc le signal EEG est à l’échelle. Laissez l’animal explorer la nouvelle cage (cylindre) pendant au moins 1 h sous l’observation directe du chercheur.
    3. NOTE : 24h avant la microdialyse expérience, les rats sont anesthésiés brièvement à l’isoflurane pour le commutateur de canules de guide à la microdialyse sonde. Profitez du moment où ils sont anesthésiés pour les relier au système d’enregistrement de l’EEG.
    4. Raccourcir ou prolonger le câble pendante selon des marchandises de l’animal. Assurez-vous que les câbles n’interfèrent pas avec les mouvements et la posture allongée de l’animal.
    5. Vérifier le cadrage de l’image correcte des caméras vidéo. Démarrer l’enregistrement de vidéo-EEG.
  3. Identification de saisies et de l’activité EEG
    1. Utilisez un logiciel de lecture pour regarder les vidéos. Faites défiler le film 8 fois plus rapide que le jouer en temps réel et individualiser les crises généralisées (voir animal à l’arrière avec clonus membre antérieur ou animaux d’élevage et de tomber avec clonus de la patte avant). Ralentir la vidéo et noter l’heure exacte du début et la fin de la saisie comportementale.
    2. Traiter les données en comptant le nombre de crises généralisées chez 24h d’enregistrements vidéo et leur expression en fonction de la fréquence des crises et de la durée que les valeurs moyennes de toutes les saisies observées en 24h.
    3. Définir les saisies de l’EEG comme les périodes d’activité paroxystique de haute fréquence (> 5 Hz) caractérisée par un > 3 voies incrément d’amplitude au niveau de référence avec la progression de la fréquence de spike qui dure pendant au moins 3 s2,44 ou similaires de28. Utiliser logiciel EEG pour traiter les enregistrements EEG brutes. Diviser les traces de l’EEG en fractions de 1 h. Copiez les fractions de traçage d’EEG de produire pour des logiciels d’analyse automatique de spike.
    4. Analyser les données d’activité EEG à l’aide de logiciels de l’EEG et paramètres prédéfinis (4.3.3.). Effectuer toutes les analyses vidéo dans deux chercheurs indépendants qui sont aveugles pour le groupe d’animaux analysés. En cas de divergence, leur faire réexaminer les données ensemble pour parvenir à un consensus45.

5. microdialyse

  1. In vitro les récupération de la sonde
    1. Préparer la sonde pour sa première utilisation selon les instructions du fabricant, il gère dans sa gaine de protection.
    2. Exécutez l’expérience en triple exemplaire : préparer trois tubes à essai 1,5 mL chargeant avec 1 mL de solution de Ringer contenant le mélange de standards (2,5 µM de glutamate) et 2,5 µM de l’aspartate. Mettre trois tubes à essai chargé 1,5 mL dans l’ensemble bloc de chauffage à 37 ° C, puis positionnez-le sur l’agitateur.
      Remarque : Utilisez les mêmes solutions standards pour les étalonnages de chromatographie.
    3. Sceller les tubes 1,5 mL avec le film de paraffine et le perforer par forte pince à épiler pour faire un trou d’environ 1 mm de diamètre.
    4. Prendre la sonde et l’insérer dans le trou fait dans le film de paraffine. Immerger la membrane au moins 2 mm sous le niveau de la solution. Difficulté plus la sonde à 1,5 mL tube de film de paraffine.
      Mise en garde : Veiller à ce que la pointe ne touche pas les parois de l’éprouvette de 1,5 mL.
    5. Se connecter à l’entrée de la sonde à la seringue, montée sur la pompe à perfusion à l’aide d’adaptateurs FEP-tuyaux et tubes. En option, utilisation fine alésage tube polyéthylène de 0,28 mm ID et 0,61 mm OD et adaptateurs de tuyaux colorés (adaptateurs de tuyaux rouge et bleu) pour les connexions.
    6. Démarrer la pompe à 2 µL/min et laisser le liquide apparaissent à l’extrémité de sortie. Raccorder la sortie de la sonde à 0,2 mL tube à essai à l’aide d’adaptateurs FEP-tuyaux et tubes de collecte.
      Remarque : Utiliser de FEP-tubes pour toutes les connexions. Couper la longueur désirée du tube à l’aide d’une lame de rasoir. Utiliser des adaptateurs de tubes de couleur différente pour l’entrée et la sortie de la sonde. Laissez la pompe fonctionner pendant 60 min. vérification des fuites et de bulles d’air. Il ne devraient pas être présents.
    7. Mettre la pompe le débit taux 2 µL/min et commencer à collecter les échantillons à la sortie du tuyau.
    8. Recueillir les trois échantillons de perfusat 30 min et trois échantillons de volume égal de solution dans l’éprouvette de 1,5 mL. Prélèvement des échantillons de volume égal de l’éprouvette de 1,5 mL toutes les 30 minutes à l’aide de la microseringue immergé dans la solution standard dans l’éprouvette de 1,5 mL.
    9. Répétez l’expérience (5.1.1-5.1.8) mise en place de la pompe le débit taux 3 µL/min (5.1.7) d’avoir une comparaison de récupération sonde lors de l’utilisation de deux débits de perfusion différents.
    10. Lorsque vous avez terminé, arrêter la pompe et rincer la tubulure avec de l’eau distillée, éthanol à 70 % et poussez l’air dedans. Stockez la sonde dans un flacon rempli d’eau distillée. Bien rincer la sonde en perfusant il à 2 µL/min de l’eau distillée avant le stockage.
    11. Analyser la concentration du glutamate et aspartate dans les échantillons par chromatographie (voir les détails ci-dessous ; 6,3).
    12. Calculer la récupération à l’aide de l’équation suivante :
      Récupération (%) = (Cperfusat /Cdialysé solution) x 100.
  2. Microdialyse sessions en se déplaçant librement des rats
    1. Procédures préparatives : sonde d’insertion et les essais, infusion réglage de pompe et commencer
      1. Préparer les sondes microdialyse pour la première utilisation selon le guide de l’utilisateur fabricant et remplissez-les avec une solution de Ringer. Couper environ 10 cm de long de FEP-tubes et reliez-les aux canules d’aspiration et de sortie de la sonde en utilisant les adaptateurs de tuyaux de différentes couleurs.
      2. Assurez-vous que le tube touche les adaptateurs avec aucun espace mort dans toutes les connexions.
      3. 5.2.1.3. 24h avant l’expérience de la microdialyse, anesthésier brièvement l’animal à l’isoflurane (5 % dans l’air) dans une chambre à induction jusqu'à ce que couché. Retirer la canule factice de son guide à l’aide de la pince à épiler et tenant la tête de l’animal fermement. Introduire la sonde de microdialyse, dotée d’une membrane dialysante, dans la canule guide et entreprise plus les canules microdialyse insérés dans leur guide de modeler.
        Mise en garde : Ne laissez pas la sonde toucher les parois de la gaine de protection de sonde lors de l’extraction.
      4. Mettre l’animal dans le cylindre de plexiglas et laissez-le explorer la nouvelle ambiance. Connecter l’animal au système captif enregistrement EEG comme décrit plus haut (suivez les points 4.2.2 et 4.2.3).
      5. Suivez l’éveillé et se déplaçant librement les mouvements de rat et connecter l’entrée de la sonde à la seringue de 2,5 mL avec aiguille de 22G émoussés contenant une solution de Ringer avec les adaptateurs de tuyaux. Pousser une solution de Ringer à l’intérieur de la sonde éjection 1 mL de solution de Ringer en 10 s poussant continuellement le piston de la seringue de 2,5 mL. Recherchez la goutte du liquide qui apparaissent sur la prise. La sonde est maintenant prête à l’emploi.
      6. Remplir la seringue de 2,5 mL reliée au FEP-tube par les adaptateurs de tuyaux avec une solution de Ringer et montez-les sur la pompe à perfusion. Démarrer la pompe à 2 µL/min. Laisser tourner toute la nuit.
        Remarque : Utilisez la longueur désirée de tous FEP-tube, mais calculer le volume mort de tubulure de savoir quand la stimulation K+ haute doit être démarrée et de corréler les données de quantification avec changements neurochimiques cerveau animal. La bulle d’air créée dans les tubes dans le flux de travail permet de calculer cette fois.
    2. Prélèvement d’échantillons au cours de la stimulation de potassium et de l’enregistrement EEG
      1. Vérifier l’absence de convulsions dans les 3 heures précédant le début du prélèvement (enregistrements de vidéo-EEG) et continuer à surveiller l’activité de saisie au cours de la microdialyse.
      2. Arrêter la pompe transportant les seringues de FEP-tube canulé remplis de solution de Ringer. Monture sur la pompe à une autre série de seringues 2,5 mL connecté au FEP-tube avec tubes adaptateurs remplis de solution de Ringer a mis à jour le contenant 100 mM K+ solution.
      3. Démarrer la pompe à 2 µL/min et laisser courir. Pour un remplissage plus rapide de la tubulure, régler la pompe à 5 µL/min pour le temps de remplissage. Vérifier l’absence de bulles d’air dans le système. S’assurer que le tube touche les adaptateurs avec aucun espace mort dans toutes les connexions.
      4. Tester la sonde si prêt à l’emploi des animaux tel que décrit ci-dessus (5.2.1.5).
        Remarque : Si pour une raison quelconque, la sonde ne fonctionne pas, changez-le. Dans ce cas, garder quelques sondes microdialyse préparés prêts à l’emploi près de la station de travail microdialyse-EEG. Déconnectez l’animal de câbles EEG et anesthésier brièvement à l’isoflurane, si nécessaires pour réaliser le changement.
      5. Raccordez le tuyau FEP-des seringues remplie avec une solution de Ringer à la canule d’aspiration de la sonde à chaque animal et d’attendre l’apparition de la goutte de liquide sur le bout de la sortie.
      6. Raccorder la sortie de la sonde au FEP-tuyau, ce qui conduit à la collection dans le tube à essai. Insérez le FEP-tube dans le tube à essai fermé 0,2 mL avec couvercle perforé. S’assurer que le tube reste dans l’endroit en le fixant avec un morceau de glaise à modeler.
      7. Continuer à faire fonctionner la pompe à 2 µL/min pendant 60 min sans prélèvement d’échantillons pour équilibrer le système (zéro échantillon).
      8. Collecter 5 échantillons de dialysat consécutives de 30 min (volume respectif de 60 µL) en conditions basales (une perfusion de solution de Ringer normale). Conserver les échantillons sur la glace.
      9. Calculer le temps qu’il faut liquide de passer de la pompe dans la tête de l’animal (selon volume mort de tubes, par exemple, temps de bulle d’air) et basculer le FEP-tube qui va de la seringue contenant une solution de Ringer normale de seringues contenant modification de solution de Ringer (100 mM K+) en ce moment sans arrêter la pompe. Vérifier l’absence de bulles d’air dans le système. Laisser la pompe tourner pendant 10 min.
        Mise en garde : À 10 min de forte stimulation K+ , les animaux ont tendance à se déplacer frénétiquement et présentent généralement un grand nombre de chien mouillé shakes (contrôle et hors animaux cluster saisie) ou comportements saisies (animaux épileptiques), alors soyez prêt à intervenir à protéger les tuyaux et les câbles de torsion.
      10. Après 10 min, passer le tuyau de la seringue contenant 100 mM K de+ Ringer solution à une solution de Ringer normale et laisser la pompe tourner. Ne pas éteindre la pompe pendant les changements de solution afin que qu’il y aura une goutte de liquide à l’extrémité du tuyau à brancher en ligne.
      11. Partir du moment où le dialysat contient potassium élevé, c'est-à-direaprès le prélèvement de la cinquième après équilibration du dialyse, recueillir les fractions dialyse (20 µL) toutes les 10 min pour les échantillons de dialysat supplémentaire 30 min 1 h. collecter 3 et arrêter la pompe. Stocker les échantillons sur la glace.
      12. Conserver les échantillons à-80 ° C après l’expérience jusqu'à l’analyse CLHP.
      13. Répétez que la microdialyse expérimenter pendant 3 jours consécutifs, sauf pour les aigus (24h) et premier groupe de saisie, dans lequel seul microdialyse session aura lieu les 24h après SE ou dans les 24 heures après la première saisie spontanée (Figure 3).
      14. À l’issue de chaque expérience, euthanasier l’animal avec un surdosage anesthésique et enlever le cerveau pour la vérification de la sonde et l’électrode de placement.
  3. Procédures post-microdialyse
    1. Rincer les sondes microdialyse utilisé avec de l’eau distillée et stockez-les dans un flacon rempli d’eau distillée jusqu'à la prochaine utilisation.
      Remarque : Les membranes réutilisés peuvent avoir augmenté la perméabilité ; Vérifiez pour la récupération de la sonde avant son utilisation répétée.
    2. Rincer la microdialyse ensemble mis en place (tuyaux, raccords et seringues) avec de l’eau distillée suivie d’éthanol à 70 %. Remplacer l’éthanol avec de l’air et stocker l’ensemble vers le haut dans un environnement stérile.
    3. Diviser les échantillons de dialysat basales en 20 fractions µL et n'utiliser qu’un seul 20 µL de fraction pour l’analyse de la concentration basale des acides aminés. Stocker le volume restant d’échantillon pour des analyses supplémentaires ou de confirmation à-80 ° C.
    4. Difficulté les cerveaux de 10 % de formol et assurer leur conservation par enrobage de paraffine1. De l’article le cerveau en tranches et leur coloration à l’hématoxyline et éosine. Examiner le cerveau pour sonde correcte et électrode placement1,2.
      Remarque : Difficulté les cerveaux de refroidissement 2-Méthylbutane et les stocker à-80 ° C. Utilisez n’importe quel autre coloration éprouvée sur les sections de tissu nerveux qui permet de visualiser le tube sonde et l’électrode.

6. chromatographie analyse du Glutamate et Aspartate

  1. Préparation de dérivatisation agent
    1. Mélanger les volumes respectifs 20:1 (v/v) de réactif d’orthophthaldialdehyde (OPA) et 2-mercaptoéthanol (5-ME) dans le flacon. Fermer le flacon à l’aide de la cloison étanche PAC et de l’air.
      Mise en garde : Travailler sous la hotte chimique.
    2. Vortex la solution préparée et mettez-la dans l’échantillonneur automatique en position de dérivatisation agent.
  2. Préparation des échantillons de dialysat
    1. Mettre l’insert en verre avec ressort de fond dans l’auto-échantillonneur brun de 2 mL. Préparer les flacons pour tous les échantillons mesurés en un seul lot.
    2. Prendre les échantillons de dialyse 20 µL du congélateur-80 ° C et laissez-les fondre. Retirer 1 µL de la solution et ajouter 1 µL d’étalon interne (IS) L-homosérine (50 µM) à 19 µL de l’échantillon, l’échantillon contient donc 2,5 µM de IS. Pipeter 20 µL de l’échantillon de dialyse dans l’insert en verre dans le flacon et sceller avec une cloison étanche à l’air.
    3. Placer les flacons contenant les échantillons dans l’échantillonneur automatique en utilisant le logiciel chromatographique d’étiqueter les échantillons dans leurs positions.
  3. Analyse chromatographique des échantillons pour déterminer la concentration de glutamate et l’aspartate
    1. Exécuter les analyses sur le système de chromatographe en phase liquide avec détection spectrofluorométrie. Détecter les acides aminés après que 2 min la précolonne dérivation avec 20 μL d’orthophthaldialdehyde/5-mercaptoéthanol 20:1 (v/v) ajouté à 20 μL d’échantillon.
    2. Préparation du système pour l’analyse des acides aminés. Allumez l’échantillonneur automatique, la pompe, le dégazeur, le détecteur et unité de contrôle avec l’ordinateur.
    3. Plonger les siphons dans les bouteilles contenant la phase mobile et purger les canaux de la pompe par chromatographie à utiliser pour l’analyse.
    4. Commencez à augmenter le débit de la phase mobile, vérification de la pression sur la colonne (par exemple, commencent à 0,2 mL/min et augmenter le débit supplémentaire 0,2 mL/min toutes les 5 min jusqu'à obtenir le flux de travail). Laissez le système exécute au travail flow 0,8 mL/min pendant au moins 1 h équilibrer la colonne.
      Mise en garde : Pression indique la présence de l’air dans le système. La pression ne doit pas dépasser 25 MPa.
    5. Régler le gain, sensibilité élevée et les longueurs d’onde d’excitation et d’émission sur le détecteur à 345/455 nm respectivement. Réinitialiser le signal du détecteur (voie).
    6. En utilisant le logiciel chromatographique, envoyer la méthode pour l’instrument. Maintenant, le chromatographe devrait être prêt à mesurer.
    7. Séparer les dialysat échantillons, avec un étalon dialysat échantillons ainsi que les normes (0,25 µM – 2,5 aspartate µM et du glutamate dans une solution de Ringer) sur la colonne chromatographique. Étalonner la méthode chromatographique et fixer les limites de détection et de quantification avant toute analyse d’échantillons de dialyse.
    8. Activer l’analyse unique ou créer la séquence des échantillons à analyser l’utilisation du logiciel de chromatographie et exécuter la séquence.
      Mise en garde : Exécuter plus d’un échantillon témoin et différents échantillons standards au sein de la séquence de dialysat échantillons afin de contrôler l’exactitude de la méthode.
    9. Une fois que les chromatogrammes sont acquis, les analyser avec le logiciel de chromatographie. Vérifier l’intégration des pics de l’intérêt dans la courbe d’étalonnage. Utiliser surface hauteur ou de la crête du pic pour la quantification.
    10. Une fois terminé l’enregistrement de l’échantillon remplissez la colonne et le système avec un solvant organique (par exemple, 50 % d’acétonitrile dans l’eau ultrapure) pour éviter que sa croissance de vieillissement et de la moisissure dedans.
    11. Arrêter le système.

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Résultats

Récupération de la sonde

Le recouvrement moyen (c.-à-d., la teneur moyenne des acides aminés dans le perfusat sous forme de pourcentage du contenu dans un volume égal de solution flacon) était 15,49 ± 0,42 % à un débit de 2 μL/min et 6,32 ± 0.64 à 3 μL/min pour le glutamate et 14,89 ± 0,36 % à un débit de 2 ΜL/min et 10.13 ± 0,51 à 3 μL/min pour l’aspartate lors de l’utilisation de la sonde de membrane de cuprophane. Si v...

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Discussion

Dans ce travail, nous montrons comment un enregistrement continu de la vidéo-EEG couplé avec la microdialyse peut être effectué dans un modèle expérimental d’ELT. Techniques d’enregistrement de vidéo-EEG sont utilisés pour diagnostiquer correctement les différentes phases de la progression de la maladie chez les animaux et la technique de la microdialyse est utilisée pour décrire les changements dans la libération de glutamate qui se produisent dans le temps (aucuns changements n’ont été trouvés pour aspartate dans une é...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Anna Binaschi, Paolo Roncon et Eleonora Palma pour leur contribution aux manuscrits publiés en priorité.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Électrode bi-torsadée à 3 canauxInvivo1, Plastic One, Roanoke, Virginie, États-UnisMS333/3-B/SPC
Canule de guidagede matériau Agn Tho’s, Lindigö ;, SuèdeMAB 4.15.ICMatériau
Résine KK2 PlastikElettra Sport, Lecco, ItalieKK2Matériau
Super Attack gel LoctiteHenkel Italia Srl, Milano, Italie2047420_71941matériel
Imalgene-KétamineMerial, Toulouse, France221300288 (AIC)Solution
XylazineSigma, Milan, ItalieX1251Matériau
Isoflurane-VetMerial, Toulouse, France103120022 (AIC)Solution
Altadol 50 mg/ ml - tramadolFormevet, Milan, Italie103703017 (AIC)Solution
Gentalyn 0,1 % crm - gentamycineMSD Italia, Rome, Italie20891077 (AIC)
Matériau ciment dentaire rapide simplexKemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, Royaume-UniACR811Matériau
GlasIonomer CX-Plus CementShofu, Kyoto, JaponPN1167Matériau
Porte-clip de sondeAgn Tho’s, Lindigö ;, Suèdep/n 100 5001Équipement
Histoacryl® ; Blue Topical SkinAdhesive TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USATS1050044FPMatériau
Valium 10 mg/2 ml - diazépamRoche, Monza, Italie019995063 (AIC)Matériau
Seringue de 1 mL avec aiguille 25GVetrotecnica, Padoue, Italie11.3500.05Matériau
d’alimentation flexible pour rat 17GAgn Tho’s, Lindigö ; Suède7206
Matériau Appareil Grass TechnologyGrass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, Californie, États-UnisM665G08Équipement (amplificateur AS40, boîtier de tête, câbles d’interconnexion, téléfacteur modèle RPSA S40)
acquisition de données modulaire et  ; système d’analyse MP150Biopac, Goleta, Californie, États-UnisMP150WSWSystème
vidéosurveillance numériqueAverMedia Technologies, Fremont, Californie, États-UnisV4.7.0041FDÉquipement
sonde de microdialyseAgn Tho’s, Lindigö ; SuèdeMAB 4.15.1.CuMatériau
sonde de microdialyseSynaptech, Colorado Springs, Colorado, États-UnisS-8010Matériau
chauffe-moteurGrant Instruments, Cambridge, AngleterreQBD2
Équipement agitateurCecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italie711
Équipement pompe à perfusionUniventor, Zejtun, Malte864équipement
tube en polyéthylène à alésage finSmiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, États-Unis800/100/100/100Matériau
des adaptateurs de tubes bleusAgn Tho’s, Lindig ö ; Suède1002Matériau
adaptateurs de tubes rougesAgn Tho’s, Lindig ö ; Suède1003Matériau
Seringue de 2,5 mL avec aiguille 22GChemil, Padoue, ItalieS02G22Matériau
bouchon de flaconCronus, Labicom, Olomouc, République tchèqueVCA-1004TB-100Matériau
septumThermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, États-UnisNational C4013-60 8 mm TEF/SILseptum Matériau
insert en verre avec ressort inférieurSupelco, Sigma, Milan, Italie27400-UMatériau
d’échantillonneur automatiqueNational Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, ItalieC4013-2Matériau
Contrôleur de système Smartline manager 5000 et unité de dégazageKnauer, Berlin, AllemagneV7602Équipement
Pompe à gradient quaternaire Smartline 1000Knauer, Berlin, AllemagneÉquipement
V7603détecteur spectrofluoréShimadzu, Kyoto, JaponRF-551
Équipement colonne chromatographiqueKnauer, Berlin, Allemagne25EK181EBJMatériau
pré-colonne chromatographiqueKnauer, Berlin, AllemagneP5DK181EBJMatériau
solution de phase mobile A0,1 M tampon de phosphate de sodium, pH 6,0Solution
solution de phase mobile BTampon phosphate de sodium à 40 % 0,1 M, 30 % méthanol, acétonitrile à 30 %, pH 6,5
Composition de la solution Ringeren mM : MgCl2 0,85, KCl 2,7, NaCl 148, CaCl2 1,2, 0,3 % BSA
solution Ringeren mM : MgCl2 0,85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0,3 % BSASolution
saline0,9 % NaCl, ph ajusté à 7,0Solution
de saccharose10 % de saccharose dans de l’eauSolution
aiguille de flacon SolutionSolution modifiée Composition de la distillée

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