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Article de méthode

Purification de cellules peu abondantes dans le système visuel de drosophile

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DOI :

10.3791/58474

⸱

26 septembre 2018

 ,  , 
1Department of Neurobiology, Harvard Medical School

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole de dissociation cellulaire pour isoler efficacement les cellules présentes en faible abondance dans le système visuel de drosophile par cellule à fluorescence activé triant (FACS).

Résumé

Des améliorations récentes dans la sensibilité du séquençage de la génération suivante ont facilité l’application de la transcriptomique et analyses génomiques à un petit nombre de cellules. Utilisant cette technologie pour étudier le développement dans le système visuel de drosophile, qui dispose d’une multitude d’outils génétiques de la cellule spécifique au type, offre une approche puissante pour aborder les bases moléculaires du développement avec résolution cellulaire précise. Une telle approche faisable, il est crucial d’avoir la capacité de façon sérieuse et efficace purifier les cellules présentes en faible abondance dans le cerveau. Nous présentons ici une méthode qui permet une purification efficace de clones de cellules du même dans les expériences de mosaïque génétique. Avec ce protocole, nous toujours atteindre un haut rendement cellulaire après que purification par fluorescence activé la cellule triant (FACS) (~ 25 % de toutes les cellules marquées) et a effectué avec succès analyse transcriptomique sur les clones de cellules unique générés par le biais analyse de mosaïque avec un marqueur de cellules répressible (MARCM). Ce protocole est idéal pour l’application de transcriptomique et analyses génomiques de types spécifiques de cellules dans le système visuel, à travers différents stades de développement et dans le contexte des différentes manipulations génétiques.

Introduction

Le système visuel de la drosophile est un modèle exceptionnel pour l’étude de la base génétique du développement et de comportement. Elle comprend une architecture cellulaire stéréotypés1 et un kit d’outils génétique avancée pour la manipulation de cellules spécifiques types2,3. Des grandes forces de ce système sont la possibilité d’interroger autonome fonction des gènes dans les cellules d’intérêt avec une résolution de cellule unique, à l’aide de méthodes de mosaïque génétique4,5. Nous avons voulu combiner ces outils génétiques avec les progrès récents dans le séquençage de génération suivant pour effectuer la transcriptomique spécifiques à un type de cellule et des analyses génomiques à cellule unique clones dans des expériences génétiques mosaïque.

Pour ce faire, il est essentiel de développer une méthode robuste et efficace pour isoler sélectivement les populations de faible cellulaire abondante dans le cerveau. Auparavant, nous avons développé un protocole pour isoler les types spécifiques de cellules dans le système visuel au cours du développement de nymphe par FACS et déterminer leurs transcriptions utilisant RNA-seq6. Dans ces expériences, la grande majorité des cellules d’un type particulier (par exemple les photorécepteurs R7) était fluorescent étiquetée. En utilisant cette méthode, dans des expériences génétiques mosaïque, où seul un sous-ensemble de cellules du même type sont étiquetés, nous n’avons pas isoler suffisamment de cellules pour obtenir les données de séquençage de qualité. Pour y remédier, nous avons cherché à augmenter le rendement cellulaire en améliorant le protocole de dissociation cellulaire.

Notre approche consistait à diminuer la longueur totale du Protocole visant à maximiser la santé des cellules dissociées, améliorer la santé cellulaire en altérant la dissection et la dissociation des tampons et réduire la quantité de rupture mécanique des tissus disséqués. Nous avons testé le protocole amélioré de7 par analyse de mosaïque avec une cellule répressible marqueur5 (MARCM), qui permet la génération du single fluorescent étiqueté clones de types de cellule en particulier, qui sont de type sauvage ou mutant pour un gène d’intérêt dans un dans le cas contraire hétérozygote volée. Lorsque, dans des conditions identiques, notre protocole antérieure n’a pas pu générer suffisamment de matière pour RNA-seq, le protocole amélioré a été réussi. Reproductible, nous atteindre un haut rendement cellulaire (~ 25 % de cellules marquées) et obtenir des données de RNA-seq haute qualité d’aussi peu que 1 000 cellules,7.

Un certain nombre de protocoles ont été décrits précédemment pour isoler les types de cellules particulières dans drosophile6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. ces protocoles sont principalement destinés à isoler les cellules qui sont abondants dans le cerveau. Notre protocole est optimisé pour isoler les populations de cellules abondantes faible (moins de 100 cellules / cerveau) dans le système visuel à l’aide de FACS pour ultérieur transcriptomique et analyses génomiques. Avec ce protocole, nous visons à fournir un moyen d’isoler reproductible des cellules abondantes faibles du système visuel mouche de FACS et d’obtenir des données de haute qualité transcriptome de RNA-Seq.

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Protocole

1. la planification avant l’expérience

  1. Avant de commencer l’expérience, réaliser une expérience pilote à petite échelle afin de confirmer si la génétique fonctionne comme prévu d’étiqueter spécifiquement les cellules souhaitées.
    1. Premier passage, l’utilisation immunohistochimie et microscopie pour déterminer si les cellules non désirées sont étiquetés. Idéalement, les marqueurs génétiques sera spécifiques au sein de la rétine et le lobe optique (Figure 3). Seulement les lobes optiques sont utilisés pour la dissociation cellulaire et donc l’étiquetage dans le cerveau central n’est pas un problème. Dans le même temps, déterminer combien de cellules d’intérêt est étiquetés par le cerveau.
    2. Si la génétique ou les étiquettes ont la spécificité requise, effectuez une expérience pilote de FACS (Figure 4) afin de déterminer si une population pure de cellules peuvent être isolées de façon reproductible, et aussi afin d’évaluer combien de cellules d’intérêt peut être isolée de chaque cerveau. Le cas échéant, évaluer la pureté des cellules isolées par PCR quantitative pour déterminer l’enrichissement ou dé-enrichissement de gènes spécifiques.
  2. Déterminer le nombre de croix nécessaires pour obtenir la quantité désirée de matériel pour l’expérience.
    NOTE : Basé sur l’expérience expérimentale, environ 17 à 25 % des cellules fluorescent étiquetés est toujours isolés avec ce protocole, et sont de qualité RNA-sequencing tirées d’aussi peu que 1 000 cellules FACS purifié (moins de cellules peuvent être suffisantes).
    1. Pour obtenir 1 000 cellules pour les analyses de RNA-seq, veiller à ce qu’il y a au moins 40 cellules d’intérêt fluorescent étiquetés par le cerveau (20 cellules / lobe optique). Autour de ~ 10 cellules d’intérêt doivent être purifiés par le cerveau, donc disséquer 100 cerveaux.
    2. Pour obtenir ~ 100 mouches au bon stade de développement de disséquer pour chaque expérience, utiliser des croisements de ~ 100 si vous sélectionnez contre équilibreurs (cela varie selon les génotypes des parents). Si les mouches sont homozygotes pour les allèles/transgènes d’intérêt que moins de croisements peuvent être définies.
    3. Limiter la fenêtre de la dissection à 1 h pour optimiser la santé cellulaire et minimiser les changements non spécifique de l’expression génique et l’organisation du génome qui peut se produire après les cerveaux est disséqués, mais cela peut être réglé. Déterminer le nombre de dissecteurs pour disséquer 100 cerveaux en 1 h, qui dépend de l’habileté de le dissecteurs.

2. voler de travail

Remarque : Les mouches sont déclenchés à 25 ° C avec une humidité d’environ 50 %, sauf indication contraire. Ci-dessous le génotype des femelles est indiqué comme génotype F et celle des mâles comme génotype M.

  1. Stocks en expansion
    1. Obtenir 100 ~ flacons de jeunes mouches (pas plus qu’une semaine avec le génotype F) et ~ 30 flacons de génotype M.
    2. Le jeudi de la semaine 1, mettez 100 flacons de génotype F sur des aliments frais. À partir de vendredi, retourner les flacons chaque jour au mardi de la semaine 2. Ces 6 flips servira à recueillir les vierges. Aussi le mercredi de la semaine 2, flip mouches de génotype M sur des aliments frais et vider les parents le vendredi de la semaine 2. Ces flacons servira à recueillir les mâles pour les croisements.
  2. Collecte des vierges
    1. Du lundi de la semaine 3, recueillir vierges des flacons de génotype F. Récupérer 2 - 3 fois par jour et stocker les vierges à 18 ° C avec une humidité d’environ 50 %. Répétez cette opération chaque jour au mardi de la semaine 4. Il est fortement recommandé de recueillir des vierges autant que possible, puisque beaucoup d'entre eux meurent avant que les croix soient définies. En général, ~ 2 500 vierges doivent être recueillis pour définir 100 traverse.
  3. Mise en croix
    1. Le vendredi de la semaine 4, définissez le nombre désiré de croisements (typiquement 100 – 200 croisements par expérience) avec 15 vierges du génotype F et 7 mâles de génotype M pour chaque croix. Il est très important d’utiliser les hommes jeunes et en bonne santés avec des ailes intactes.
    2. Retourner la Croix tous les jours du dimanche au samedi de la semaine 5. Compléter les croisements avec vierges fraîches ou les hommes si on trouve des mouches mortes. Il est essentiel pour éviter que les aliments ne se dessèchent pas, donc les flacons d’eau au besoin. Nourriture sèche diminuera considérablement le rendement.
  4. Contrôle négatif pour le tri des FACS
    1. Inclure un contrôle négatif sans les cellules désirés être étiqueté comme pour le tri des FACS. Idéalement, le témoin négatif devrait avoir le reporter (p. ex. SAMU-GFP) mais pas le conducteur (p. ex. GAL4), afin que l’expression basale du reporter (SAMU-constructions peuvent être « perméables ») peut être déterminée à définir les processus de blocage pour le tri des FACS. Retourner les mouches pour le contrôle négatif en même temps avec les mouches expérimentales et leur stade de la même manière.
  5. Nymphes de la mise en scène
    1. À prélever des cellules à un stade précis de leur pupe développement (par exemple 40 h après formation puparium [h CSA]), étapes les pupes dans une fenêtre de temps de 1 h pour correspondre avec la période de 1 h allouée pour les dissections (discutées ci-dessus). FACS doit être effectué directement après dissociation cellulaire, qui survient après les dissections et il faut compter environ 40 min. Ainsi, l’heure exacte de la mise en scène et les dissections est déterminée par la disponibilité de FACS.
    2. Pour obtenir des nymphes à 40 h CSA, concert le lundi de la semaine 6 à un moment précis (p. ex., 17:00) à disséquer les pupes 40 h plus tard (par exemple, 09:00 le mercredi). Utilisez un pinceau humide doucement prendre des pupes avant blancs et placez-les sur le mur en flacons préchauffés. Prendre les pupes avec le génotype désiré.
  6. Réplicats biologiques
    1. Faire au moins 3 réplicats biologiques pour chaque expérience. Comme une façon simple, répéter l’expérience trois fois dans la même semaine (semaine 6) à l’aide de la même Croix. Par exemple, stade pupe pour les deuxième et troisième réplicats mardi et mercredi, respectivement. Disséquer ces nymphes jeudi et vendredi, respectivement.

3. préparation des échantillons

Remarque : Tous les réactifs utilisés dans le présent protocole sont répertoriés dans la Table des matières.

  1. Préparer des solutions pour les dissections et dissociation tissulaire
    1. Préparer la solution mélange enzyme protéolytique (voir Table des matières) en reconstituant l’enzyme lyophilisée avec FD2O à une concentration de 26 unités de Wünsch (Wu) / mL. Pour un flacon contenant 260 Wu (grand flacon), ajouter 10 mL de ddH2O dans le flacon et faire usage unique aliquotes (4,2 µL sont tenus par dissociation). Solution stock de la boutique à-20 ° C. Chaque expérience exige la dissociation des deux échantillons (contrôle négatif et tissu expérimental).
    2. Préparer 10 x Solution (RS de Rinaldini) et médias (CSM de Schneider complet) la veille de la dissection (lundi de la semaine 6). Préparer des 5 mL du CSM pour chaque dissecteur et environ 5 mL 1 x RS et 5 mL de CSM pour la dissociation de 2 échantillons (contrôle négatif et expérimentale). Stocker la RS 10 x à 4 ° C pendant jusqu'à un mois et CSM à 4 ° C pendant une semaine.
      1. Pour la préparation de 100 mL de 10 x RS, dissoudre 8 g de NaCl, 200 mg de KCl, 50 mg de NaH2PO4, 1 g de NaHCO3 et 1 g de glucose dans 100 mL de ddH2O dans un bécher de 250 mL. Stériliser de filtration avec un filtre de 0,22 mm.
      2. Ajouter 20 mg de L-glutathion à 1 mL de ddH2O dans un microtube.
      3. Pour la préparation de 50 mL de CSM, ajouter 5 mL de chaleur inactivé de sérum bovin, 0,1 mL de solution d’insuline de 10 mg/mL, 5 mL de 200 mM solution de L-Glutamine, 12,5 μL de 20 mg/mL L-glutathion et 1 mL de solution de pénicilline-streptomycine (5 000 unités de pénicilline et de 5 mg de streptomycine / mL) à 38,9 mL de médias de Schneider. Stériliser de filtration avec un filtre de 0,22 mm.
      4. Diluer 10 x RS avec FD2O pour faire 1 x solution de travail RS. Préparer 500 μL de 1 x RS dans non-adhésifs microtubes pour chaque échantillon.
    3. Tourner sur un bain d’eau et régler la température à 37 ° C. Assurez-vous que la température est précise à l’aide d’un thermomètre. L’eau du bain doit être à la bonne température avant l’activation de la papaïne. Il est recommandé de régler la température de la veille une dissection du matin au soir.
  2. Préparer la papaïne et enzyme protéolytique mélanger
    Remarque : Assurez-vous de solution de papaïne frais avant chaque dissociation.
    1. Mardi de semaine 6 environ 45 min avant de commencer les dissections, récupérer 1 flacon de poudre de papaïne de 4 ° C et laisser incuber à température ambiante. Également mis de côté CSM dans un tube Eppendorf à température ambiante pour ajouter plus tard à la poudre de la papaïne.
    2. min avant le début des dissections utiliser une seringue pour ajouter la CSM de la température ambiante dans le flacon de la papaïne (directement par le biais de la PAC) afin que la concentration est de 100 unités/mL (la quantité de poudre dans chaque flacon est un peu différente ; pour un flacon contenant 123 unités ajouter 1,23 m L du CSM). Pour mélanger, tout d’abord inverser le flacon pour capturer n’importe quel poudre coincé à l’intérieur de la PAC et puis pipetez haut et en bas.
    3. Ajouter la fiole dans un bécher contenant de l’eau 37 ° C dans un bain-marie. Assurez-vous que le flacon de solution de papaïne n’est pas flottant. Activer la papaïne pendant 30 min à 37 ° C.
    4. Après avoir ajouté la papaïne dans un bécher dans un bain-marie, récupérer une partie aliquote de mélange d’enzymes protéolytiques (26 Wu/mL) de-20 ° C, puis il incuber à température ambiante. Après 30 min d’activation, incuber la papaïne à température ambiante.
  3. Dissections
    1. Le mardi de la semaine 6, disséquer les cerveaux pupes mise en scène de CSM froid avec une pince propre et couper les lobes optiques en pinçant à la jonction de la lobe optique et le cerveau central.
    2. Ajouter les lobes au fond d’un microtube contenant 500 μL de 1 x RS (un microtube pour le tissu expérimental) et l’autre pour le tissu témoin négatif. Gardez toujours les tubes sur la glace.
    3. Disséquer les lobes autant que possible en 1 h. Pour le tissu témoin négatif, 10 lobes suffisent. Piscine disséqué des lobes optiques dans un microtube unique pour éliminer la perte de tissu pendant le transfert entre les microtubes.
  4. Dissociation cellulaire
    1. Retirer délicatement la RS 1 x du microtube avec des lobes optiques découpées à l’aide d’une pipette de P200, laissant assez pour couvrir les lobes. Ajouter avec précaution 500 μL de 1 x RS sur le côté du tube, afin de perturber le moins possible de cerveau. Gardez toujours le tube sur la glace.
    2. Laissez les lobes se déposent au fond. Juste une fois, prendre 200 μL et Pipeter à mélanger (lobes doivent déplacer). Laissez les lobes s’installer à nouveau.
    3. Pour deux échantillons (contrôle expérimental et négatif), Aliquoter 600 μL de papaïne activée température ambiante dans un microtube. Ajouter 4,2 μL de mélange de température de la pièce une enzyme protéolytique dans 600 μL papaïne solution pour obtenir une concentration finale de 0,18 Wu/mL. La composition de pipetage de haut en bas. Il s’agit de la solution de dissociation.
    4. Retirez délicatement la RS 1 x de chaque échantillon et ajouter 300 μl de solution de dissociation pour les lobes. Incuber les échantillons à 25 ° C, 1 000 tr/min pendant 15 min dans un microtube thermomixer.
    5. Aux 5 et 10 min points dans le temps, arrêter le thermomixer et laisser les lobes coulent au fond du microtube. Prendre jusqu'à 200 μL de solution et pipette à mélanger.
    6. Après 15 min, laissez les lobes se déposent au fond et retirez soigneusement la solution de dissociation des lobes (essayez de ne pas déranger les lobes).
    7. Laver deux fois avec 1 x RS. Pour ce faire, ajouter avec précaution 500 μL 1 x RS (essayez de ne pas déranger les lobes). Mélange, délicatement pipette jusqu'à 200 μL et puis pipette dans le microtube. Laissez les lobes se déposent au fond et répétez.
    8. Laver chaque échantillon deux fois avec 500 μL de CSM (le même que l’étape précédente).
    9. Retirer le CSM soigneusement et ajouter un autre 200 μL de CSM dans le tube. À l’aide d’une pipette de P200, perturber le tissu en pipettant également de monter et descendre sans formation de mousse, jusqu'à ce que la solution est homogène (c'est-à-dire, ne pas voir des restes de tissu).
    10. La suspension de cellules à travers un bouchon-filtre 30 μm de filtre dans un tube de 5 mL FACS sur glace (utilisez un P200 et assurez-vous que la suspension de toute traverse). Ajouter un autre 500 μL de CSM pour rincer le microtube de dissociation et filtrer la solution dans le tube de FACS.
    11. Soigneusement, enlever le capuchon du tube FACS, recueillir la solution sous le filtre à tamis avec un P200 et ajoutez-la au reste de la suspension dans le tube de FACS. Les échantillons sont prêts pour les FACS.
    12. Soyez sûr d’avoir des microtubes pour prélever des cellules de FACS purifiée prête à l’avance. Pour RNA-seq, trier les cellules de chaque échantillon directement dans des microtubes contenant 300 μL de tampon de RLT (tampon de lyse) de la trousse de purification du RNA (ajouter au 1/100 2–mercaptoéthanol avant utilisation).
  5. Tri des FACS
    Remarque : Après dissociation, immédiatement trier les cellules par FACS (1 h maxi). Veillez aux sessions de FACS livre en conséquence lors de la planification pour l’expérience. Un trieur de cellules avec 100 μm Taille de buse est généralement utilisé.
    1. Comparer la distribution des cellules dans le contrôle négatif et l’échantillon expérimental de mettre en place le processus de blocage pour le tri. Idéalement, mettre en place le blocage dans l’expérience pilote de FACS, et l’échantillon témoin négatif donnera confirmation ou un réglage fin de la sélection préétablis. Les cellules d’intérêt doivent être bien séparés par les cellules de fond qui sont présents dans le contrôle négatif et l’échantillon expérimental (Figure 4) (tester cela dans les expériences pilotes).
    2. Recueillir les cellules triées dans les tubes de prélèvement préparés.
  6. Purification de RNA
    1. Après le tri des cellules directement dans 300 μL de tampon de RLT, pipette up et down pour lyser les cellules.
    2. Purifier les RNA suivant le protocole standard de Purification de l’ARN Total des animaux et des cellules humaines en utilisant la purification sur colonne ADN digestion7kit (voir Table des matières). Éluer l’ARN dans 20 μL d’eau exempte de RNase.
    3. Congeler les échantillons d’ARN avec l’azote liquide et conserver à-80 ° C.
    4. Pour chaque expérience effectuer au moins 3 répétitions pour le contrôle et les conditions expérimentales. Préparer les banques d’ADNc pour tous les échantillons en même temps et exécuter tous les exemples sur la même cellule de flux de contrôle technique de la variabilité. Une fois que tous les échantillons d’ARN sont préparés, utiliser un aspirateur de vitesse pour réduire le volume de 2 à 5 μL (chaque échantillon).

4. préparation des banques d’ADNc et séquençage par Smart-seq2

Remarque : Afin de réduire la variabilité technique, faire toutes les banques d’ADNc en même temps et leur séquence sur la même cellule de flux.

  1. Une entrée de 1,5 μL d’ARN concentré permet de faire des banques d’ADNc en suivant le protocole standard pour Smart-seq217 sauf pour les modifications suivantes : utilisation d’un maître de PCR haute fidélité différent mix (voir Table des matières) pour l’ACP amplification ; utiliser une purification de PCR sur colonne nécessaire (voir la Table des matières) au lieu de billes magnétiques pour purifier les produits PCR.
  2. Le protocole de puce-seq2 inclut une étape de pré amplification PCR après transcription inverse ainsi qu’une étape PCR enrichissement final après tagmentation. Le nombre de cycles dans l’amplification PCR dépend de l’abondance du matériel d’entrée. Avec 1 000 cellules en entrée, en général utiliser 15 cycles dans l’étape de pré amplification PCR et 12 pour l’étape PCR enrichissement final.
  3. Mettre en commun les bibliothèques et leur séquence sur une cellule de flux unique (par exemple, la plate-forme de NextSeq).

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Résultats

Régime général
Un régime général du protocole est illustré à la Figure 1. Le protocole est divisé en trois grandes parties : voler de travail, préparation de l’échantillon, le séquençage et l’analyse des données. La session « La planification avant l’expérience » du protocole n’est pas incluse dans le régime général pour plus de simplicité.

Chronologie
Un cale...

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Discussion

Ce protocole est simple et pas techniquement difficiles à exécuter, mais il y a plusieurs importantes mesures que si négligé volonté entraîner une réduction considérable de rendement cellulaire. (Étape 2.3.2.) Il est crucial que les croisements sont en bonne santés, et que la nourriture se dessécher. Un arrosage régulier des croisements est essentiel pour maximiser le nombre de mouches disponibles pour la dissection du génotype de la raison et au bon stade de développement. Combien de fois besoin de croisements à arroser...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

Cette recherche a été financée par le NINDS de la National Institutes of Health, sous attribution numéro K01NS094545, andgrants du Centre pour l’étude des maladies neurodégénératives Lefler. Nous reconnaissons Tan chaulage et Jason McEwan pour les conversations précieuses.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Liberase TMRoche5401127001Mélange d’enzymes protéolytiques
NaClSigma-AldrichS3014
KClSigma-AldrichP9541
NaH2PO4Sigma-AldrichS9638
NaHCO3Sigma-Aldrich  ; S5761
GlucoseSigma-AldrichG0350500
L-GlutathionSigma-AldrichG6013
Sérum bovin inactivé par la chaleurSigma-AldrichF4135
Solutiond’insuline Sigma-AldrichI0516
L-GlutamineSigma-AldrichG7513
Pénicilline-Streptomycine SolutionSigma-AldrichP4458
Milieu de culture SchneiderGibco21720024
PapainWorthingtonLK003178
2-Mercaptoéthanol  ;Sigma-AldrichM6250-100ML
RNeasy Micro KitQiagen74004Kit de purification d’ARN
DNase sans RNaseQiagen79254
SuperScript II Reverse TranscriptaseLife Technologies18064-014
dNTP MixLife TechnologiesR0191
MgCl2SolutionSigma-AldrichM1028-10X1ML
Solution de bétaïneSigma-AldrichB0300-1VL
RNaseOUTLife Technologies10777-019
Q5 High-Fidelity 2x Master MixNew England BiolabsM0492S
MinElute Kit de purification PCRQiagen28004
Nextera XT DNA Library Prepration KitIlluminaFC-131-1024
Nextera XT Kit d’indexIlluminaFC-131-1001
Tube à essai avec crépine cellulaire Snap CapFalcon352235
Bottle-Top Vacuum Filter SystemsCorningCLS431153
ThermoMixer F1.5Eppendorf5384000020
FACSAria Cytomètre en fluxBD Biosciences656700
Système de séquençage HiSeq 2500IlluminaSY&ndash ; 401&ndash ; Référence 2501

Références

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Réimpressions et autorisations

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