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Article de méthode

Analyse de l’Expression génique des cellules endothéliales exposées au Stress à l’aide de plusieurs chambres à plaques parallèles flux de cisaillement

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DOI :

10.3791/58478

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21 octobre 2018

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1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Keenan Research Centre in the Li Ka Shing Knowledge Institute, St. Michael's Hospital, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Department of Medicine, University of Toronto

Dans cet article

Résumé

Ici, un "workflow" pour la culture et la gène analyse de l’expression des cellules endothéliales sous la contrainte de cisaillement fluide est présenté. Inclus est un arrangement physique pour simultanément du logement et la surveillance des chambres de flux multiples dans un environnement contrôlé et l’utilisation d’un ARN exogène référence pour PCR quantitative.

Résumé

Nous décrivons un flux de travail pour l’analyse de l’expression des gènes des cellules endothéliales sous réserve d’un flux laminaire régulier à l’aide de plusieurs chambres à flux surveillés de plaques parallèles. Les cellules endothéliales forment la paroi cellulaire interne des vaisseaux sanguins et sont exposés de façon chronique à la force de frottement de la circulation sanguine appelée contrainte de cisaillement. Dans des conditions physiologiques, la fonction de cellules endothéliales en présence de diverses conditions de contrainte de cisaillement. Ainsi, l’application des conditions de la contrainte de cisaillement dans des modèles in vitro peut fournir une meilleure compréhension de réponses endothéliales in vivo. La chambre à plaques parallèles flow précédemment publiée par Lane et al. 9 est adapté pour étudier la régulation génique endothéliale en présence et en absence de stable à flux laminaire (non pulsatile). Principales adaptations dans la mise en place pour un écoulement laminaire tel que présenté ici incluent un grand environnement dédié aux circuits de flux simultanés de maison, la surveillance des débits en temps réel et l’inclusion d’une référence exogène RNA pour la normalisation de données quantitatives de PCR en temps réel. Afin d’évaluer plusieurs traitements/conditions de l’application de la contrainte de cisaillement, plusieurs circuits de circulation et les pompes sont utilisées simultanément dans le même incubateur chauffé et humidifié. Le débit de chaque circuit d’écoulement est mesuré en continu en temps réel pour normaliser les conditions de la contrainte de cisaillement au cours des expériences. Parce que ces expériences ont plusieurs conditions, nous utilisons également un ARN exogène de référence qui est dopé au moment de l’extraction de l’ARN pour la normalisation de l’extraction de l’ARN et l’efficacité de la synthèse de cDNA de premier-brin. Ces mesures réduire la variabilité entre les échantillons. Cette stratégie est employée dans notre pipeline pour l’analyse de l’expression génique avec des expériences de la contrainte de cisaillement à l’aide de la chambre à plaques parallèles flow, mais certaines parties de cette stratégie, tels que l’exogène référencent RNA spike-dans, peuvent facilement et économiquement être utilisés pour autres applications.

Introduction

Les cellules endothéliales vasculaires forment la paroi cellulaire interne des vaisseaux sanguins dans le système cardiovasculaire fermé des espèces supérieures. Ils forment l’interface entre le sang et les tissus et sont caractérisés par luminale et abluminal surfaces. L’endothélium est un système diversifié et actif adaptatif qui régule la circulation sanguine, traite des éléments nutritifs, l’immunité et la croissance du sang neuf navires1. Dans le corps, les cellules endothéliales présentent normalement dans un environnement où ils sont exposés à la force de frottement de la circulation, la contrainte de cisaillement2. Contrainte de cisaillement est un régulateur important de cellules endothéliales gene expression3, et les cellules endothéliales essaient de conserver la contrainte de cisaillement dans une plage donnée2,4. Les cellules endothéliales démontrent angiogénique patterning en l’absence de contrainte de cisaillement5 qui peuvent améliorer la perfusion tissulaire. Les modèles régionaux de flux perturbé et altéré la contrainte de cisaillement sont associées à l’expression des gènes inflammatoires6 et le développement de l’athérosclérose7,8. Ainsi, les modèles qui incluent la contrainte de cisaillement sont une composante majeure de la compréhension de la régulation génique endothéliale.

Nous décrivons une méthode pour étudier la régulation des gènes dans les cellules endothéliales vasculaires sous la contrainte de cisaillement. Ce système utilise des flux non pulsatile et imite fluide des contraintes de cisaillement et de la concentration d’oxygène cela État de modèle pour les cellules endothéliales artérielles. Ce protocole comprend les détails des méthodes pour la précipitation de gène à l’aide de l’interférence ARN (ARNi), la mise en place pour l’application de la contrainte de cisaillement à l’aide de l’appareil à plaques parallèles flux et méthodes pour la pointe d’une référence exogène RNA avant l’analyse par réaction en chaîne polymérase quantitative de transcriptase inverse (RT-qPCR). Cet oléoduc est utilisé pour l’étude de la régulation génique dans les cellules endothéliales en présence et en absence de contraintes de cisaillement laminaires et comprend une adaptation de l’appareil à plaques parallèles flux décrit par Lane et al. 9. cette configuration particulière a été conçue pour faciliter l’évaluation simultanée de multiples conditions expérimentales qui permet une comparaison directe des conditions de la contrainte de cisaillement, ainsi que la normalisation de l’analyse de la RNA. Une grande unité chauffée avec humidité contrôlée est utilisée pour permettre à plusieurs chambres de flux séparé et pompes s’exécute simultanément avec des débits surveillés pour chaque ensemble de chambre de flux en temps réel. L’application de cette mise en place est utilisée pour la précipitation de gène à l’aide d’Arni dans le cadre du flux laminaire/cisaillement, mais aspects du présent protocole peuvent être appliquées à toute évaluation de l’expression des RNA.

Des approches communes pour l’application de la contrainte de cisaillement pour les cellules endothéliales incluent de systèmes microfluidiques10un viscosimètre cône et plaque11et un flux de plaques parallèles chambre12. Les systèmes microfluidiques provenant de divers fabricants ont été utiles dans l’étude mécanobiologie et mécanotransduction dans plusieurs cellules et types de tissus et une variété de stimuli biophysiques. Pour les cellules endothéliales, ils ont été utilisés pour étudier les cellules endothéliales en isolement, ainsi que l’interaction des cellules endothéliales et le trafic d’immunitaire ou tumeur de cellules10. Toutefois, ces systèmes sont moins appropriés pour la récupération d’un grand nombre de cellules9. Le viscosimètre cône-et-plaque et chambres à plaques parallèles débit permettent la récupération d’un grand nombre de cellules en monocouches confluentes12. Ces systèmes peuvent générer une chaîne de cisaillement forces et tendances12. L’écoulement de plaques parallèles chambre Assemblée9 a l’avantage de cette imagerie en temps réel peuvent être effectuées par le biais de la fenêtre de verre afin d’évaluer la morphologie cellulaire à tout moment. En outre, le perfusat peut être recueilli dans des conditions stériles. Pour le système présenté ici, le flux peut être également surveillée en temps réel et dans une structure multichambre, qui facilite le maintien des conditions de cisaillement entre les chambres.

Pour des expériences représentatives, cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC), qui représentent un type de cellules endothéliales macrovasculaires, sont utilisés, et les conditions de contrainte de cisaillement que nous utilisons (1 Pa) reflètent des conditions artérielles (0,1 - 0,7 Pa). Toutefois, ce protocole peut être utilisé avec d’autres types de cellules endothéliales et les conditions de contrainte de cisaillement peuvent être ajustées selon la question expérimentale. Par exemple, l’évaluation des cellules endothéliales humaines dans des conditions qui modélisent la circulation veineuse nécessiterait des niveaux inférieurs de la contrainte de cisaillement (1-6 Pa) et des études qui modélisent la circulation microvasculaire ont utilisé des niveaux de contrainte de cisaillement de 0,4 - 1,2 Pa13 , 14. en outre, la contrainte de cisaillement peut varier même entre les cellules endothéliales dans les vaisseaux sanguins idem6. Dans la configuration actuelle, on utilise un système de surveillance unique qui peut surveiller simultanément les quatre boucles de flux séparé. Pour les laboratoires qui ont besoin de plusieurs boucles de flux, il y a l’espace dans l’environnement dédié pour un système de surveillance supplémentaire.

RT-qPCR est utilisé pour la quantification absolue d’expression des gènes dans le cadre de la contrainte de cisaillement. L’expression relative des gènes de cible est souvent utilisée pour comparer l’expression RNA dans l’ensemble des conditions. Certaines espèces d’ARN peut exister à très faibles quantités ou être absent, ce qui complique les mesures relatives. Par exemple, ARN long non codantes dans les cellules endothéliales peut exercer des effets puissants au nombre relativement faibles copies par cellule5. En outre, des différences dans l’efficacité de l’apprêt peuvent conduire à une interprétation erronée d’utiliser la méthode delta-delta de seuil (Ct) cycle pour analyser les données. Pour apaiser cette inquiétude, nous effectuons une quantification absolue en générant une courbe d’étalonnage à l’aide d’une quantité connue d’ADN plasmidique. En outre, synthèse de l’ADN (cDNA) complémentaire est un processus inefficace, et différences dans l’efficacité de l’ADNc peuvent tenir compte des différences dans l’expression de RNA entre conditions et entre échantillons15. L’application de la contrainte de cisaillement et/ou réactifs de transfection peut influer sur la viabilité, la prolifération cellulaire et l’apoptose, ou ajouter des composants qui peuvent interférer avec la synthèse de l’ARN l’isolation et/ou l’ADNc. Pour tenir compte de la possibilité de partialité de l’isolement et la synthèse de cDNA, nous utilisons un épi RNA contrôle synthétisés dans le laboratoire, a ajouté au moment de l’extraction de l’ARN et mesuré avec chaque cDNA synthèse via RT-qPCR. Cela permet non seulement de l’ajustement technique des différences dans la synthèse de l’ARN extraction et ARNC, mais permet aussi le calcul des quantités absolues par cellule, lorsque le nombre d’éléments est connu.

Ce système utilise des étapes supplémentaires pour maintenir la similitude ou de tenir compte des différences techniques entre les conditions. Nous insistons particulièrement sur ces étapes en raison de la nature complexe de ces expériences, qui impliquent de multiples configurations physiques et des conditions expérimentales qui peuvent conduire à la variabilité expérimentale.

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Protocole

1. préparation d’ARN de référence exogène

Remarque : Choisissez une référence exogène d’ARN qui n’existe pas en l’espèce ou le modèle concerné. Pour les systèmes mammaliens, luciférase firefly RNA peut-être être utilisé.

  1. Linéarisation de plasmide exogène ARN de référence
    1. Préparer exogène référence RNA au moins 48 h avant l’extraction de l’ARN prévue. Obtenir ou fabriquer un clone cDNA de la référence choisie exogène RNA, comme un clone de cDNA de luciférase firefly dans un vecteur plasmidique approprié pour la transcription in vitro (voir Table des matières).
    2. Effectuer la digestion d’enzymes de restriction (RE) de 1 µg de plasmide pleine longueur (le plasmide de luciférase firefly est pSP-luc + qui a 4100 bp) à l’aide de coupes-single RE (XhoI) dans des microtubes 1,5 mL. Choisissez un RE qui est une seule fraise (coupe plasmide seulement 1 x) à l’extrémité 3' de la référence exogène séquence d’ARN qui laisse un surplomb 5' ou l’extrémité émoussée. Pour une préparation typique, effectuer sept réactions de linéarisation de plasmide (étapes 1.1.4 - 1.1.7) en parallèle pour générer suffisamment de concentration d’ARN et de quantité pour compléter un ensemble d’expériences ou d’un projet.
      1. Mesurer la concentration de plasmide spectrophotométrie ou spectrofluorométrie.
      2. Préparer un mélange RE dans chaque tube : ajouter 4 µL de XhoI (20 000 unités/mL), 8 µL de tampon, x µL de plasmide (1 µg) et suffisamment H2O à parvenir à une solution totale de 80 µL.
      3. Incuber le mélange RE pendant 2 h à 37 ° C. Utilisez le RE selon le protocole du fabricant, car toute modification peut entraîner une activité accrue étoile ou non-spécifique clivage de l’ADN cible. Chaleur inactiver le mélange réactionnel pendant 20 min à 65 ° C.
      4. Résilier le digest RE avec la précipitation d’éthanol dans chaque tube. Au mélange RE, ajouter directement 4 µL de 0,5 M EDTA pH 8.0, 8 µL d’acétate de sodium 3M pH 5,2 et 184 µL d’éthanol à 100 %. Bien mélanger et congeler le mélange à-20 ° C pendant 30 min.
      5. Tournez en bas le mélange à 4 ° C pendant 20 min à une accélération centrifuge relative (RCF) de 16 100 x g.
      6. Retirez le surnageant avec une pointe fine, sans toucher le culot. Sécher le culot pendant 5 min et il resuspendre dans 6 µL d’H2O (chauffé à 37 ° C) en pipettant également, haut et bas de 5 - 10 x.
      7. Confirmer la linéarisation du plasmide luciférase en exécutant le produit digéré sur gel d’agarose à 2 % contenant du bromure d’éthidium (EtBr) ainsi qu’une échelle de 1 Ko + échelle surenroulé et coupe et un plasmide non circonci. Inspecter le gel et de procéder à la transcription in vitro , si la voie pour le plasmide coupé montre une seule bande ~ 4 Ko (le plasmide non circonci auront trois bandes ; La figure 1).
        ATTENTION : Le bromure d’éthidium est cancérigène. Travailler sous une hotte chimique.
  2. Dans transcription in vitro du plasmide exogène ARN de référence
    1. Pour chaque tube de produits plasmide digéré, effectuer la transcription in vitro à l’aide d’une méthode de transcription in vitro (voir Table des matières). Suivez les instructions du fabricant et utiliser le phage approprié de l’ARN polymérase. Si la méthode de synthèse de cDNA requiert une queue poly (a), ou autres applications nécessitent une queue poly (a), choisissez une méthode de transcription in vitro qui comprend un ajout de queue poly (a) (voir la Table des matières).
    2. Combiner tous in vitro transcrits produits dans un seul tube en polypropylène de 1,5 mL avant purification.
  3. Purif ication d’ARN de la réaction de transcription in vitro
    1. Purifier en vitro transcrits produits avec un in vitro transcription nettoyage nécessaire (voir la Table des matières). Suivez le protocole par le fabricant.
    2. Évaluer la concentration d’ARN en mesurant l’absorbance à 260 nm par spectrophotométrie.
      Nota : Concentration d’ARN est calculée en utilisant la Loi de Beer-Lambert. Cela indique que l’absorbance des acides nucléiques (qui absorbent la lumière fortement à 260 nm) est proportionnelle à la concentration. Une absorbance de 1.0 est égale à 40 µg/mL d’ARN simple brin.
  4. Aliquotage le stock RNA en PCR tubes pour usage expérimental
    1. S’assurer que la concentration en ARN est de 1 µg/µL.
      1. Si la concentration en ARN est > 1 µg/µL, diluer le stock à 1 µg / µL. Aliquot 1 µL de PCR tubes et les stocker à-80 ° C.
      2. Si la concentration en ARN est < 1 µg/µL, précipitations supplémentaires à l’aide de 5 M d’acétate d’ammonium (fourni dans le kit) peuvent être effectuée conformément au protocole du fabricant. Si la concentration en ARN est encore < 1 µg/µL, poursuivez aliquotage 1 µL dans des tubes PCR.

2. faites glisser le revêtement

Remarque : Les étapes 2.1-2.10 doivent être effectuée 24 à 48 h avant l’ensemencement de la cellule prévue.

  1. Préchauffer le four à 250 ° C.
  2. À l’aide de gants stériles, envelopper chaque lamelle de verre 2 x papier d’aluminium. Évitez de toucher la surface de la lame directement.
  3. Faire cuire les diapositives dans le four pendant 1 h à 250 ° C et laisser les lames refroidir à température ambiante.
    Remarque : Cette étape est importante pour détruire n’importe quel contaminant endotoxine.
  4. Alors que les diapositives sont refroidissement, préparer une solution stock de fibronectine de 1 mg/mL d’eau distillée et il incuber 30 min à 37 ° C pour dissoudre. Faire des aliquotes de 100 µL. Mettre de côté les aliquotes pour une utilisation immédiate et geler les aliquotes restants pour une utilisation future.
  5. Déballer l’enveloppe extérieure de papier d’aluminium avant de mettre la lame de verre en une prévention des risques biotechnologiques du cabinet. Effectuer les opérations 2,6 à 2,7 et 2,9 dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.
  6. Placez la lame de verre dans une boîte de Petri stérile cellule de 4 puits rectangulaire.
  7. Diluer la solution mère de fibronectine au 1/100 avec de l’eau distillée. Enrober chaque diapositive avec 1 mL de la fibronectine diluée, goutte à goutte, à l’aide d’une pipette. Assurez-vous que la diapositive entière est couverte.
  8. Incuber les lames dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ° C pendant 24 à 48 heures.
  9. Après l’incubation, aspirer la fibronectine en inclinant le plat de culture cellulaire 4 puits. Évitez de toucher la diapositive directement avec l’aspirateur.

3. cellule ensemencement sur verre glisse

  1. Compter les cellules endothéliales humaines au passage précoce (passage 2-5) et des graines ~1.0 x 106 cellules sur chaque lame de verre enduit de fibronectine avec 1 mL des médias (1,0 x 106 cellules/mL de milieu). Les semences des cellules 24h avant l’application anticipée du flux laminaire si aucun autre traitement ne doit être effectuée.
    NOTE : Ces chiffres sont utilisés comme un guide pour des expériences avec 24h d’écoulement.
    1. Ajuster la densité de semis pour obtenir une monocouche confluente de cellules au moment de la récolte des cellules et l’extraction de l’ARN.
  2. Laisser les cellules adhèrent à la lame pendant 15 min à 37 ° C.
  3. Ajouter 3 mL de médias dans chaque puits de la boîte de Petri de cellule à colorer et incuber les cellules à 37 ° C pendant 24 h avec 5 % de CO2.

4. small Interfering RNA (siRNA) Transfection

  1. Préparation des cellules sur des lames de verre pour des expériences de transfection et flux de siARN
    1. Suivre le protocole dans les étapes 2 (revêtement de diapositive) et 3 (cellule ensemencement sur lames de verre) pour la préparation de lame de verre et revêtement pour les expériences de flux.
    2. Graine de cellules 24h avant le traitement de siARN (48 h avant l’application du flux laminaire).
    3. Cellules endothéliales humaines de semences dans des milieux sans antibiotique à 750 000 à 1 x 106 cellules / glissière pour atteindre le confluent de 85 à 95 % le lendemain.
      Remarque : HUVEC sont utilisés dans le présent protocole.
  2. Préparation de transfection de siARN-base de lipides complexes de réactif (par lame)
    1. Design personnalisé siRNAs ou ordre premade siRNAs pour le gène désiré d’intérêt.
      Remarque : Effectuez les opérations suivantes dans une armoire de sécurité biologique.
    2. Ajouter 6 µL de siARN (stock de 20 µM) en 414 µL de milieu de sérum réduit (voir Table des matières) et mélanger doucement en pipettant également.
    3. Diluer 49,5 µL de réactif de transfection de lipides à base agités (voir Table des matières) à 130,5 µL de milieu de sérum réduit.
    4. Mélanger doucement et laisser incuber à température ambiante pendant 5 min.
    5. Allier siRNAs dilué et réactif de transfection à base de lipides, mélanger doucement et incuber pendant 15 min à température ambiante. Mélanger doucement pour éviter une désorganisation dans les complexes de réactif de transfection à base de lipides.
      Remarque : La solution peut sembler nuageuse sous forme de complexes.
    6. Tandis que sont forment des complexes, enlevez le milieu de croissance et laver les cellules 1 x avec support de sérum réduit.
    7. Ajouter 2,4 mL de milieu de sérum réduit à chaque diapositive.
    8. Ajouter 600 µL de complexes de réactif de transfection de siARN-lipid-based agités dans chaque assiette et la plaque avant et en arrière pour mélanger de roche. S’assurer que la concentration finale de siARN est 40 nM. Veiller à ce que la diapositive soit entièrement recouverte.
    9. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 4 h.
    10. Ajouter 1 mL de milieux de culture de cellules endothéliales exempt d’antibiotiques contenant 3 x la concentration normale de sérum fœtal (SVF) sans enlever le mélange de transfection.
    11. Incuber les cellules à 37 ° C jusqu’au moment de l’utiliser.

5. calcul du débit fondé sur la contrainte de cisaillement désiré9

  1. Calculer le débit basé sur les contraintes de cisaillement désirés selon l’équation suivante :
    figure-protocol-1
    Ici,
    Q est le débit en mL/min ;
    Τ est la contrainte de cisaillement désirée en dynes/cm2 (1 Pa = 10 dynes/cm2) ;
    w est la largeur de la chambre à plaques parallèles flow en cm ;
    h est la hauteur de la chambre à plaques parallèles flow en cm ;
    µ est la viscosité des médias en cP (g/cm·s).
    Remarque : Les contraintes de cisaillement laminaires typique (non pulsatile) dans ce flux de travail s’expérimente à τ = 1 Pa (10 dynes/cm2). peut être mesurée à l’aide d’un viscosimètre comme un viscosimètre cône-et-plaque et peut varier en fonction du contenu des médias y compris le sérum et le dextran supplémentaires9 µ .
  2. Pour réaliser un spécifique τ (cisaillement), régler le débit et/ou la viscosité. À des débits plus élevés, les cellules adhérentes peuvent se dissocier de la diapositive. Débits échantillon avec chambres de flux général figurent au tableau 1.

6. mise en place d’un environnement dédié pour le système de surveillance et plusieurs chambres à plaques parallèles débit (Figure 2)

  1. Utilisez un grand unité/incubateur chauffé avec plusieurs étagères, l’accès de l’intérieur de l’électricité et portes vitrées — dénommé la plage (environnement intégré avec réglable CO2 ) et la chaleur — pour abriter plusieurs chambres à flux simultanément pour des expériences qui ont besoin de la contrainte de cisaillement et de comparaison directe entre deux ou plusieurs traitements ou extrants (p. ex., ADN, ARN et protéines).
    Remarque : La plage permet une surveillance fréquente sur le circuit de circulation, y compris la vitesse d’écoulement, sans perturbations fréquentes de l’environnement.
  2. Assurer adéquate de CO2 est disponible pour l’expérience et que le CO2 moniteur est fonctionnel. S’assurer que le bac d’eau est convenablement rempli, telle qu’il y aura l’air humidifié.

7. installation de l’appareil à plaques parallèles flux

Remarque : Pour la fabrication de plaques parallèles, consultez Lane et al. 9.

  1. Autoclave de l’écoulement chambre plaques, réservoir, amortisseur, tubes et Luers pour chaque installation de chambre flux de plaques parallèles comme il est indiqué dans le tableau 2.
  2. Mise en place de l’Assemblée de boucle de courant (Figure 3).
    1. Placer les serviettes stériles sur la sécurité biologique armoire. Monter le système de boucle de courant, tout d’abord sans la chambre à plaques parallèles flow, dans l’enceinte de sécurité biologique.
    2. Connecter le montage de tuyauterie pour le réservoir :
      1. Insérer un tube dur #14 dans un trou et deux #14 tubes souples dans les deux autres trous dans le bouchon du réservoir débit. Veiller à ce que l’un des tubes souples touche le fond du réservoir dans le tuyau d’écoulement .
      2. Placer une 1/16" Luer mâle à la fin de la dur #14 tube et fixer un filtre stérile comme un évent d’aération.
      3. Placer une 1/16" raccord Luer femelle à la fin de douce #14 afflux tube, venant du réservoir et fixer un robinet 4 voies.
        Remarque : Pour l’analyse de l’expression génique ou d’autres études où perfusats ne doivent ne pas être collectées, robinets 2 voies peuvent être utilisés au lieu de robinets à 4 voies dans le présent protocole.
      4. Placer une 1/16" Luer mâle à l’extrémité du tube #14 sortie doux, venant du réservoir.
    3. Raccordez le tuyau de sortie de réservoir au tuyau de la pompe : placer une 1/16" raccord Luer femelle à chaque extrémité d’un tube dur #13 (tubulure de pompe). Raccorder le tube d’écoulement doux #14 du réservoir au tube dur #13 en le branchant 1/16" Luers mâles et femelles ensemble.
    4. Raccordez le tuyau de la pompe avec la tuyauterie « pont amortisseur » : placer une 1/8" Luer mâle et une 1/8" raccord Luer femelle à chaque extrémité d’un tube souple #16. Connectez le 1/16" raccord Luer femelle du tube dur #13 (à la fin de la sortie de la tuyauterie de la pompe) avec le 1/8" Luer mâle du tube souple #16.
    5. Assembler le tuyau pour le seuil d’écoulement : placer une 3/16" Luer mâle à une extrémité du tuyau souple #25 et répétez cette opération pour l’autre côté de l’amortisseur de flux. Fixez les extrémités libres des tubes souples #25 de chaque côté de l’amortisseur de flux.
    6. Raccordez le tuyau de « pont amortisseur » avec la tuyauterie pour le seuil d’écoulement : raccorder un tube souple #25 depuis le seuil de débit avec le tube souple #16 du « pont amortisseur » utilisant le 1/8" femelle Luer du côté #16 « pont amortisseur » et le déjà placé 3/16" Luer mâle du côté de tube souple amortisseur #25.
    7. Assembler les tubes « pont de chambre » :
      1. Placer une 1/8" femelle Luer et une 1/8" Luer mâle à chaque extrémité d’un tube souple #16 (« pont de la chambre » tubes).
      2. Connectez le 1/8" femelle Luer du « pont de la chambre » avec les 3/16" Luer mâle du tube souple #25 de l’autre extrémité de l’amortisseur de flux.
      3. À la 1/8" Luer mâle (extrémité libre) du tube « pont de chambre », placer un robinet 4 voies.
    8. Raccordez le robinet 4 voies de l’extrémité libre du « pont de chambre » au robinet 4 voies de la tubulure souple afflux de réservoir (de l’étape 7.2.2.3). Fermez les robinets d’arrêt.
    9. Ajouter des éléments multimédias au réservoir et le seuil. Pour l’exposition de 48 h à tension de cisaillement, ajouter 35 mL de médias au réservoir et 25 mL de l’amortisseur. Réglez le volume des médias basés sur la durée de l’expérience de flux et le nombre de cellules ensemencées.
    10. Adapter le système de boucle débit assemblé à la pompe dans la plage. Placez le tube dur #13 (tubulure pompe) dans la tête de pompe et fixez-le. Ouvrir les robinets d’arrêt.
    11. Mettre en marche la pompe et augmentez lentement la vitesse de la pompe. Laisser les médias circuler à travers le système de boucle. Vérifier toute fuite ou de blocage (p. ex., montée de pression). Veiller à ce que les médias s’écoule vers le réservoir.
  3. Mise en place de l’Assemblée de chambre de flux
    1. Placer une 1/8" raccord Luer femelle à une extrémité d’un doux #16 tube et fixer un robinet 4 voies. Fixer l’extrémité libre du tube sur le côté droit de la plaque supérieure (côtéentrée ).
    2. Placer une 1/8" Luer mâle à une extrémité d’un doux #16 tube et fixer un robinet 4 voies. Fixer l’extrémité libre du tube sur le côté gauche de la plaque supérieure (côtésortie ).
    3. Placer une 1/8" Luer mâle et une 1/8" raccord Luer femelle à chaque extrémité d’un tube souple #16 (piège tube à bulles). Raccorder la tubulure au bubble trap via le 1/8" Luer mâle. Fixer un robinet 4 voies à l’autre extrémité de la tubulure via le 1/8" femelle Luer.
    4. Utilisez des pinces stériles, transfert la lame de verre cellulaire graines de la boîte de Petri de 4 puits cellule l’embrèvement sur la plaque de fond. S’assurer que les graines cellule de la lame de verre sont orientés vers le haut.
    5. À l’aide d’une seringue de 10 mL, ajouter 10 mL de médias chauds à la plaque de fond au sein de la ligne de joint rouge autour de la plaque. Laisser les médias s’écouler à travers la diapositive et couvrir les cellules. Évitez d’ajouter des médias directement sur la diapositive.
    6. Placez délicatement la plaque supérieure sur la plaque de fond, en alignant d’un côté à l’autre. Éviter l’introduction de bulles d’air. Vissez les plaques ensemble.
    7. Enlever les bulles d’air depuis le barboteur en ouvrant le robinet d’arrêt sur le côté droit (fonctionnement) de la plaque et rincer doucement 20 mL de médias tiède à l’aide d’une seringue de 30 mL. Assurez-vous que le robinet d’arrêt sur le côté gauche (sortie) de la plaque est fermé et que les médias ne circule dans le robinet de piège à bulle (ouvert). Jetez les médias congestionnés.
    8. Fermer le robinet sur le barboteur et ouvrir le robinet sur le côté gauche (sortie) de la chambre. Élever le côté gauche (sortie) de la chambre à un angle de 45°, puis rincez doucement 20 mL de médias tiède à l’aide d’une seringue de 30 mL du côté droit (fonctionnement) de la chambre pour enlever les bulles d’air de la chambre. Bulles peuvent être visualisées par le biais de la fenêtre. Jetez les médias congestionnés.
    9. Fermez les robinets d’arrêt des deux côtés de la chambre et le cap. Inspecter les cellules au microscope.
    10. Le transport de la chambre à la plage avec le système de boucle déjà assemblé.
    11. Lentement, diminuer la vitesse de la pompe et arrêter la pompe. Fermez les robinets sur le système de boucle de circulation pour éviter les fuites.
    12. Connecter la chambre et système ensemble par robinets d’arrêt de la boucle. Ouvrez tous les robinets.
    13. Lentement, augmenter la vitesse de la pompe et examiner la mise en place pour toute fuite ou de blocage. S’assurer que les médias circulant dans une seule direction et retourne au réservoir.
    14. Placez le capteur de débit sur le tube « pont de la chambre » situé sur le côté de l’entrée de la chambre. Assurez-vous que le capteur est correctement orienté dans le sens d’écoulement.
    15. Ajuster la vitesse de la pompe pour obtenir le débit calculé précédemment, fondé sur la contrainte de cisaillement désirée.
      Remarque : Le débit peut varier selon la hauteur et la largeur de chaque chambre, ainsi que la viscosité des médias.
    16. Allumez le CO2 réservoir d’atteindre 5 % de CO2 et de placer un bac d’eau à l’intérieur de la plage.

8. récolte des cellules et Extraction d’ARN à partir de la chambre de flux

  1. Une fois terminée la période souhaitée de l’écoulement, lentement, baissez la vitesse de la pompe péristaltique à 0 et mettre hors tension. Rapidement, fermer tous les robinets ouverts et supprimer la chambre et la tubulure avec un robinet d’arrêt à chaque extrémité.
  2. Prendre la chambre à une table de travail propre et légèrement dévisser toutes les vis pour enlever la plaque supérieure. Utilisez des pinces à becs, retirer la lame de verre de la plaque de fond et le placer dans un plat de vitroplants de diamètre 100 mm.
  3. Laver la lame avec 10 mL de froide solution saline tamponnée au phosphate (PBS)- / - et vérifier les cellules au microscope afin de confirmer l’adhésion cellulaire et l’alignement dans le sens d’écoulement.
  4. Aspirer les PBS de la plaque et transférer la lame dans un plat à propre de 100 mm de diamètre. Ajouter 350 µL de tampon de lyse de l’extraction de l’ARN nécessaire (voir Table des matières), contenant 1/100 de bêta-mercaptoéthanol, à la diapositive.
    ATTENTION : Ajouter bêta-mercaptoéthanol sous une hotte chimique.
  5. Grattez les cellules hors de la diapositive à l’aide d’un grattoir à lame polyéthylène cell. Incliner le plat de culture tissulaire, permettant le liquide à la piscine en bas et retirer la lame de verre avec une pince. Déposer la cellule lysate dans un tube de 1,5 mL et garder sur glace.
  6. Diluer les ARN (RNA luciférase) stock de référence exogène à 0,0025 ng/µL par dilution en série avant de l’ajouter à l’échantillon. Par exemple, si le stock est de 1 µg/µL, une dilution de 1/400 000 est nécessaire pour atteindre 0,0025 ng / µL. Ajouter 10 µL de dilué luciférase ARN pour chaque échantillon de lysat pour ARN en aval et l’analyse cellulaire.
  7. Aller de l’avant avec le protocole d’extraction d’ARN selon les instructions du fabricant, ou geler le lysat à-80 ° C jusqu'à ce qu’il en mesure de procéder à l’extraction.

9. calcul de l’efficacité de l’Extraction de l’ARN et la synthèse de cDNA

Remarque : Calculer l’efficacité de la luciférase après la RT-qPCR en comparant le rendement théorique et le rendement expérimental.

  1. Déterminer le rendement théorique de la luciférase RNA.
    1. Déterminer le montant total de copies de luciférase ajouté par échantillon. (Ajout de 0,025 ng/échantillon = 2,73 x 107 exemplaires de la luciférase RNA par échantillon avant l’extraction de l’ARN.)
    2. Calculer la masse moléculaire de la luciférase RNA en utilisant une masse moléculaire moyenne par nucléotide de 330 g/mol et en multipliant par la longueur de la luciférase firefly RNA, 1652 nucléotides.
    3. Divisez le montant de la luciférase RNA ajouté (0,025 ng) pour chaque échantillon avant l’extraction de l’ARN par la masse moléculaire pour produire la quantité molaire. Puis, que multiplier par le nombre d’Avogadro pour produire les copies ajoutés par échantillon.
    4. Calculer le rendement théorique pour les copies de la luciférase pour chaque réaction de RT-qPCR en utilisant l’équation :
      figure-protocol-2
  2. Calculer le rendement expérimental pour les copies de la luciférase pour chaque réaction de RT-qPCR en utilisant le plasmide de la luciférase pour générer une courbe d’étalonnage pour la RT-qPCR.
  3. Calculer l’efficacité de la luciférase (%) selon l’équation suivante :
    figure-protocol-3

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Résultats

Linéarisation réussie du plasmide luciférase à l’aide d’enzymes de restriction a été confirmée par les produits digérés en cours d’exécution sur un gel d’agarose (Figure 1). La taille du produit linéarisé a été confirmée à l’aide d’échelles d’ADN et par comparaison avec plasmide non circonci.

Nous nous sommes adaptés à l’installation de chambre de flux de plaques parallèles de Lane et al. <...

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Discussion

Contrainte de cisaillement est un état physiologique qui module la fonction endothéliale, en partie, en affectant l’équilibre gene expression2,5. Modèles de régulation génique dans diverses conditions de contrainte de cisaillement contribuera à une meilleure compréhension de la fonction endothéliale. Ce flux de travail pragmatique inclut un circuit d’écoulement à l’aide d’une chambre à plaques parallèles flux adaptée de Lane et al. 9

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les IRSC MOP 142307 de p.a.M. H.S.J.M. est un bénéficiaire d’un programme en Regenerative Medicine Fellowship des instituts de recherche en santé du Canada formation. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. et M.K.D. sont destinataires de la Reine Elizabeth II bourses d’études supérieures dans les sciences et la technologie.

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Matériaux

2
Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,05 % Trypsine-EDTAgibco25300-062
10 mL SeringueBD302995
10 mm2 Plat de cultureSarstedt83.3902
30 mL SeringueBD302832
robinets d’arrêt à 4 voiesDiscofixD500
Feuille d’aluminium
BEACHDarwin Chambers CompanyMN : HO85, SN : Racleurs
MN : P120, SN : 0342
Capteur 2BioSphenix, Ltd.MN : C700, SN : 52852
Eau distilléegibco15230-170
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) -/-gibco14190-144
Milieu de croissance des cellules endothéliales 2Promo CellC-22011
Milieu de croissance des cellules endothéliales 2 Supplement MixPromo CellC-39216
Fibronectine (pure)Filtre11051407001
(0,20 um)Sarstedt83.1826.001
Amortisseur de débit et capuchonU of T atelier
Débitmètre : Série 400 ConsoleTransonic Scisense Inc.T402
: Tube de la série 400Transonic Scisense Inc.TS410
Réservoir d’écoulement et capuchonU of T atelier de soufflage de
Capteur de débitTransonic Scisense Inc.ME4PXL
Isotemp 737F FourFisher ScientificFI-737F
J tissuJ tissu
Lame de microscope (25 x 75 x 1 mm)Fisherfinest12-544-4
Sachet de stérilisation en papierCardinal Health92713
Pompe (Masterflex L/S Economy Drive)Cole-Parmer7554-90
Tête de pompe (Masterflex L/S Easy Load)Cole-Parmer7518-00
Rectangulaire 4 puits ThermoScientific267061
pince à épiler
NameCompanyNuméro de catalogueComments
>Tubing
Masterflex C-Flex L/S 25 Tube soupleCole-Parmer06424-25
Tube souple Masterflex C-Flex L/S 14Cole-Parmer06424-14
Tube souple Masterflex C-Flex L/S 16Cole-Parmer06424-16
Masterflex PharMed BPT L/S 13 Tube durCole-Parmer06508-13
Masterflex PharMed BPT L/S 14 Tube DurCole-Parmer06508-14
NomCompanyNuméro de catalogue>Comments
Luer
3/16" Male LuerCole-Parmer45518-08Pour tube #25
1/8 » Mâle LuerCole-Parmer30800-24Pour tube #16
1/8 » Femelle LuerCole-Parmer30800-08Pour tube #
16 1/16 » Mâle LuerCole-Parmer45518-00Pour tube #14
1/16 » Femelle LuerCole-Parmer45508-00Pour tube #14
NomEntrepriseNuméro de catalogue>Comments
Knockdown reagents
Oligofectamine ReagentInvitrogen12252-011
Opti-MEM I Sérum réduit Mediumgibco31985-070
Name< strong>EntrepriseNuméro de catalogueComments
In vitro transcription
Generuler 1kb+ Échelle d’ADNThermo ScientificSM1331
MEGAclear KitAmbionAM1908
mMESSSEGE mMACHINE SP6 Kit de transcriptionAmbionAM1340
pSP-luc+PromegaE4471
Échelle d’ADN super-enrouléeNew England BioLabs Inc.N0472S
UltraPure AgaroseInvitrogen16500-500
UltraPure Bromure d’éthidiumInvitrogen15585011
XhoI Enzyme de restrictionNew England BioLabs Inc.R0146S
NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
Extraction d’ARN
Beta-mercaptoethanolSigmaM3148-100mL
RNeasy Mini KitQiagen74104
à cellules 4947549 CO Meter BioSphenix, Ltd.Sigma-Aldrichde soufflage de verreDébitmètre verre

Références

  1. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).
  2. Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
  3. Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).
  4. Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).
  5. Man, H. S. J., et al. Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).
  6. Won, D., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).
  7. Baeyens, N., et al. Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point. eLIFE. 4, 04645(2015).
  8. Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
  9. Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), 3349(2012).
  10. Gray, K. M., Stroka, K. M. Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models. Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).
  11. Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).
  12. Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).
  13. Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
  14. DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs). Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20(2017).
  15. Thormar, H. G., et al. Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis. Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).
  16. Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription. Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).
  17. Vaughan-Shaw, P. G., et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).
  18. Collins, C., et al. Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells. Nature Communications. 5, 3984(2014).
  19. Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).
  20. Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR. Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).
  21. Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Chambre d coulement plaques parall lescoulement laminaireARN de r f rence exog neExtraction d ARNPCR quantitative en temps r elSuivi du d bitAdh sion cellulaire
Analyse de l’Expression génique des cellules endothéliales exposées au Stress à l’aide de plusieurs chambres à plaques parallèles flux de cisaillement
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