Analyse de l’Expression génique des cellules endothéliales exposées au Stress à l’aide de plusieurs chambres à plaques parallèles flux de cisaillement

Summary

Ici, un "workflow" pour la culture et la gène analyse de l’expression des cellules endothéliales sous la contrainte de cisaillement fluide est présenté. Inclus est un arrangement physique pour simultanément du logement et la surveillance des chambres de flux multiples dans un environnement contrôlé et l’utilisation d’un ARN exogène référence pour PCR quantitative.

Abstract

Nous décrivons un flux de travail pour l’analyse de l’expression des gènes des cellules endothéliales sous réserve d’un flux laminaire régulier à l’aide de plusieurs chambres à flux surveillés de plaques parallèles. Les cellules endothéliales forment la paroi cellulaire interne des vaisseaux sanguins et sont exposés de façon chronique à la force de frottement de la circulation sanguine appelée contrainte de cisaillement. Dans des conditions physiologiques, la fonction de cellules endothéliales en présence de diverses conditions de contrainte de cisaillement. Ainsi, l’application des conditions de la contrainte de cisaillement dans des modèles in vitro peut fournir une meilleure compréhension de réponses endothéliales in vivo. La chambre à plaques parallèles flow précédemment publiée par Lane et al. ⁹ est adapté pour étudier la régulation génique endothéliale en présence et en absence de stable à flux laminaire (non pulsatile). Principales adaptations dans la mise en place pour un écoulement laminaire tel que présenté ici incluent un grand environnement dédié aux circuits de flux simultanés de maison, la surveillance des débits en temps réel et l’inclusion d’une référence exogène RNA pour la normalisation de données quantitatives de PCR en temps réel. Afin d’évaluer plusieurs traitements/conditions de l’application de la contrainte de cisaillement, plusieurs circuits de circulation et les pompes sont utilisées simultanément dans le même incubateur chauffé et humidifié. Le débit de chaque circuit d’écoulement est mesuré en continu en temps réel pour normaliser les conditions de la contrainte de cisaillement au cours des expériences. Parce que ces expériences ont plusieurs conditions, nous utilisons également un ARN exogène de référence qui est dopé au moment de l’extraction de l’ARN pour la normalisation de l’extraction de l’ARN et l’efficacité de la synthèse de cDNA de premier-brin. Ces mesures réduire la variabilité entre les échantillons. Cette stratégie est employée dans notre pipeline pour l’analyse de l’expression génique avec des expériences de la contrainte de cisaillement à l’aide de la chambre à plaques parallèles flow, mais certaines parties de cette stratégie, tels que l’exogène référencent RNA spike-dans, peuvent facilement et économiquement être utilisés pour autres applications.

Introduction

Les cellules endothéliales vasculaires forment la paroi cellulaire interne des vaisseaux sanguins dans le système cardiovasculaire fermé des espèces supérieures. Ils forment l’interface entre le sang et les tissus et sont caractérisés par luminale et abluminal surfaces. L’endothélium est un système diversifié et actif adaptatif qui régule la circulation sanguine, traite des éléments nutritifs, l’immunité et la croissance du sang neuf navires¹. Dans le corps, les cellules endothéliales présentent normalement dans un environnement où ils sont exposés à la force de frottement de la circulation, la contrainte de cisaillement²

Protocol

1. préparation d’ARN de référence exogène

Remarque : Choisissez une référence exogène d’ARN qui n’existe pas en l’espèce ou le modèle concerné. Pour les systèmes mammaliens, luciférase firefly RNA peut-être être utilisé.

1. Linéarisation de plasmide exogène ARN de référence
   1. Préparer exogène référence RNA au moins 48 h avant l’extraction de l’ARN prévue. Obtenir ou fabriquer un clone cDNA de la référence choisie exogène RNA, comme un clone de cDNA de luciférase firefly dans un vecteur plasmidique approprié pour la transcription in vitro (voir Table des matières).
   2. Effectu....

Results

Linéarisation réussie du plasmide luciférase à l’aide d’enzymes de restriction a été confirmée par les produits digérés en cours d’exécution sur un gel d’agarose (Figure 1). La taille du produit linéarisé a été confirmée à l’aide d’échelles d’ADN et par comparaison avec plasmide non circonci.

Nous nous sommes adaptés à l’installation de chambre de flux de plaques parallèles de Lane et al. <.......

Discussion

Contrainte de cisaillement est un état physiologique qui module la fonction endothéliale, en partie, en affectant l’équilibre gene expression^2,5. Modèles de régulation génique dans diverses conditions de contrainte de cisaillement contribuera à une meilleure compréhension de la fonction endothéliale. Ce flux de travail pragmatique inclut un circuit d’écoulement à l’aide d’une chambre à plaques parallèles flux adaptée de Lane et al. ⁹

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,05 % Trypsine-EDTA	gibco	25300-062
10 mL Seringue	BD	302995
10 mm2 Plat de culture	Sarstedt	83.3902
30 mL Seringue	BD	302832
robinets d’arrêt à 4 voies	Discofix	D500
Feuille d’aluminium
BEACH	Darwin Chambers Company	MN : HO85, SN : Racleurs
		MN : P120, SN : 0342
Capteur 2	BioSphenix, Ltd.	MN : C700, SN : 52852
Eau distillée	gibco	15230-170
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) -/-	gibco	14190-144
Milieu de croissance des cellules endothéliales 2	Promo Cell	C-22011
Milieu de croissance des cellules endothéliales 2 Supplement Mix	Promo Cell	C-39216
Fibronectine (pure)	Filtre	11051407001
(0,20 um)	Sarstedt	83.1826.001
Amortisseur de débit et capuchon	U of T atelier
Débitmètre : Série 400 Console	Transonic Scisense Inc.	T402
: Tube de la série 400	Transonic Scisense Inc.	TS410
Réservoir d’écoulement et capuchon	U of T atelier de soufflage de
Capteur de débit	Transonic Scisense Inc.	ME4PXL
Isotemp 737F Four	Fisher Scientific	FI-737F
J tissu	J tissu
Lame de microscope (25 x 75 x 1 mm)	Fisherfinest	12-544-4
Sachet de stérilisation en papier	Cardinal Health	92713
Pompe (Masterflex L/S Economy Drive)	Cole-Parmer	7554-90
Tête de pompe (Masterflex L/S Easy Load)	Cole-Parmer	7518-00
Rectangulaire 4 puits Thermo	Scientific	267061
pince à épiler
Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
>Tubing
Masterflex C-Flex L/S 25 Tube souple	Cole-Parmer	06424-25
Tube souple Masterflex C-Flex L/S 14	Cole-Parmer	06424-14
Tube souple Masterflex C-Flex L/S 16	Cole-Parmer	06424-16
Masterflex PharMed BPT L/S 13 Tube dur	Cole-Parmer	06508-13
Masterflex PharMed BPT L/S 14 Tube Dur	Cole-Parmer	06508-14
Nom	Company	Numéro de catalogue	>Comments
Luer
3/16" Male Luer	Cole-Parmer	45518-08	Pour tube #25
1/8 » Mâle Luer	Cole-Parmer	30800-24	Pour tube #16
1/8 » Femelle Luer	Cole-Parmer	30800-08	Pour tube #
16 1/16 » Mâle Luer	Cole-Parmer	45518-00	Pour tube #14
1/16 » Femelle Luer	Cole-Parmer	45508-00	Pour tube #14
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	>Comments
Knockdown reagents
Oligofectamine Reagent	Invitrogen	12252-011
Opti-MEM I Sérum réduit Medium	gibco	31985-070
Name	< strong>Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
In vitro transcription
Generuler 1kb+ Échelle d’ADN	Thermo Scientific	SM1331
MEGAclear Kit	Ambion	AM1908
mMESSSEGE mMACHINE SP6 Kit de transcription	Ambion	AM1340
pSP-luc+	Promega	E4471
Échelle d’ADN super-enroulée	New England BioLabs Inc.	N0472S
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500
UltraPure Bromure d’éthidium	Invitrogen	15585011
XhoI Enzyme de restriction	New England BioLabs Inc.	R0146S
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
Extraction d’ARN
Beta-mercaptoethanol	Sigma	M3148-100mL
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104