Article de méthode

Visualisation en temps réel et l’analyse des chondrocytes blessures résultant d’un chargement mécanique des explants de Cartilage Murine Intact

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DOI :

10.3791/58487

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7 janvier 2019

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester

Dans cet article

Résumé

Nous présentons une méthode pour évaluer l’étendue spatiale de blessure/mort cellulaire sur la surface articulaire des articulations murines intactes après l’application de contraintes mécaniques contrôlées ou les impacts. Cette méthode peut être utilisée pour déterminer comment l’arthrose, les facteurs génétiques et/ou chargement différents schémas thérapeutiques affectent la vulnérabilité des chondrocytes de in situ .

Résumé

Homéostasie du cartilage articulaire dépend de la viabilité des cellules résidentes (chondrocytes). Malheureusement, traumatisme mécanique peut induire la mort de chondrocytes généralisée, pouvant déboucher sur une dégradation irréversible de l’articulation et l’apparition de l’arthrose. En outre, maintien de la viabilité de chondrocyte est important dans les procédures de greffe ostéo pour des résultats optimaux de chirurgie. Nous présentons une méthode pour évaluer l’étendue spatiale de blessure/mort cellulaire sur la surface articulaire des articulations synoviales murines intactes après l’application de contraintes mécaniques contrôlées ou les impacts. Cette méthode peut être utilisée dans des études comparatives pour étudier les effets d’une charge mécanique différents schémas thérapeutiques, différentes conditions environnementales ou des manipulations génétiques, ainsi que les différentes étapes de la dégénérescence du cartilage à court et/ou à long terme vulnérabilité des chondrocytes articulaires in situs. L’objectif du protocole introduit dans le manuscrit est d’évaluer l’étendue spatiale de blessure/mort cellulaire sur la surface articulaire des articulations synoviales murines. Ce qui est important, cette méthode permet l’essai sur le cartilage intact sans compromettre les conditions aux limites natives. En outre, il permet une visualisation en temps réel des chondrocytes articulaires vitale tachées et seule analyse axée sur l’image de lésion cellulaire induite par l’application de statique contrôlé et chargement des schémas d’impact. Nos résultats représentatifs démontrent que des explants de cartilage sain, l’étendue spatiale des lésions des cellules dépend sensiblement intensité ampleur et l’impact de charge. Notre méthode peut être facilement adapté pour étudier les effets d’une charge mécanique différents schémas thérapeutiques, différentes conditions environnementales ou des manipulations génétiques différentes sur la vulnérabilité de la mécanique des in situ des chondrocytes articulaires.

Introduction

Le cartilage articulaire (AC) est une tissu qui recouvre et protège les os dans des articulations synoviales, fournissant une articulation commune lisse de charge. L’homéostasie tissulaire est tributaire de la viabilité des chondrocytes, le type de cellule unique demeurant à AC. Cependant, exposition du cartilage aux forces extrêmes due à un traumatisme (p. ex., chutes, blessures attribuables aux accidents ou sports véhicules) ou en raison de l’instabilité post-traumatique conjointe peut induire des chondrocytes mort, conduisant à une dégradation irréversible de l’articulation (arthrose) 1. en outre, en autogreffe greffe des procédures qui visent à réparer les défauts les de cartilage endommagé, greffe associée à insertion mécanique un traumatisme réduit la viabilité des chondrocytes et a des effets préjudiciables sur les résultats chirurgicaux2.

Cartilage explant modèles sont couramment utilisés pour étudier la susceptibilité des chondrocytes articulaires à la mort cellulaire induite par mécaniquement. Ces modèles utilisent généralement des explants de grands animaux pour étudier les effets du chargement des conditions, des conditions environnementales et autres facteurs sur cellule vulnérabilité3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Toutefois, en raison de la grande taille des articulations indigènes, ces modèles exigent généralement la suppression d’une fiche de la surface articulaire d’une articulation intacte, ainsi compromettre native des conditions aux limites. En outre, ils exigent généralement demande d’importantes charges mécaniques pour induire des lésions des cellules. Alternativement, cartilage murine explant modèles offrent plusieurs avantages par rapport à des modèles animaux plus gros dans l’étude de la vulnérabilité mécanique des chondrocytes de in situ . En particulier, en raison de leurs dimensions réduites, ces modèles facilitent les tests du cartilage articulaire intact sans altérer l’intégrité des tissus natifs. En outre, chargement du cartilage murin se produit sur de petites surfaces de contact tels que chondrocyte mort ou blessure peut être induite avec petites charges (< 1 N). Enfin, le génome de la souris est facilement manipulé, permettant aux essais d’impact de gènes spécifiques comment la susceptibilité des in situ les chondrocytes à une lésion mécanique.

L’objectif global de la méthode introduite dans ce manuscrit est de quantifier et de visualiser-dans-temps réel-l’étendue spatiale de in situ cellule décès et de blessures en raison des charges mécaniques appliquées sur souris entièrement intacte du cartilage-sur-OS des explants in vitro. Cette méthode nécessite une dissection minutieuse des articulations synoviales souris sans compromettre la viabilité des chondrocytes, suivie d’essais mécaniques des explants vitale colorées en utilisant un dispositif monté sur microscope semblable à une plate-forme de test que nous avons récemment développé pour quantifier le cartilage murine propriétés mécaniques16. Au cours des essais mécaniques, une grande partie de la surface articulaire (intacte) de l’OS disséqué est visible sur une micrographie de fluorescence unique, permettant une analyse rapide de la viabilité cellulaire après qu’une charge est appliquée. Une analyse similaire de la viabilité des cellules de surface des explants de cartilage murine a effectué précédemment, mais sans application simultanée d’une charge de17. Les applications potentielles de notre méthode comprennent des études comparatives pour étudier la vulnérabilité des chondrocytes articulaires à différentes conditions environnementales et mécaniques contrôlées, ainsi que la projection de traitements visant à réduire la sensibilité des chondrocytes à une charge mécanique.

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Protocole

Tous les travaux d’animaux a été approuvé par le Comité de University of Rochester sur les ressources animales.

1. les solutions

  1. Préparer la Solution saline équilibrée de Hank (1 X HBSS) contenant du calcium, magnésium et sans rouge de phénol. Ajuster le pH à 7,4 en ajoutant de petites quantités de HCl ou NaOH.
  2. Ajuster l’osmolarité à 303 mOsm en ajoutant l’eau déionisée ou NaCl. Utiliser le tampon pendant la dissection, préparation des échantillons et les essais mécaniques.

2. les dissections du fémur Distal et humérus Proximal avec Cartilage articulaire Intact

  1. Euthanasier la souris selon les directives institutionnelles en utilisant une chambre d’inhalation de2 CO suivie par dislocation cervicale. Suivre une technique aseptique dans l’ensemble.
    Remarque : Les souris entre 8 et 81 semaines de toute souche et sexe puisse être utilisée.
  2. Utilisez les outils chirurgicaux suivants pour les dissections : micro-ciseaux (utilisé pour faire des incisions), ciseaux de dissection standard (utilisé pour couper l’OS), scalpel avec #11 lame de bistouri Swann-Morton (utilisé pour couper des tissus mous), pince de bijoutier (utilisés pour l’élimination du soft les tissus) et pince standard (utilisé pour le gommage de la peau et des tissus mous).
  3. Pour les dissections du fémur distal , suivez les instructions ci-dessous.
    1. Positionnez la souris en position couchée.
    2. Faire une incision minuscule (environ 5 mm) dans la peau sur la partie antérieure du genou.
    3. Prolonger l’incision tout autour du genou et tirer la peau pour exposer les muscles du genou articulation et de la jambe vers l’arrière.
    4. À partir de l’extrémité proximale du fémur, utilisez une lame de bistouri Swann-Morton (#11) pour couper le long de la direction distale. Positionner la lame entre l’unité de muscle-tendon du quadriceps et la face antérieure de la tige fémorale. Étendre la coupe vers et au-delà de la patella et terminer par une coupe par le milieu du tendon rotulien, supprimant ainsi l’unité de muscle-tendon du quadriceps.
    5. À partir de l’extrémité proximale du fémur, utilisez une lame de bistouri Swann-Morton (#11) pour couper le long de la direction distale. Positionner la lame entre l’unité de tendon-muscle ischio-jambiers et le côté postérieur de la tige fémorale. Une fois la coupe s’approche de l’articulation du genou, commencer à couper à travers les tissus mous, en évitant tout contact entre le bistouri et la surface articulaire sur les condyles distales du fémur. Terminer la coupe au-delà de l’articulation du genou.
    6. Tirer sur les quadriceps et les muscles ischio-jambiers pour exposer le fémur. Coupez tout muscle en excès sur les faces latérales et médiales du fémur.
    7. Couper le muscle du mollet sur le côté postérieur du tibia proximal puis faites basculer la jambe pour visualiser la partie postérieure du fémur.
    8. Exposer les condyles distales du fémur et de la surface postérieure du tibia proximal en enlevant l’excès de tissu autour de l’articulation du genou.
    9. Couper les ligaments croisés antérieurs et postérieurs à l’aide d’un scalpel, coupant loin les condyles fémoraux. Tirer sur le tibia de fémur et couper tous les ligaments pour séparer du fémur de la jambe.
    10. À l’aide de ciseaux de dissection standard, traversent le fémur à l’extrémité proximale de l’OS (8 mm au-dessus de l’articulation tibio-fémorale) du côté latéral . Après avoir coupé l’os, essuyez toute moelle visible à l’extérieur de l’OS pour éviter la contamination possible des cellules de la moelle osseuse.
      Remarque : Coupe du côté latéral réduit le risque de propagation de la fissure le long de l’os.
    11. Enlever entourant les tissus mous (c'est-à-dire, des ligaments et muscles excès) du fémur à l’aide de la pince de bijoutier et exposer le cartilage sur les deux condyles à l’extrémité distale du fémur. Éviter tout contact entre le cartilage et les forceps.
  4. Pour les dissections de l’humérus , suivez les instructions ci-dessous.
    1. Positionnez la souris en position couchée.
    2. Faire une incision (~ 5 mm) dans la peau sur le côté postérieur du coude à l’aide de micro-ciseaux, prolonger l’incision autour du coude et tirer la peau pour exposer les muscles du bras et épaules vers l’arrière.
    3. À partir de l’extrémité proximale de l’humérus, utilisez une lame de bistouri Swann-Morton (#11) pour couper le long de la direction distale. Positionner la lame entre l’unité de muscle-tendon du triceps et le côté postérieur de l’humérus. Étendre la coupe vers l’extrémité distale de l’humérus et terminer en sectionnant le tendon du triceps.
    4. Puis tirez le triceps vers l’extrémité proximale de l’humérus jusqu'à ce que la tête humérale est exposée.
    5. Couper le tissu conjonctif autour de la tête humérale à l’aide d’une lame de bistouri Swann-Morton (#11) sans toucher la surface articulaire et retirez la branche (bras et épaules) du corps. Périodiquement hydrate la surface articulaire de la tête humérale avec HBSS.
    6. Débranchez l’humérus du bras de la première rupture de l’extrémité proximale du cubitus sur le côté postérieur du bras à l’aide de pinces et puis couper le tissu conjonctif autour de l’extrémité distale de l’humérus. Enlever tout excès de tissu sur l’humérus.
    7. Couper la tubérosité deltoïde sur le côté postérieur de l’humérus à l’aide de ciseaux de dissection standard.
  5. Placer le spécimen (s) découpé dans un tube de microtubes de 1,5 mL contenant un tampon HBSS.

3. live (Calcéine AM) / morts (iodure de Propidium) protocole de coloration

  1. Tache à l’aide de calcéine AM comme suit.
    1. Préparer une solution stock de calcéine AM en ajoutant 12,5 µL du diméthylsulfoxyde (DMSO) dans un flacon de 50 µg de calcéine AM, ce qui entraîne une concentration stock de 4 mg/mL (4,02 mM).
    2. Diluer le stock calcéine solution 1 : 400 à HBSS pour atteindre une concentration de 10 µg/mL (10,05 µM) de calcium AM (par exemple, ajouter 1,25 ml de solution mère à 500 µL de HBSS).
    3. Centrifuger la solution colorante diluée pendant 5 s à 2 000 x g pour s’assurer que tout le colorant, qui peut parfois s’en tenir aux parois du tube, se mélange avec le tampon. Ne pas enlever le surnageant. Vortex la solution pour assurer un bon mélange.
    4. Mettre l’échantillon découpé dans un tube de microtubes de 1,5 mL contenant 500 µL de la solution de coloration. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 30 min dans un thermomixer tout en agitant à 800 tr/min. Assurez-vous que les tubes sont couverts en papier d’aluminium pour protéger contre l’exposition à la lumière.
    5. Transférer le spécimen dans tampon HBSS AM libres de calcéine. À ce stade, l’échantillon est prêt pour les essais mécaniques.
  2. Préparer l’iodure de propidium (PI) solution de coloration comme suit.
    1. Préparer la solution de coloration en diluant la solution-mère achetés (1 mg/mL, 1,5 mM) 01:25 dans HBSS pour atteindre 40 µg/mL (60 µM) de PI PI. Par exemple, ajouter 40 µL de solution mère à 1000 µL de HBSS.
    2. Garder la PI coloration solution couverte de papier d’aluminium pour le protéger contre l’exposition à la lumière. Utiliser la solution colorante immédiatement après l’essai mécanique pour détecter les cellules endommagées (voir section 4).
      Remarque : On peut effectuer la coloration PI avant le chargement, ainsi qu’à évaluer plus rigoureusement la qualité de la dissection.

4. mécanique protocole d’essai

  1. Placer l’éprouvette (fémur ou humérus) sur la lame de verre d’un personnalisé microscope monté test appareil mécanique telle que la surface articulaire sur les condyles fémoraux postérieurs ou de la tête humérale est assis sur le verre (Figure 1).
    NOTE : Fixer un applicateur en bois de 10 mm de long (diamètre = 2 mm) à la partie distale de l' humérus à l’aide de colle cyanoacrylate avant de le placer sur l’appareil afin de stabiliser l’échantillon sur la surface plane. Pour une description détaillée de la plate-forme d’essai mécanique voir dossier supplémentaire de 1: 1 de l’article.
  2. Hydrater le spécimen avec HBSS et placez l’appareil avec l’échantillon sur un microscope à fluorescence.
  3. Image les chondrocytes articulaires tachés de calcéine AM (longueurs d’onde d’excitation/émission = 495/515 nm) avant l’application (de base) de la charge sous un microscope à fluorescence avec un 4 X sec lentille (NA = 0,13). Ajustez les réglages d’acquisition afin d’optimiser la qualité d’image.
  4. Appliquer le chargement mécanique sur le dessus de l’échantillon telle que le cartilage articulaire est comprimé contre la lamelle couvre-objet.
    1. Pour le chargement statique, appliquer une charge statique prescrite (par exemple, 0,5 N) sur le dessus de l’éprouvette (fémur ou humérus). Maintenir la charge pendant 5 min et puis l’enlever.
    2. Pour l' impact, appliquez une énergie d’impact réglementaire (par exemple, 1 mJ) sur l’échantillon en laissant tomber un impacteur cylindrique de poids connu (p. ex., 0,1 N) d’une hauteur réglementaire (par exemple, 1 cm). Libérer la charge 5 s après l’impact.
      Remarque : Le poids de l’élément de frappe (mg) et la hauteur prescrite (h) peut être converti en énergie d’impact (E) à l’aide de l’équation suivante : E = mgh.
  5. Incuber le spécimen en PI coloration solution pendant 5 min à température ambiante.
  6. Image les chondrocytes articulaires tachés de calcéine AM et PI (longueurs d’onde d’excitation/émission = 535/617 nm) sous un microscope de fluorescence (Figure 2).

5. analyse

  1. Quantifier la zone des cellules de blessés/morts en raison de la régime de charge mécanique appliquée.
    1. Ouvrez les micrographies de la surface articulaire acquit avant et après application d’une charge mécanique dans ImageJ18.
    2. Combiner les images dans une pile.
    3. Définissez l’échelle des images basé sur la résolution de l’image.
    4. Utilisez l’outil polygone pour définir la zone où les cellules deviennent calcéine négatif (perte de fluorescence verte) et PI positif (gain de fluorescence rouge). Ces cellules sont considérées comme blessés ou morts.
    5. Déterminer la surface des cellules de blessés/morts à l’aide de l’outil de mesure .

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Résultats

Six différents appliqués des protocoles de chargement (chargement statique : 0,1 N, 0,5 N et 1 N pour 5 min ; et le chargement de l’impact : 1 mJ, mJ 2 et 4 mJ) façon reproductible induites par des zones localisées quantifiables des lésions des cellules du cartilage fémorale et humérale, obtenu à partir de 8-10-week-old (de souris BALB/c La figure 2). Ce qui est important, l’étendue spatiale de chondrocytes dommage sur la surface articulaire a été mesuré rapi...

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Discussion

Les méthodes décrites ci-dessus ont été utilisés avec succès pour visualiser viable blessés/morts et in situ des chondrocytes articulaires de joints de souris après prescrit des charges mécaniques ou les impacts. En particulier, nous avons été en mesure d’analyser la vulnérabilité mécanique des chondrocytes dans le cartilage articulaire intact de deux différentes articulations synoviales : l’articulation du genou (fémur distal) et l’épaule (humérus). Nos résultats représentatifs montrent que l’étendue spatiale d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs aimeraient remercier Dr. Richard Waugh et Luis Delgadillo pour l’utilisation généreuse de leur pH-metre et l’osmomètre. En outre, les auteurs voudrais remercier Andrea Lee d’avoir contribué à l’élaboration initiale du système de test mécanique. Cette étude a été financée par les NIH P30 AR069655.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Calcein, AM  ;Invitrogen de Thermo Fisher ScientificC3100MP20x50mg , Eugene, OR, États-Unis
Iodure de propidiumInvitrogen de Thermo Fisher ScientificP35661 mg/mL solution dans l’eau, 10 mL, Eugene, OR, États-Unis
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Sigma-Aldrich2768551L de DMSO, anhydre, &ge ; 99,9 %, St. Louis, Missouri, États-Unis
HBSS (calcium, magnésium, sans rouge de phénol)Gibco by Thermo Fisher Scientific14025-0921X, 500mL, Grand Island, NY, USA
Lame chirurgicale Feather (#11)VWR102097-822Hatfield, PA, USA
Osmomètre de pression de vapeur, VAPROELITechGroupModel 5520Puteaux, France
pH mètre  ;Beckman Modèle Phi 32  ;Brea, Californie, États-Unis
Thermomixeur Eppendorf  ;Eppendorf AG  ;Modèle 5350Hambourg, Allemagne
Microscope de recherche inversé motoriséOlypmusModèle IX-81Center Valley, PA, USA
Applicateur en boisPuritan Medical Products Company, LLC8076"x100, Guilford, ME, USA
1.5 Lamelles en verreWarner Instruments, LLC64-1696#1.5, 0.17mm d’épaisseur, 40mm de diamètre, Hamden, CT, USA

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